Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

이 절차의 전반적인 목표는 미세유체 장치 내의 세포 위에 얇은 콜라겐 어셈블리를 증착하는 것입니다. 이는 먼저 산성화된 천연 콜라겐을 메틸화를 통해 수정하여 순양전하를 띠는 콜라겐 분자를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 산성화된 천연 콜라겐을 [ation]*을 통해 수정하여 순음전하를 띠는 콜라겐 분자를 생성하는 것입니다.

다음으로, 미세유체 장치를 준비하고 간세포를 파종한 후, 세포가 부착되고 퍼질 수 있도록 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막 단계는 세포층 위에 콜라겐 층을 10겹으로 형성하기 위해 양전하와 음전하를 띤 콜라겐 용액에 세포를 교대로 노출시켜 콜라겐 조립체를 증착하는 것입니다. 최종적으로, 위상 및 면역형광 현미경 관찰과 알부민 및 요소 분석을 통해 세포 극성의 발달 및 유지와 분비 기능을 확인합니다.

이 기술의 주요 장점은 20년 이상 플레이트 배양에 적용되어 온 것과 유사한 기술을 사용하여 마이크로 장치 내에서 간세포 배양을 가능하게 한다는 점입니다. 복잡한 장치 설계가 필요하지 않으며, 증착된 매트릭스는 100 nanometers 수준으로 매우 얇습니다. 저희는 플레이트의 표준 세포 배양 기술을 미세유체 장치로 어떻게 옮길 수 있을지 브레인스토밍하던 중에 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.

콜라겐 샌드위치 방법은 개방형 상단 현미경 시스템에서 작동하지만, 사용되는 하이드로젤은 채널 높이가 제한된 밀폐형 마이크로 장치와는 호환되지 않습니다. 천연 산성 콜라겐 용액 100mg을 차갑고 멸균된 물을 사용하여 0.5mg/mL 농도로 희석하고, 겔화를 방지하기 위해 용액을 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 1N 수산화나트륨을 몇 방울 첨가하여 콜라겐 용액의 pH를 9에서 10 사이로 조절하고, 실온에서 30분 동안 용액을 부드럽게 섞어줍니다.

콜라겐이 침전됨에 따라 용액이 흐려지기 시작하며, 침전된 콜라겐 용액을 3000 ×g에서 25분 동안 원심분리합니다. 이후 튜브 바닥에 투명한 겔 형태의 침전물이 보이면 상층액을 흡입하여 제거하고, 침전된 콜라겐을 0.1 N 염산이 포함된 메탄올 200 mL에 재현탁시킵니다. 실온에서 4일 동안 교반하며 메틸화 반응이 일어나도록 합니다. 메틸화 후, 용액을 3000 ×g에서 25분 동안 원심분리하여 메틸화된 콜라겐을 펠렛화한 다음, 산성 메탄올 상층액을 흡입하여 폐기합니다. 이어서, 메틸화된 콜라겐을 멸균된 PBS 25 mL에 녹이고 60 µm 셀 스트레이너로 용액을 여과합니다.

1 N 수산화나트륨을 20 µL씩 첨가하여 용액의 pH를 7.3에서 7.4로 조절하십시오. 상용 쥐 콜라겐 ELISA 키트 또는 히드록시프롤린 분석 키트를 사용하여 콜라겐 용액의 농도를 측정하십시오. 그 후, 멸균된 PBS로 용액을 3 mg/mL가 되도록 희석하십시오.

메틸화된 콜라겐 용액을 나사 캡이 있는 유리병에 옮겨 멸균합니다. 병 바닥에 클로로포름 3 mL를 조심스럽게 층이 지도록 가한 후, 4 °C에서 하룻밤 동안 그대로 둡니다. 다음 날 아침.

무균적으로 상단의 메틸화 콜라겐 층을 제거하십시오. 메틸화 콜라겐은 4°C에서 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오. 별도의 네이티브 산성 콜라겐 용액 100 mg을 얼음처럼 차가운 멸균수로 0.5 mg/mL 농도로 희석하고, 앞서 설명한 대로 변성을 방지하기 위해 용액을 얼음 위에 둡니다. 수산화나트륨으로 콜라겐 용액의 pH를 조절하고, 용액을 실온에서 교반하여 콜라겐을 침전시킵니다.

다음으로, 40 mg의 six cynic anhydride를 10 mL의 acetone에 녹입니다. 용액의 pH를 지속적으로 모니터링하며 교반하면서, 이 혼합물을 collagen 용액에 0.5 mL씩 천천히 첨가합니다. pH가 9.0에 가까워질 때마다 1 N sodium hydroxide를 한두 방울씩 첨가하여 pH를 9.0 이상으로 유지하며, 실온에서 120분 동안 지속적으로 교반합니다.

