Name: 생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 생체 분자의 시간적 방출을 제어하는 IPC 섬유 복합 공사장 제작 방법을 통해 조직 공학용 폴리머 스캐폴드를 구축하는 기술입니다. 이 방법은 세포 미세환경을 모방하여 지속적인 생화학적 방출을 가능하게 합니다.

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이 작품은 우수 연구 센터, 제어 공학 연구소, 싱가포르 중 하나에 의해 관리되는 싱가포르 국립 연구 재단에 의해 지원되었다. MFAC는 1122703037. BKKT는 제어 공학 연구소 지원 연구를위한 과학, 기술 및 연구 기관 (싱가포르) 및 국가 기관 (프랑스) 프로젝트 번호에 따라 공동 프로그램에 의해 지원됩니다. 우리는 증명 판독 비디오 제작에 협조 원고와 양 새벽 JH 네오 씨 다니엘 HC 웡 감사합니다.

고분자 전해질 솔루션 1. 준비 <ol><li> 리아 외에서 설명하는대로, 키토산을 정제. 간략하게, 1 %를 만드는 2 % 키토산 용액 (/ V W) (v / v) 아세트산 함유하고, 진공 필터 (93)가 급 여과지. pH가 10 분 동안 1,200 XG에서 7 원심 침전 된 키토산에 안정화 될 때까지 5M 수산화 나트륨을 사용하여 여과 액을 중화. 뜨는을 가만히 따르다 및 키토산을 씻어 탈 이온수를 추가합니다. 원심 분리 및 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 정제 된 형태를 얻기 위해 -80 ° C 및 동결 건조 O / N에서 석출 키토산 동결. 제습 캐비닛에 정제 된 키토산을 저장합니다. </li><li> 무균 조직 배양 접시에 정제 키토산 1g을 달아. 생물학적 안전 캐비넷의 UV 램프에 최대한 가깝게 조직 배양 접시에 키토산을 넣고 15 분 동안 UV 광에 노출. 무균 핀셋을 사용하여, 유리 용기에 멸균 키토산 놓는다. 용해 키토산은 0 필터링 사용.0.5 %와 1 % 사이의 최종 농도 15M 아세트산 (W / V). </li><li> 알긴산 나트륨 0.1 g을 칭량하고 (w / v)의 용액을 1 %를 얻기 위해 탈 (DDI)의 증류수 10ml에 녹인다. 완전한 용해를 보장하기 위해 볼텍스 혼합기에서 적어도 2 시간 동안 알긴산 나트륨 염을 섞는다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 알지네이트 용액 필터. 4 ° C에서 알지네이트 솔루션을 저장합니다. </li><li> 제조자가 권장하는 신경 성장 인자 (NGF), - 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 베타 인간 재조합 성장 인자 재구성. </li></ol> IPC 섬유 2. 도면 <ol><li> 유사한 순 전하를 갖는 고분자 전해질 용액의 10 내지 20 μL의 분취 액으로 단백질, 성장 인자 또는 다른 생물 분자를 섞는다. 순 음전하 (예, 소 혈청 알부민 [BSA])와 생물학적 분자 알지네이트 용액을 혼합한다. 양전하 (예 : VEGF)와 생물 분자와 혼합되어야키토산 솔루션입니다. </li><li> 파라 필름으로 덮여 안정된 평평한 표면에 키토산 및 알긴산의 작은 분취 량 (10 ~ 20 μL)를 놓습니다. 키토산 및 알긴산 액 근접 배치 아니라 서로 접촉한다. </li><li> 가볍게 키토산과 알긴산 방울에 집게 한 쌍의 각 끝을 찍어. 함께 집게 곤란하여 고분자 전해질의 방울을 가져와. 물방울이 서로 접촉 할 때, 서서히 두 방울 (도 1a)의 인터페이스에서 IPC 섬유 그릴 수직 상방 집게를 당긴다. </li><li> 이러한주의 깊게 회전 맨드릴 상에 부착되어 플랫 고분자 담체로 집 전체에 겸자에 그려진 IPC 섬유의 단부를 배치했다 (제 3 및 4 참조). 유니폼과 IPC 섬유 beadless 형성 할 수 있도록 10mm / sec의 고정 된 속도로 맨드릴을 돌립니다. Incorporated의 버스트 방출을 일으킬 것이다 비드를 형성 할 것이다 IPC 섬유 드로잉 속도를 증가생화학 및 조기 섬유 종료. (10) </li><li> 통합의 효율성을 결정하기 위해, 남아있는 모든 액체가 1X 인산염 완충 생리 식염수 500 μL (PBS)으로 희석하여 파라 필름에 남아 수집합니다. BCA의 (BSA에 대한) 분석 (VEGF 및 NGF의 경우) 또는 ELISA 혼입 생체 분자를 검출하기 위해 적절한 분석을 통해 잔사 중의 단백질 또는 성장 인자의 함유량을 측정한다. </li></ol> 복합 하이드로 겔 풀루 란 - 덱스 트란의 비계 (PD) 다당류 및 IPC 섬유 3. 제작 <ol><li> IPC 섬유 수집을 위해 희생 풀루 란 프레임 제조 <ol><li> 풀루 란 다당류를 달아 (W / V) 수용액을 20 %를 만드는 증류 탈 (DDI) 물과 혼합. 균일 성을 보장하기 위해 풀루 란 솔루션 O / N을 섞는다. </li><li> 10cm 직경의 조직 문화 폴리스티렌 (FPC 기판) 접시에 풀루 란 용액 15g 캐스트. 37 ° C에서 풀루 란 솔루션 O / N을 건조. 7에 풀루 란 영화를 잘라MM은 7mm 사각 프레임을 X. </li></ol></li><li> 풀루 덱스 트란 폴리 사카 라이드 용액을 제조 <ol><li> 30 %를 만들기 다당류의 솔루션 풀루 란과 덱스 트란 (/ V W) : DDI 물 (3 1 비율). 폴리 사카 라이드 용액의 균질성을 확인하기 위해 O / N 섞는다. 천천히 20 %의 최종 농도를 달성하기 위해 다당류 용액에 중탄산 나트륨으로 추가 (W / V). 용액의 균일 성을 보장하기 위해 O / N을 섞는다. 4 ° C에서 다당류 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> 풀루 란 프레임 IPC 섬유를 수집 <ol><li> 악어 클립을 사용하여 희생 풀루 란 프레임 (3.1)를 붙입니다. 플라스틱 코팅 된 접착 테이프를 사용하여 회전 맨드릴의 끝에 악어 클립 및 풀루 란 프레임을 스틱. 10mm / sec의 일정한 속도로 부착 된 프레임 맨드릴을 돌립니다. 