Name: 마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 마우스 장간막 정맥에서 생체 내 현미경을 이용한 백혈구-내피 세포 및 혈소판-백혈구 상호작용 분석 방법을. 이 기법은 염증 과정에서 세포 간 동역학을 실시간으로 관찰하여 면역학 연구에 활용됩니다.

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모든 동물 실험은 독일의 동물 보호 법률 (TierSchG)을 준수 하였다. FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) 및 국가 동물 복지 몸 GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html)에 의해 정의 된 마우스는 보관과 좋은 동물 관행에 따라 처리되었다. 프라이 부르크 대학의 동물 복지위원회뿐만 아니라 지방 자치 단체 (Regierungspräsidium 프라이 부르크)는 모든 동물 실험을 승인했다. 1. 동물 취급, 준비 및 염증의 유도 <ol><li> 16-20g의 무게 범위 6 주령의 수컷 마우스 - 4를 사용합니다. 참고 : 마우스는 이전 또는 무거운 경우가 현미경 관찰을 제한, 선박을 둘러싼 과도한 지방을 제시한다. </li><li> 수술에 앞서 모든 도구와 현미경 테이블을 소독. </li><li> 주사 20 ㎎ / ㎏ LPS (리포 폴리 사카 라이드) 복강 4 세균 inflamm을 유도하는 생활 마우스로는 현미경하기 전에 시간ATION. </li><li> 플라스틱 챔버 및 장간막 조직 가습 37 ℃에서 수조에서 0.9 % 식염수 Prewarm. </li><li> 바로 현미경 절차 전에 복강 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. 대안 마취는, 예를 들면, 2 % 이소 플루 란 흡입을 사용할 수있다. 반사 자극 (회사의 압력과 발가락 또는 꼬리 핀치)에 응답의 손실에 의한 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 면도기를 사용하여 복부를 털을 뽑다 에탄올 70 %로 포화 거즈로 느슨하게 머리를 제거합니다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 적용합니다. </li></ol> 2. 수술 <ol><li> 70 % 에탄올을 사용하여 복부 멸균. 이 방법은 멸균 방법 아니며 실험의 마지막에 치명적일 수있다. </li><li> 중간 개복술을 수행 작은 곡선 집게와 작은 가위를 사용하여 복부 피부를 엽니 다. 에피을 확인gastrical 용기는 용기를 보호하기 위해, 원격 교육 알바의 영역에서 복막을 열고. </li><li> 습윤 티슈 유지 복강 데워진 식염수 몇 방울을 적용한다. </li><li> 형광 50 μL의 로다 민 6G 9, 10 전에 설명 된 바와 같이 역 궤도 (1 ㎎ / ㎖)을 주입하여 라벨 백혈구 및 혈소판. </li><li> 10cm의 직경을 갖는 페트리 디쉬에 ileumand 장소 그것의 외면 화하다 루프 및 37 ° C를 도포하여 습윤 티슈 유지 확인은 식염수 (0.9 %), 다른 모든 순간 데워진. </li></ol> 3. 생체 내에 현미경 <ol><li> 현미경 아래에 마우스를 위치시키고 (200)의 직경과 장간막 정맥을 가지고 - 뷰의 중심에서 300 μm의. 눈에 보이는 지방 환경과 용기를 선택합니다. </li><li> 하여 내피 세포의 자극을 피 장간막 혈관을 만지지 마십시오. 조심스럽게 회장 루프를 처리합니다. </li><li> 혈액 세포 내피 상호 작용을 시각화반전 또는 직립 현미경 및 현미경 소프트웨어를 사용하여 카메라. 녹음 혈액 마우스 당 4 개의 정맥에 1 분 동안 세포 내피 세포의 상호 작용. </li><li> 촬상 실험 종료 후 경추 탈구하여 마우스를 안락사. </li></ol> 4. 분석 <ol><li> 분석 오프라인을 수행하고 모든 매개 변수에 대한 눈을 멀게. 임의의 적합한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석을 수행. </li><li> 관내 피 세포의 흐름에 집중 높은 시간 해상도 씨네 클립에서 안정하고 interindividually 필적 혈류 상태 (최대 프레임 율)을 확인한다. </li><li> 롤링 백혈구의 수를 정량화. 그 때문에 정맥을 통해 수직선을 그리고 1 분에이 선을 넘어 모든 백혈구를 계산합니다. </li><li> 하나의 백혈구가 안정적으로 내피 세포에 롤링 동안 50 ㎛의 거리를 통과하는 데 필요한 시간을 측정하여 회전 속도를 결정합니다. 이 작업을 수행하려면, 50 μm의 t의 거리에 두 개의 수직 라인을 그릴정맥 hrough. <ol><li> 대표적인 백혈구 필요한 시간 (μm의 / s)으로 50 μm의 분할함으로써 other.Calculate 한 행에서 백혈구의 속도를 얻기 위해 필요한 시간을 측정한다. </li></ol></li><li> 0.04 mm (2)의 필드에 백혈구 부착을 측정한다. 이를 위해, 정맥에 200 ㎛, 변의 길이와 사각형을 그린다. <ol><li> 이 광장 내에서 30 초 동안 눈에 보이는 운동으로 정의 된 회사 부착 백혈구, 계산합니다. </li></ol></li><li> 혈소판, 백혈구 작용을 정량화하는 하나의 백혈구 결합 혈소판의 개수를 카운트. </li></ol>