6가지 시닉 및 하이드라이드 용액을 모두 첨가한 후, 숙신산 콜라겐이 용해되면서 혼합물이 투명해지는 것을 관찰하고, pH가 9.0 이상으로 유지되는지 주기적으로 확인하십시오. 숙신산 콜라겐이 모두 용해되면, 1 N 염산을 20 µL씩 첨가하여 용액의 pH를 4.0으로 조정하십시오. 숙신산 콜라겐이 침전되면서 용액이 다시 탁해지는 것을 관찰하십시오.

다음으로 용액을 3000 ×g에서 25분 동안 원심분리하십시오. 석신산 콜라겐(succinate collagen)을 침전시키고 반응하지 않은 무수 석신산(snic anhydride)이 포함된 산성 상층액을 제거한 후, 25 mL의 멸균 PBS를 넣고 반복적인 피펫팅을 통해 석신산 콜라겐을 용해시켜 최종 농도가 약 3 mg/mL가 되도록 하십시오. 그런 다음 용액을 60 µm 셀 스트레이너(cell strainer)로 여과하고, 용액의 pH를 7.3에서 7.4 사이로 조정하십시오.

1N 수산화나트륨을 20 µL씩 첨가하며 상용 쥐 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드록시프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 농도를 측정하십시오. 그 다음, 해당 용액을 3 mg/mL로 희석하십시오. 멸균된 PBS를 사용하여 이 처리된 콜라겐 용액을 메틸화된 콜라겐 용액과 동일한 방식으로 멸균하십시오.

표준 기술을 사용하여 세포 성장을 위한 채널 높이가 100 microns, 너비가 0.4~1.5 millimeters, 길이가 1~10 millimeters인 세포 배양 챔버가 포함된 미세유체 장치를 제작하여 시작합니다. 플라즈마 세정기를 사용하여 장치 표면과 유리 슬라이드를 산화시킵니다. 그런 다음 두 부분을 함께 눌러 접합을 형성합니다.

장치를 UV 광선에 최소 30분 동안 노출시켜 멸균합니다. 멸균된 PBS에 15 µg/mL 농도로 희석한 fibronectin을 챔버에 채우고 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 장치에 접종합니다.

층류 조직 배양 후드 내에서, 장치당 각 솔루션을 10회 사용할 수 있는 충분한 양의 메틸화 및 비메틸화 콜라겐 솔루션과 수 밀리리터의 배지를 준비하십시오. 솔루션은 얼음 위에 보관하십시오. 메틸화 콜라겐 솔루션 20 µL와 비메틸화 콜라겐 솔루션을 교대로 사용하여 장치를 세척하십시오.

각 적용 사이에 1분간 대기합니다. 용액당 총 10회 장치를 세척합니다. 콜라겐 층을 성장시키는 동안 세포가 배지 없이 노출되는 시간을 최소화하기 위해 신속하게 작업하십시오. 이때 미세유체 장치의 입구와 출구에 콜라겐이 천천히 축적되는 것을 관찰할 수 있습니다.

유체 흐름에 대한 저항이 증가하는 경우, 배지로 장치를 한두 번 세척한 후 층 형성을 계속하십시오. 모든 층을 적용한 후, 신선한 배지로 장치를 두 번 헹구고 인큐베이터로 되돌립니다. 메틸화 및 아세틸화는 콜라겐 분자의 전하 특성을 변화시킵니다.

아세틸화는 양전하 그룹을 제거하고 이를 음전하 그룹으로 대체하며, 메틸화는 음전하 그룹을 제거하여 순양전하 분자를 생성함으로써 세포와 같은 전하 표면 위에 두 가지 콜라겐 변형체를 층별로 증착할 수 있게 합니다. 마이크로 유체 장치 내의 피브로넥틴 코팅 유리에 파종된 일차 간세포는 이러한 층별 방식을 통해 코팅될 수 있습니다. 콜라겐 매트릭스 조립 시, 세포 위에 10개의 이중층을 증착하면 약 140 nanometers 두께의 콜라겐 층이 형성되며, 상단 콜라겐 층별 증착이 없는 간세포와 대조됩니다.

기질은 시간이 지남에 따라 분화된 표현형을 잃고 수축하며 미세유체 장치의 표면에서 떨어져 나옵니다. 이와 대조적으로, 초박형 콜라겐 어셈블리로 덮인 간세포는 14일 동안 분화된 형태, 90% 이상의 생존율 및 극성을 유지합니다. 세포 생존율, 형태 및 극성 외에도, 콜라겐 층별 적층 기술은 여기서 나타난 바와 같이 일차 간세포의 기능을 회복시키고 안정화합니다. 이 비디오를 시청하고 나면, 양전하와 음전하를 띤 콜라겐 용액을 만들기 위해 콜라겐을 어떻게 메틸화하고 숙신화하는지, 그리고 이를 층별 적층 증착에 사용하여 미세유체 장치 내의 세포 위에 얇은 콜라겐 어셈블리를 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.