풀루 프레임은 원하는 방향으로 회전 맨드릴 상에 부착 될 수있다. </li></ol></li><li> 집게 쌍 (1 절)와 ATTAC을 사용하여 IPC 섬유 그리기H 회전 풀루 란 프레임 상에 IPC 섬유의 그린 끝. 일정 속도로 IPC 섬유를 그린다. IPC 섬유의 말단부에 도달 한 후, RT에서 N / 섬유 - 온 - 프레임 구조의 O를 건조. </li><li> PD 하이드로 겔 지지체에 IPC 섬유의 포함 </li><li> . (/ V W) 나트륨 수용액 및 100 μL의 10M 수산화 나트륨을 트리 메타 11 %, 100 ㎕를 추가 풀루 덱스 트란 용액의 각 그램 가교 7 1 ~ 2 분 동안 stirplate를 이용하여 60 rpm으로 용액을 혼합하기. 트리 메타 포스페이트 나트륨과 수산화 나트륨을 첨가 한 후, 폴리 사카 라이드 용액을 거의 즉시 가교 것이다. IPC 섬유를 완전히를 포함하는 섬유 - 온 - 프레임 구조에 점성 다당류 용액을 붓고. 화학적으로 가교 결합 된 복합체 지지체 (도 1b)를 형성하기 위해 30 분 동안 60 ° C에 결합 된 덱스 트란, 풀루 란 - IPC 섬유 (PD-IPC)를 부화. </li><li> 주의 : 흄 후드 단계 3.3.2을 수행하고 적절한 보호 동등를 사용아세트산 등의 pment 부식성 및 인화성이다. </li><li> PD-IPC 지지체의 기공 형성을 유도하기 위하여, 20 분에 20 % (w / v)의 아세트산 전체 골격 잠수함. </li><li> 100 rpm으로 흔들어 섞으면 서 5 분간 1X PBS에 세척 PD-IPC 골격에 의해 미 반응 시약을 제거합니다. 이 단계를 2 번 반복합니다. </li><li> 초과 PBS를 제거하고 즉시 -80 ° CO / N의 PD-IPC 발판을 동결. 비계 어떤 제어 방출 또는 생체 활성 분석에 사용하기 전에 적어도 24 시간을 동결 건조. </li></ol> PCL 및 IPC 섬유의 복합 비계 4. 제작 주의 : 디클로로 메탄은 위험한 물질이다. 디클로로 메탄을 처리 할 때 흄 후드 및 개인 보호 장비를 사용합니다. <ol><li> 깨끗한과 패턴 PDMS 기판 만들기 <ol><li> 소프트 리소그래피 공정을 이용하여 원하는 치수의 FPC 기판의 일부를 사용하여 깨끗한 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 기판 만든다. patte 만들기원하는 템플릿 지형 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)에 표준 소프트 리소그래피 방법을 사용하여 rned PDMS 기판. (12) </li></ol></li><li> IPC 섬유 수집을 위해 희생 PCL 프레임 제조 <ol><li> PCL을 달아 (W / V) 솔루션을 0.9 %를 만들 디클로로 메탄에 용해. PDMS 기판의 모든 1cm 2 지역의 경우, 0.9 % PCL 용액 500 μl를 놓습니다. 완전히 흄 후드에서 증발 디클로로 메탄 용매를 모두 허용합니다. 원하는 두께로 필름을 두껍게 0.9 % PCL 주조의 과정을 반복합니다. PDMS 기판에서 건조 PCL 필름을 제거합니다. 적절한 크기의 구멍을 뚫는을 사용하여 PCL 프레임에 구멍을 만듭니다. (2) </li></ol></li><li> PCL 프레임 IPC 섬유를 수집 <ol><li> 악어 클립 (4.2.1)에서 구멍 희생 PCL 프레임을 부착합니다. 플라스틱 코팅 된 접착 테이프를 사용하여 회전 맨드릴에 악어 클립 스틱. PCL의 FRAM에 IPC 섬유의 그린 끝을 연결합니다10mm / 초 (제 2)의 일정 속도로 회전을 시작하기 전에 전자. IPC 섬유 드로잉 종료 후, 섬유에 프레임 구조의 O / N에서 4 ℃에서 건조. </li></ol></li><li> 섬유에 프레임이 패턴 PCL 기판으로 구성 퍼가기 <ol><li> 필요에 따라, 깨끗한 또는 패턴 PCL 기반을 만들기 위해 PDMS 기판에 0.9 % PCL 용액 500 μl를 삭제합니다. 원하는 두께와 발판을 얻었다 0.9 % PCL 용액 다층 캐스트. 완전히 흄 후드에서 증발 디클로로 메탄 용매를 모두 허용합니다. </li><li> PCL베이스의 상단에있는 섬유에 프레임 구조 (섹션 4.3.1)을 놓습니다. 원하는 두께를 얻기 위해 섬유의 프레임 구성을 여러 번에 0.9 % PCL 솔루션을 추가하고 완전히 PCL-IPC 복합 지지체 (그림 1C을) 제조, IPC 섬유를 포함. </li></ol></li></ol> 복합 IPC 공사장 공중 발판에서 생물학 작용제의 릴리스 5. 측정 <ol><li> 배치 합성 PD IPC-또는PCL-IPC 골격 및 독립 실행 형 IPC 섬유를 별도로 24 웰 플레이트에. </li><li> 발판을 담그고 독립형 IPC 섬유를 1X PBS 500 μL와 함께. 37 ° C에서 샘플을 품어. 다양한 시점 (릴리스 미디어)에서 PBS를 수집하고 1X PBS 500 μL로 교체합니다. </li><li> 통합 생체 분자 누적 방출 프로파일을 계산하는 BCA 분석 (BSA), ELISA (VEGF 및 NGF) 또는 다른 적절한 분석을 이용하여 분리 배지에서 단백질 또는 증식 인자의 양을 측정한다. </li></ol> 합성 IPC 공사장 공중 발판에서 세포의 6. 시드 출시 생물 제의 생체 활성 테스트하는 <ol><li> 적어도 20 분 동안 생물학적 안전 캐비넷에 UV 광을 사용하여 동결 건조 PD-IPC 또는 PCL-IPC 복합 지지체 멸균. </li><li> 200 ㎕의 성장 배지에 2 × 105 세포의 세포 현탁액을 수득 표준 세포 배양 기술을 사용한다. 복합체 지지체 상 농축 세포 현탁액을 시드. AfteR 20 분, 완전히 비계 잠수함하는 성장 미디어의 최고 최대 볼륨을 설정합니다. </li><li> 이러한하는, Alamar 블루 대사 활동 분석, PC12의 신경 돌기 가지 분석 또는 면역와 같은 표준 기술을 통해 세포 활성을 측정합니다. </li></ol>