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</ol>

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여기에서 우리는 준비 및 생체 내에서 쥐의 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 성능을 설명합니다. 이 방법은 우리에게 살아있는 유기체에 직접 백혈구가 내피 세포와 혈소판 내피 세포의 상호 작용 (11)을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다. 내피 세포를 염증 초기 반응으로 활성화됩니다 압연, 접착력과 윤회 (12)의 결과 백혈구 및 혈소판과 상호 작용한다. 그러나 백혈구는 혈소판이 소위 형성하는 상호 작용, 혈소판, 백혈구 단지, 주로 혈소판 - 호중구 단지 (PNCs) 및 혈소판 - 단핵구 단지 (PMCS) 13, 14 .These 상호 작용이 관찰이 방법으로 정량화 할 수있다. 또한이 기술은 (혈소판 / 백혈구 작용 후의 예) VCAM-1, ICAM-1과 같은 마커 내피의 활성화 (15)을 조사 허용한다. <...

이 프로토콜의 목적은 염증 조건에서 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 직접적인 관찰을 위해 쥐를 거주 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 간략화 된 기법을 설명하기위한 것이다. 생체 내에 현미경은 염증 백혈구 모집 및 기능을 이해하는 사소한하지만 중요하지 않은 염증성 질환 1, 2에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜에서 우리가 설명하는 방법은 이전에 발행 된 출판물을 기반으로 개발되었다. 발표 된 내용에 성장 혈전 3 병렬로 혈소판 통합을 시각화 유사 이전 4 표면화 장간막 정맥은 투과광 현미경으로 검사한다. 이러한 쥐 5 마우스의 간 및 쥐 (6)의 cremaster 근육으로 내 생명 현미경의 다양한 모델이 있습니다. 장간막 정맥의 생체 내에 현미경이 개발되고 여러 그룹에 의해 이전의 연구에 적용되어왔다. - / - 누구의 혈소판 세로토닌 약리학 장기 고갈 된 쥐에 연구 결과 비 신경 세로토닌의 결핍과 비교 마우스, 우리는 야생형 마우스 및 트립토판의 hydroxylase1 (Tph1) 사이의 백혈구 모집의 차이를 관찰하기 위해이 기술을 사용했다 애플리케이션 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 인 플루옥세틴 ​​7. 우리는 또한 급성 플루옥세틴 ​​치료 (8) 후 백혈구 - 내피 상호 작용을 조사 하였다. 이 모델은 신속하게 수행하고, 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 유효 측정을 허용 할 수 있기 때문 프로토콜에서는, 장간막 정맥의 생체 내에 초점 현미경. 이것은 훨씬 더 어렵고 시간이 소요되는 등의 뼈, 간, 피부, 근육 등 cremaster 또는 다른 장기의 생체 내에 현미경이다. 모드여기에 설명 된 L은 리포 폴리 사카 라이드의 복강 내 주사로 염증 자극, 그것을 challengeing 후 염증 세포 - 세포 상호 작용의 재현성 평가에 이상적입니다.