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IPC 섬유 개의 반대로 대전 된 고분자 전해질의 상호 작용에 의해 형성된다. 프로세스는 안정된 섬유 형성을위한 자기 조립 공정을 용이하게 고분자 전해질의 계면에서의 복잡한 추출을 이용한다. IPC 섬유 형성의 메카니즘은 유사 대전이 고분자 전해질 복합체 과정에서 혼입 될 수있는 생리 활성 물질로 첨가되도록. 10,11는 반대로, 반대로 대전 된 고분자 전해질로 생리 활성 물질의 첨가는 즉각적인 침전이 발생할 것이다. IPC 섬유에 대한 간단한 제조 방법은 세포, 성장 인자 및 작은 분자 등의 다양한 생체 물질을 포함에 다양성을 준다. IPC 섬유이 중요한 기능은 또한 다른 물리적 특성과 생체 분자 (충전 및 분자량)과 성장 인자가 높은 효율로 혼입 된 PD-IPC 및 PCL-IPC 복합 지지체 모두에서 관찰되었다. 콘트라에서ST는, VEGF 및 NGF 용 미세 방법론을 사용하여 캡슐화 효율은 각각 16 % 6 13 8 % 정도로 낮을 수있다. <p class="jove_conte...

세포외 기질은 세포 행동을 지시하는 고유한 생화학적, 생물물리학적 단서를 가지고 있습니다. 이러한 생리학적 3차원(3D) 미세환경을 모방하는 것은 재생 의학 및 조직 공학 응용 분야에서 널리 연구되는 전략입니다. 예를 들어, 자연적으로 파생된 기질과 합성 기질은 모두 생물물리학적 세포 환경을 모방하기 위한 수단으로 지형학적 단서로 변형되었습니다. 1 예를 들어, 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드는 패터닝된 PDMS 기판에 주조하여 쉽게 패터닝할 수 있습니다. 2 그러나 대부분의 합성 골격은 생체 내에서 제어된 생화학적 환경을 부적절하게 요약합니다.합성 물질의 벌크 또는 표면 변형은 세포 부착을 위한 생화학적 단서만 제시하지만 여전히 생화학적 전달에 대한 시간적 조절이 부족합니다. 3 따라서, 세포외 기질의 시간적으로 조절되는 생화학적 전달 시스템을 모방할 수 있는 최적의 골격이 필요합니다. 
미세구와 같은 생화학적 전달 시스템은 다단계 합성 공정의 심각성과 복잡성으로 인해 생체 활성이 손실되고 통합 효율이 낮다는 문제로 어려움을 겪고 있습니다. 4-6 원스텝 제조 및 혼입 방법을 사용하는 대체 방법은 혼입의 비효율성 및 생체 활성의 손실 없이 유리한 생화학적 미세환경을 생성할 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 한 가지 실행 가능한 솔루션은 계면 고분자 전해질 복합체(IPC) 섬유를 사용하여 생물학적 제제를 전달하고 보호하는 것입니다. 두 개의 반대 전하를 띤 고분자 전해질 수용액을 함께 사용하면 계면에서 IPC 섬유를 추출할 수 있습니다. 수용액에 있는 거의 모든 유형의 hydrophlic 생체 분자는 음전하를 띤 또는 양전하를 띤 고분자 전해질 용액에 첨가될 수 있으며, 따라서 복합화 과정에서 IPC 섬유에 유용한 생체 분자의 통합을 용이하게 합니다. 또한 이 공정에는 수성 및 주변 조건만 필요하므로 생체 활성이 손실될 위험이 줄어듭니다. 이 방법을 사용하여 활성 성장 인자2,7 짝수세포 8,9가 성공적으로 전달되었습니다. 또한 IPC 섬유를 형성하는 간단한 방법으로 모든 모양이나 방향으로 성형할 수 있습니다. 이러한 섬유의 안정성은 복합 골격을 생성하기 위해 소수성2 및 친수성 중합체7 모두에 통합되는 데 유리했습니다. IPC 섬유가 있는 이러한 복합 골격은 세포에 물리적 고정을 제공하면서 생리학적으로 관련된 생화학적 환경을 만드는 데 유용합니다. 
이 연구에서는 IPC 섬유를 활성 생체 분자의 방출 제어를 위한 지형이 있는 친수성 및 소수성 골격에 통합하는 방법을 보여줍니다. 개념 증명으로, 키토산과 알긴산으로 만든 IPC 섬유를 생체 적합성, 비면역원성 및 비항원 pullulan-dextran 친수성 하이드로겔 또는 생체 적합성 폴리카프로락톤 소수성 스캐폴드에 통합합니다.