<table><tbody><tr><td>로다민 6G</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>대장균의 지질다당류 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

생체 내에 현미경 살아있는 동물에서 다른 상이한 영역에서의 프로세스와 혈관을 조사하는데 사용될 수있는 방법이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 장간막 정맥의 생체 내에 현미경을 설명합니다. 이는 생체 내에서 내피 백혈구 작용을 도시 재현 결과 단시간에 행할 수있다. 우리는 내피 세포의 LPS 도전 후 염증 설정을 설명합니다. 그러나이 모델에 하나, 세균 화학 또는 생물학적 같은 염증성 질환의 많은 다른 유형을 적용하고 약물의 관리 및 살아있는 동물에 미치는 직접 효과와 백혈구 채용에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 및 혈관 염증 반응에 미치는 영향의 다른 치료의 숫자에 성공적으로 적용되고있다. 여기서, 우리는 형광 로다 민 6G 이러한 레이블에 의해 백혈구 및 혈소판의 시각화를 설명합니다. 또한, 특정 영상은 PE 될 수 있습니다대상 형광 표지 된 분자를 사용하여 rformed.

이 프로토콜에 설명 된 실험 환경의 개요가도 1에 도시되어있다. 이것은 생체 내에 현미경에서 관찰 할 수 표면화 회장 루프 및 그 용기와 마우스를 보여준다.도 2 인해 미처리 동물에서 활성화의 어느 정도를 나타낸다 절차 자체. 그러나 거의 느린 압연 또는 LPS 처리 쥐에 비해 백혈구의 회사 접착이있다. 또한 야생형 마우스 중 마시는 물이나 치료 쥐 3 주 동안 플루옥세틴 ​​처리 하였다. 그림 2A-에서 생체 내에 현미경의 다른 결과를 보여줍니다 그림 2 도 2F-H에 추가하여 마우스를 LPS로 처리하면서, LPS와 더 염증성 도전없이 결과를 표시 하였다. 회전 속도가 LPS 도전 후 감소하는 동안 여기에서 우리는, 압연 및 부착 백혈구의 높은 숫자를 볼 수 있습니다. 이 실험을 통해 우리는 혈소판의 세로토닌이 C 것을 보여줄 수염증 7 백혈구 모집의 초기...