<table><tbody><tr><td>풀루란&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc 일본 오카야마</td><td></td><td>분자량 (MW) 200 kDa. 이 재료는 풀루란 프레임과 PD-IPC 스캐폴드를 만드는 데 사용되는 제약 등급의 풀루란입니다.</td></tr><tr><td>덱스트런</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. 이 소재는 더 이상 Sigma Aldrich에서 생산하지 않습니다. 대안은 카탈로그 번호 31392(Sigma Aldrich)입니다. 이 재료는 PD-IPC 스캐폴드를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>중탄산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>중탄산나트륨은 풀루란-덱스트란 다당류 용액에 천천히 첨가해야 합니다. 중탄산나트륨의 빠른 첨가는 침전을 초래할 것입니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 트리메타포스페이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>T5508</td><td>이 화학 물질은 흡습성이므로 제습 캐비닛에 보관해야 합니다. 나트륨 트리메타포스페이트의 수용액은 항상 신선하게 만들어야 합니다.</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>이 물질은 위험하므로 니트릴 장갑과 같은 적절한 보호 장비로 취급해야 합니다.</td></tr><tr><td>키토산</td><td>시그마 알드리치</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. 75%에서 85%의 아세틸화 정도. 키토산의 정제는 안정적인 IPC 섬유를 생성하는 데 필요합니다.</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td></td><td>이것은 다른 브랜드 유형으로 대체 될 수 있습니다. 이 물질은 부식성 및 가연성입니다. 흄 후드에서 이 화학물질을 취급할 때는 안면 보호대, 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 신발 커버와 같은 보호 장비를 착용해야 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>갈조류에서 추출한 알긴산 나트륨 염, 저점도</td><td>시그마 알드리치</td><td>A2158</td><td>하룻밤 동안 물에 녹입니다. 멸균 0.2&nbsp를 통한 필터; &마이크로; M 사용 전 주사기 필터. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>둔감한 혈청 알부민</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td></td><td>메마른 PBS에서 녹이고 0.2 &micro를 사용하여 거르십시오; M 사용 전 주사기 필터&nbsp;</td></tr><tr><td>BCA 분석 키트</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>이 키트는 PD-IPC 스캐폴드에서 BSA 방출을 측정하는 데 사용되었습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 재조합 혈관 내피 성장 인자</td><td>R& D 시스템</td><td>293-VE</td><td>성장 인자를 0.2% 헤파린 용액에 용해시켜 최종 농도 5&nbsp; mg/ml입니다.</td></tr><tr>돼지 시<td>그마 Aldrich</td><td>H3393</td><td>의 헤파린 나트륨 소금</td><td>이것은 다른 브랜드 유형으로 대체 될 수 있습니다. 헤파린 염을 1%의 최종 농도로 멸균수에 용해시키고 0.2 &micro를 통해 여과합니다. M 사용 전 주사기 필터&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>이 주요 세포 유형은 PD-IPC 스캐폴드에서 방출된 후 VEGF 생체 활성을 결정하기 위한 분석에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>세포 대사 활동을 측정하는 데 사용됩니다. Alamar blue를 세포와 함께 배양하고 2-4시간 동안 표준 세포 배양 조건을 유지합니다. 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포 활성과 상관관계가 있는 Alamar blue 퍼센트 감소를 확인합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>ScanVac Coolsafe Lyophilizer</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>이것은 -105에서 -110&nbsp; &deg;C입니다. 이것은 다른 표준 실험실 동결 건조기로 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>폴리카프로락톤(PCL)</td><td>시그마 알드리치</td><td>181609</td><td>MW 65kDa. 이것은 더 이상 Sigma Aldrich에서 제조하지 않습니다. 이것은 Sigma Aldrich 카탈로그 번호 704105로 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>V800151</td><td>이것은 다른 브랜드 유형으로 대체될 수 있습니다. 이 물질은 위험하므로 흄 후드에서 처리해야 합니다. 이 화학 물질을 취급할 때는 항상 보호 장비를 착용해야 합니다.