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 생체 내 염증 발생 시 백혈구, 혈관 내피세포 및 혈소판 백혈구 간의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 관심 물질로 마우스를 전처리하고 혈구 세포를 표지함으로써 수행되며, 이후 회장 루프와 그에 부속된 장간막 혈관을 외부로 노출시킨 뒤, 선택된 장간막 정맥 내에서 일어나는 STO 세포 상호작용을 생체 내 현미경으로 촬영합니다. 최종적으로 백혈구와 혈소판이 내피세포 또는 서로 간에 일으키는 상호작용을 분석할 수 있습니다.이 방법은 다양한 염증 모델이나 관심 있는 다양한 전처치 후, 체내에서 어떤 종류의 백혈구-내피세포 또는 혈소판-백혈구 상호작용이 발생하는지와 같이 염증 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생체 내 이미징 4시간 전에 16~20g의 4~6주령 수컷 마우스에 20 mg/kg의 LPS를 IP로 투여하여 모의 세균성 염증 반응을 유도합니다. 이때 플라스틱 챔버와 장간막 조직을 가습하기 위해 0.9% saline 용액을 37 °C 항온수조에서 미리 예열해 둡니다.다음으로, LPS 처리된 생쥐의 발가락을 집어 반응이 없는 것을 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인한 후, 동물의 크기에 맞게 연고를 도포하고 면도기로 복부를 제모하며, 70% ethanol을 적신 거즈로 잔털을 제거합니다. 그 다음, 작은 곡선 핀셋과 가위를 사용하여 복부를 절개하고, 상복벽 혈관을 확인한 뒤 혈관을 보호하기 위해 백선을 따라 복막을 엽니다. 조직이 건조해지지 않도록 예열된 식염수 몇 방울을 복강 내에 넣고, 순환 혈구 세포를 표지하기 위해 50 µL의 rhodamine 6G를 안와하 정맥에 주입합니다.그 다음 마우스를 10 centimeter 페트리 접시에 놓고, 회장(illium) 루프를 외부로 노출시킨 후 조직의 습윤 상태를 유지하기 위해 2분마다 미리 데워둔 식염수를 투여합니다. 생체 내 현미경(intravital microscopy)을 통해 염증 반응을 관찰하려면, 마우스를 현미경 아래에 배치하고 직경 200 to 300 micrometers이며 주변 지방이 가능한 적게 보이는 장간막 정맥을 시야 내로 가져옵니다. 이때 적절한 현미경 소프트웨어를 사용하십시오.마우스당 4개의 서로 다른 정맥에서 혈구-내피세포 상호작용을 1분 동안 기록하십시오. 그런 다음, 개별적인 혈류 조건이 안정적이고 진입되었음을 확인하기 위해 세포 간 반응을 분석하십시오. 롤링 백혈구(rolling leukocytes)의 수를 정량화하려면, 정맥을 가로지르는 수직선을 긋고 1분 동안 이 선을 통과하는 모든 백혈구의 수를 수동으로 측정하십시오.롤링 속도를 결정하려면, 정맥에 50 µm 간격으로 두 개의 수직선을 긋고, 단일 백혈구가 내피세포 위에서 안정적으로 롤링하며 두 선 사이를 가로지르는 데 걸리는 시간을 측정합니다. 백혈구 부착을 측정하려면, 정맥에 200 x 200 µm 크기의 정사각형을 그립니다. 그런 다음, 30초 동안 사각형 내에서 눈에 보이는 움직임이 없는 강하게 부착된 백혈구의 수를 수동으로 측정합니다.마지막으로, 혈소판-백혈구 상호작용을 정량화하기 위해 백혈구 하나에 결합된 혈소판의 수를 수동으로 측정합니다. 처치하지 않은 동물에서는 시술 자체로 인해 어느 정도의 활성화가 나타나지만, 처치하지 않은 백혈구의 느린 롤링(rolling)이나 강한 부착은 거의 관찰되지 않습니다. 실제로 LPS를 투여한 마우스에서는 순환 혈액 세포의 롤링 속도가 감소하며, 롤링 및 부착된 백혈구의 수가 더 높게 관찰됩니다.본 실험에서는 fluoxetine을 복강 내로 급성 투여한 직후, 추가적인 LPS 자극 없이 생체 내 현미경 관찰을 수행하였습니다. fluoxetine 처리 동물에서 강하게 부착된 백혈구의 수가 더 많고 롤링 속도가 더 낮게 나타난 것은, fluoxetine 급성 처리가 백혈구와 혈관 내피 세포 간의 상호작용에 영향을 미쳤음을 나타냅니다. 또한, LPS로 유도된 복막염 동안 장간막 정맥에서 나타난 혈소판-백혈구 상호작용의 대표 이미지에서 관찰할 수 있듯이, 백혈구 주변으로 혈소판이 응집되는 모습과 이러한 복합체가 혈관벽과 상호작용하는 것을 확인할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 백혈구-내피세포 및 혈소판-백혈구 상호작용을 조사하기 위한 활내 현미경 관찰법의 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

이 프로토콜은 장간막 허혈-재관류 손상을 유도하고 생체 내 현미경을 사용하여 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(NET)을 시각화하는 방법을 제시합니다. 상장간막동맥의 혈류를 1시간 동안 제한한 후 재관류를 수행하여 백혈구 유착 및 NETosis를 직접 정량화할 수 있었습니다.

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury)

사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로...

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

배우세요 마우스 장간막 정맥에서 생체 내 현미경을 이용한 백혈구-내피 세포 및 혈소판-백혈구 상호작용 분석 방법을. 이 기법은 염증 과정에서 세포 간 동역학을 실시간으로 관찰하여 면역학 연구에 활용됩니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

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