</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS, 184 실리콘 엘라스토머 키트)</td><td>다우코닝</td><td>(240)4019862</td><td>엘라스토머 키트는 폴리머 베이스와 가교제와 함께 제공됩니다. 폴리머 베이스와 가교제를 다른 비율로 혼합하면 PDMS의 강성이 달라집니다.</td></tr><tr><td>인간 재조합 베타 신경 성장 인자 (NGF)</td><td>R & D 시스템</td><td>256-GF</td><td>는 멸균 DI 물에서 최종 농도 100&nbsp로 재구성되었습니다. &마이크로; g&#8288;/&#8288;ml입니다. 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C를 사용할 때까지.</td></tr><tr><td>인간 중간엽 줄기세포(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>이 세포 유형은 NGF와 나노 지형의 시너지 효과를 결정하기 위한 분석에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>쥐 PC12 갈색세포종 세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>: 이 세포 유형은 NGF의 생체 활성을 측정하기 위해 신경돌기 성장 분석에 사용되었습니다. NGF로 방출 배지에 노출된 후 신경돌기 확장으로 세포 수를 측정하고 총 세포 수로 정규화합니다.</td></tr><tr><td>등급 93 여과지</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>이것은 pH&nbsp;7에서 수산화나트륨과 함께 침전된 후 키토산의 정화에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>1,200 x g 속도로 키토산을 정제하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>일정한 속도로 회전하는 맨드릴이 있는 모터</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>모터는 풀루란 또는 PCL 프레임의 IPC 섬유 제작에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>FirstBase</td><td></td><td>여과를 통해 살균(0.2 &micro; M 필터) 및 오토클레이브.&nbsp;</td></tr><tr><td>직경 10mm 조직 배양 폴리스티렌 접시 (TCPS)</td><td>Greiner</td><td></td><td>TCPS 접시는 풀루란 프레임의 주조에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>인간 VEGF ELISA 키트</td><td>R & D 시스템</td><td>DVE00</td><td>ELISA 키트는 이형 매체에서 VEGF를 검출하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>인간 NGF ELISA 키트</td><td>R& D 시스템</td><td>DY256</td><td>ELISA 키트는 이형 매체에서 NGF를 검출하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 코팅 접착 테이프</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>접착 테이프는 앨리게이터 클립을 회전 맨드릴에 단단히 접착하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>

생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

조직 공학에 사용되는 다양한 골격은 생리학적 세포 틈새를 모방하기 위해 통제된 생화학적 환경을 필요로 합니다. 계면 고분자 전해질 복합체(IPC) 섬유는 소분자 약물, 세포, 단백질 및 성장 인자와 같은 다양한 생물학적 제제의 제어된 전달에 사용할 수 있습니다. IPC 섬유를 만드는 방법론의 단순성은 제어된 생체 분자 전달을 위한 응용 분야에 유연성을 제공합니다. 여기에서는 IPC 섬유를 친수성 다당류와 소수성 폴리카프로락톤의 두 가지 다른 고분자 골격에 통합하여 다성분 복합 골격을 만드는 방법을 설명합니다. 우리는 IPC 섬유가 이러한 고분자 구조에 쉽게 내장될 수 있음을 보여주었으며, 이를 통해 생체 분자의 지속적인 방출 및 향상된 보존 능력을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 또한 세포 행동에 시너지 효과를 줄 수 있는 지형학적 단서와 지속적인 생화학적 방출을 가진 복합 고분자 골격을 만들었습니다. IPC 섬유가 있는 복합 고분자 지지체는 세포 틈새를 재현하는 새롭고 간단한 방법을 나타냅니다.

이 글에서, 우리는 다양한 생체 분자의 서방에 대한 IPC 섬유와 복합 발판을 만드는 노력했다. 본 연구에서 사용 된 생체 분자의 특성을 표 1에서 발견된다. IPC 섬유는 제 PD-IPC 복합체 지지체 (도 1B)를 만들기 위해 PD 친수성 하이드로 겔에 포함 하였다. 모델 분자 BSA 먼저 제어 생체 릴리스 복합체 지지체를 사용하는 타당성을 결정하기 위하여 시험 하였다. BSA는 45 ± 0.97 %의 효율과 PD-IPC 골격에 통합했다. PD-IPD에서 출시 BSA는 수반 정상 상태이어서 초기 감쇠 버스트 릴리스 (그림 2)와 선형에 가까운 반응 속도를 보였다. 후 2 개월, BSA는 97 %의 총 방출을 달성했다. 반대로, 단독 섬유 IPC하여 4 시간 내에 80 %의 BSA의 신속한 방출을 나타내었다. 다음으로, 우리는 PD-IPC의 scaffo를 사용하여 VEGF의 방출 프로...

조직 공학을 위한 스캐폴드는 세포 틈새의 복잡한 생화학적, 생물물리학적 미시환경을 다시 요약해야 합니다. 여기에서는 계면 고분자 전해질 복합체 섬유를 플랫폼으로 사용하여 지속적인 생화학적 방출을 가진 복합 다중 구성 요소 고분자 골격을 만드는 방법을 보여줍니다.

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

이 절차의 전반적인 목표는 친수성 또는 소수성 고분자 복합체 스캐폴드로부터 세포 니치(cellular niche)를 모방하여 공간적 제어가 가능한 제어된 생체 분자 전달을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 인터페이셜 폴리일렉트로라이트(interfacial poly electrolyte) 또는 IPC 섬유라고 불리는 생체 분자 방출 섬유의 공간적 배치를 제공하기 위해 원하는 고분자로 희생 프레임워크를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 희생 프레임 위에 표적 친수성 생체 분자를 포함하는 IPC 섬유를 통합하는 것입니다.다음으로, 프레임 구조물상의 IPC 섬유를 기판상의 지형적 단서가 포함된 캐스팅 몰드로 사용되는 마이크로 패턴 기판을 이용하여 더 큰 스캐폴드에 매립합니다. 마지막 단계는 프레임 상의 섬유와 구조물이 완전히 동화되고 폴리머가 응고되어 패턴이 없거나 마이크로 패턴이 형성된 기판을 생성하도록 하는 것입니다. 최종적으로, 표준 분석법을 사용하여 표적 분자의 방출 프로파일과 생물학적 활성을 나타낼 수 있습니다.이 기술이 마이크로캡슐화와 같은 기존의 다른 방법들에 비해 제공하는 주요 장점은, 단순한 혼입 및 제작 공정을 통해 광범위한 친수성 또는 소수성 폴리머 스캐폴드에 친수성 생체 분자를 통합하는 것이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 다중 조절된 생화학적 방출, 생화학적 구배, 그리고 지형적 단서와 지속적인 생화학적 방출이 세포 행동에 미치는 시너지 효과를 포함하여 약물 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 폴리전해질 섬유 형성 단계는 학습하기 어렵기 때문에 시각적인 시연이 매우 중요합니다.폴리전해질 용액의 속도 농도와 순도는 모두 IPC 섬유의 안정적인 형성에 매우 중요합니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 관심 있는 단백질, 성장 인자 또는 기타 생체 분자를 10~20 µL 분량의 폴리전해질 용액에 혼합하십시오. 다음으로, 파라폼으로 덮인 안정적인 평평한 표면에 키토산과 알긴산 용액을 10~20 µL씩 소량의 방울 형태로 떨어뜨립니다. 키토산과 알긴산 방울은 서로 접촉하지 않도록 하되, 서로 가까이 배치해야 합니다.포셉의 한쪽 끝을 카이트 샌드 액적에 살짝 담그고, 다른 쪽 끝을 알긴산염 액적에 담급니다. 그런 다음 포셉을 오므려 두 전해질 액적을 서로 가까이 가져갑니다. 액적들이 서로 접촉하면, 포셉을 천천히 수직으로 들어 올려 두 액적의 계면에서 IPC 섬유라고 알려진 계면 전해질 복합체 섬유를 끌어냅니다.추출된 IPC 섬유의 끝부분을 회전 맨드릴에 고정된 평면 고분자 스캐폴드로 구성된 수집기에 조심스럽게 놓습니다. 균일하고 비드(bead)가 없는 IPC 섬유를 형성하기 위해 맨드릴을 10 millimeters per second의 고정된 속도로 회전시킵니다. IPC 섬유의 추출 속도를 높이면 비드가 형성되어 내포된 생화학 물질의 급격한 방출과 섬유의 조기 종결이 발생하게 됩니다.Liao 등과 KO 등의 관찰 결과와 일치하게, 섬유 공정이 종료되면 남은 액체에 500 µL의 PBS를 가해 희석하고, 잔류물에 남아 있는 단백질 또는 성장 인자의 농도를 측정합니다. 생체 분자의 결합 효율을 결정하기 위해, 3 g의 폴란드 다당류를 정량하여 15 mL의 증류 탈이온수에 첨가합니다.20% 수용액을 만들기 위해, 다음 날 균질성을 확보할 수 있도록 Poland 용액을 하룻밤 동안 혼합합니다. 10 cm 직경의 조직 배양용 폴리스티렌 접시에 Poland 용액 15 mL를 붓습니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 용액을 건조시킨 후, 건조가 완료되면 필름을 7 mm x 7 mm 정사각형의 희생용 Poland 프레임으로 자릅니다.다음으로, 다당류인 풀란(pullulan)과 덱스트린(dextrin)을 3:1 비율로 증류 탈이온수에 녹여 30% 용액을 만듭니다. 균질성을 확보하기 위해 하룻밤 동안 혼합합니다. 다당류 용액에 탄산수소나트륨을 천천히 첨가하여 최종 농도가 20%가 되도록 합니다. 용액을 하룻밤 동안 혼합한 후, 최종 다당류 용액은 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다. 희생용 풀란 프레임을 원하는 방향으로 정렬하여 악어 클립과 플라스틱 코팅 접착 테이프를 이용해 회전 맨드릴(mandrel)에 고정합니다.프레임이 부착된 맨드릴을 10 millimeters per second의 일정한 속도로 회전시킵니다. 그런 다음 이전 섹션에서 보여준 것과 같이 IPC 섬유를 인발하기 시작하십시오. 다만, 이번에는 인발된 IPC 섬유의 끝단을 회전하는 폴란드 프레임에 부착하십시오.그 후 IPC 광섬유 인발 과정이 끝날 때까지 기다립니다. 프레임 구조물 위에서 광섬유를 상온에서 하룻밤 동안 건조하십시오. 다음으로, 악어 클립에서 구조물을 분리하여 회전 맨드릴(mandrel)로부터 떼어냅니다.구성물을 마이크로 원심분리 튜브 캡에 넣으십시오. 그런 다음 5g의 Poland Dextrin 용액을 비커에 넣고 60 RPM으로 교반을 시작하십시오. 교반기를 사용하여 11% sodium trim phosphate 용액 500 µL와 10 M sodium hydroxide 500 µL를 첨가하십시오.용액을 가교하기 위해, 1~2분 동안 용액을 계속 혼합한 다음 점성이 있는 다당류 용액을 프레임 구조체 위의 섬유 위에 부어 IPC 섬유를 완전히 매립합니다. 구조체를 60 °C에서 30분 동안 배양하여 화학적으로 가교된 복합 스캐폴을 형성함으로써 복합 스캐폴 내에 기공 형성을 유도합니다.전체 스캐폴드를 20% acetic acid 용액에 20분 동안 담급니다. 그 후 100 RPM으로 흔들어주며 PBS로 5분씩 세 번 세척합니다. 반응하지 않고 남은 시약을 제거하기 위해, 과잉의 PBS를 제거하고 복합 스캐폴드를 즉시 -80 °C에서 하룻밤 동안 동결시킵니다.다음으로, 제어 방출 또는 생물학적 활성 분석에 사용하기 전, 스캐폴드를 최소 24시간 동안 동결 건조합니다. 먼저 표준 소프트 리소그래피 방법을 사용하여 원하는 지형을 가진 깨끗하고 패턴화된 PDMS 기판을 제작합니다. 그 다음, 0.9% PCL을 디클로로메탄에 용해하여 IPC 섬유 수집을 위한 PCL 희생 프레임과 패턴화된 PCL 베이스를 모두 준비합니다.PDMS 필름 캐스팅 몰드의 1 $\text{cm}^2$ 면적당 0.9% PCL 용액 500 $\mu\text{L}$를 몰드 위에 떨어뜨립니다. 흄 후드 내에서 용매가 완전히 증발하도록 둔 다음, 필름의 두께를 높이기 위해 0.9% PCL 캐스팅 과정을 반복합니다. 다음으로, 별도의 깨끗한 PDMS 기판 위에 0.9% PCL 용액을 한 번에 500 $\mu\text{L}$씩 떨어뜨려 희생 프레임을 준비합니다.깨끗한 PCL 기반 구조를 만들기 위해 PCL을 여러 층으로 캐스팅하여 원하는 두께의 스캐폴드를 얻습니다. 원하는 두께에 도달하면 흄 후드 내에서 모든 클로로메탄 용매가 완전히 증발하도록 둡니다. 건조된 PCL 필름을 깨끗한 PDMS 기판에서 제거하고 PSAP 크기의 펀처를 사용하여 PCL 프레임에 구멍을 뚫습니다.다음으로, PCL 프레임을 수집 맨드릴에 장착하고 앞서 설명한 대로 프레임 위에 IPC 섬유를 인발하기 시작합니다. IPC 섬유 인발이 끝나면 프레임 위의 섬유 구조체를 제거하고 25°C에서 하룻밤 동안 건조합니다. 프레임 위의 섬유 구조체를 패턴화된 PCL 베이스 위에 놓고, 원하는 두께를 얻고 IPC 섬유가 완전히 매립되도록 0.9% PCL 용액을 프레임 위의 섬유 구조체에 여러 번 추가합니다.Poland 덱스트린 IPD 복합체에서 방출된 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)은 초기 감쇄된 burst release 이후 수반되는 정상 상태(steady state)를 보이며 거의 선형적인 동역학을 나타냈습니다. 2개월 후 BSA의 총 방출률은 97%에 도달했습니다. 이와 대조적으로, 단독 IPC 섬유는 4시간 이내에 BSA의 80%가 빠르게 방출되었습니다. 동일한 복합체를 사용하여, 인간 제대정맥 내피세포를 테스트 플랫폼으로 활용하여 섬유로부터 혈관 성장 인자를 지속적으로 방출할 수 있음을 확인하였습니다.방출된 성장 인자는 각 시점의 방출 이후에도 생물학적 활성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 본 예시에서는 18일에 걸쳐 신경 성장 인자를 섬유 내에 로딩하였습니다. PC 12 신경돌기 성장 분석을 통해 확인한 결과, 로딩된 신경 성장 인자의 약 80%가 P-C-L-I-P-C 복합체로부터 지속적인 선형 방출 형태로 방출되었습니다.각 시점마다 스캐폴드에서 배지로 방출된 생성 활성 신경성장인자의 양은, 일반 배지에 30 ng/mL의 신경성장인자를 첨가했을 때와 유사한 신경돌기 성장 효과를 보였습니다. 지형적 구조와 제어된 신경성장인자 방출 기능을 모두 갖춘 P-C-L-I-P-C 복합 스캐폴드는 세포 행동에 시너지 효과를 낼 수 있습니다. 나노 패턴 복합 스캐폴드에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포는 지형적 구조 또는 성장인자에만 노출된 세포에 비해 더 높은 수준의 신경 분화를 나타냈습니다.이 절차를 수행할 때, 원하는 친수성 분자를 섬유 내에 통합시키기 위해 동일한 순전하를 가진 폴리전해질 용액에 혼합하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 바(bar) 분자의 조절 방출 능력을 갖춘 복합 폴리 스캐폴드를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 영상에서 얻은 주요 성과는 성장 인자의 서방형 방출, 다중 성장 인자의 방출 기능을 가진 폐 스캐폴드를 제작하고, 생리적 니치를 재현할 수 있는 생화학적 신호의 구배를 생성하는 데 활용될 수 있을 것입니다.아세트산, 수산화나트륨 및 클로로메탄을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 실험 절차를 수행할 때는 항상 개인 보호 장구 착용 및 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

조직 공학 및 세포 배양을위한 폴리머를 electrospinning의 과정은이 문서에서 해결되었습니다. 특히 photopatterning 멀티 고분자 electrospinning의 추가 처리 능력과 photoreactive macromers의 electrospinning이 설명되어 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

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여기 조직 공학을위한 개 층 사이의 끊임없는 인터페이스와 biocompatible, 다층 매트릭스를 만들기위한 독특한 전략을 설명합니다. 이러한 비계는 다양한 생물학적, 화학적 또는 기계적 신호에 의해 세포 행동을 조절하기 위해 이상적인 사용자 정의 환경을 제공 할...

밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

이 비디오에서는, 우리는 그들의 기능을 개선하고 세포의 이동을 제어하는​​ 다공성 금속 임플란트에 대한 수정 방법을 보여줍니다. 기술은 3D 및 기저막의 생산은 2-D에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 모방에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 기공 그라디언트의 개발을 포함한다. 또한, 혈액 단백질의 분석을 통해 생체의 모니터링 임플란트 통합을위한 HPLC 기반 방법이 설명되어 있습니다.

모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경<em&gt; 생체 내</em

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다.  단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

골전도성과 생체 활성을 나타내면서 두개-악안면(CMF) 뼈 결점에 맞을 수 있는 골격이 관심 대상입니다. 이 프로토콜은 융합염 템플릿을 사용하고 생체 활성 폴리도파민 코팅을 적용하기 위해 용매 주조 미립자 침출(SCPL) 방법을 사용하여 폴리카프로락톤 디아크릴레이트(PCL-DA)를 기반으로 하는 형상 기억 스캐폴드를 준비하는 방법을 설명합니다.

생리 활성, PCL 기반 &quot;셀프 피팅&quot;형상 기억 폴리머 비계의 제작

2차원 및 3차원 초소수성 고분자 재료는 유사한 조성의 더 낮은 표면 에너지 중합체와 혼합된 생분해성 중합체를 전기 방사 또는 전기 분무하여 제조됩니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 초 소수성 고분자 재료를 제조

이 작업에서는 용융 혼합과 선택적 침출의 조합을 사용하여 폴리(젖산)/폴리에틸렌 글리콜(PLA/PEG) 스캐폴드를 준비했습니다. 본 명세서에서 논의된 방법은 다공성과 공극 크기를 모두 높게 제어함으로써 3층 스캐폴드를 개발할 수 있도록 허용했다. 기계적 특성은 또한 생리학적 환경에서 평가되었습니다.

손쉬운 및 환경 친화적 인 경로는 그레이드 기공 크기와 폴리 (젖산) 공사장 공중 발판을 제조

이 문서에서는 덜한 CO2 의 depressurization 통해 3 차원 (3D) 비 계에 전통, 2 차원 (2D) electrospun nanofiber 매트를 확장 하는 기술을 보여 줍니다. 이러한 증강된 건설 기계는 3D, 밀접 하 게 모방 세포 nanotopographic 신호, 고는 nanofibers 캡슐화 하는 생물 학적 분자의 기능을 보존 한다.

건설 기계 3-차원으로 2 차원 Electrospun Nanofiber 매트의 확장

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

배우세요 생체 분자의 시간적 방출을 제어하는 IPC 섬유 복합 공사장 제작 방법을 통해 조직 공학용 폴리머 스캐폴드를 구축하는 기술입니다. 이 방법은 세포 미세환경을 모방하여 지속적인 생화학적 방출을 가능하게 합니다.

생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

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