Name: 관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 배우세요 3D 바이오모방 하이드로겔을 이용한 관절 연골 세포 배양 및 연골 생성 방법입니다. 이 기술은 생리학적 미세환경에서 연골 세포의 생리와 표현형을 유지하여 재생의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 Stanford Department of Orthopaedic Surgery와 Stanford Coulter Translational Seed Grant에 자금 지원을 감사의 뜻을 전합니다. J.H.L.은 지원을 아끼지 않은 National Science Foundation Graduate Fellowship과 DARE Doctoral Fellowship에 감사드립니다.

모든 실험은 스탠포드 대학 인간 피험자의 지침에 따라 수행 기관 심사위원회 프로토콜을 승인했다. 1. 관절 연골 세포의 분리 <ol><li> 슬관절 전 치환술시 폐기 조직에서 연골을 얻기 이전 8 설명한 바와 같이 해부. </li><li> 시각적으로 매끄러운 표면에 대한 연골 샘플들의 내측 또는 외측 대퇴골을 선택 및 연골 하골에 영향을주지 않고 4~5mm 연골 생검을 제거하기 위해 메스 통해 연골의 표면에 절개를. </li><li> 정제 콜라게나 제와 O / N 처리와 조직의 효소 분해하여 세포 외 기질에서 연골 세포를 분리합니다. 37 ° C에서 연골 세포 성장 미디어 콜라게나 II (125 U / ㎖) 및 콜라게나 IV (160 U / ㎖)의 1의 비율 : 1을 사용합니다. </li><li> 다음 날, 70를 통해 해리 세포를 포함하는 조직 분해를 필터링mm 크기의 나일론 메쉬 기공. 5 분 동안 600 XG에 DMEM / F12와 원심 분리기 20 ㎖로 2 회 세척 할 것. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM / F12 재 현탁액 25 μg의 / ㎖ 아스코르브 산, 2 mM L- 글루타민, 항생제 다음 1 × 106 세포 / 60mm 배양 접시의 밀도로 격리 연골 판형 (100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 / ㎖ fungizone). 이전에 생체 모방 히드로 겔에 캡슐에 37 ° C에서 접시를 유지하고 고밀도 단층로 기본 연골 세포 배양을 유지한다. </li></ol> 2. 생체 모방 하이드로 겔의 제조 참고 :이 방법은 허용 된 폴리 (에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트) (PEGDA, MW 5,000g / 몰), DPBS에 콘드로이틴 설페이트 - 메타 크릴 레이트 (CS-MA)를 함유하는 하이드로 겔의 생체 모방 합성. 광개시제의 첨가는 광 활성화 가교 결합을 가능하게한다. 최종적인 하이드로 겔 조성물이 7 %가 체중이 포함T / 볼륨 (W / V) PEGDA의 3 % CS-MA의 V / W 및 광개시제의 V / W 0.05 %. <ol><li> 메타 크릴 레이트 그룹과 CS 폴리머를 기능화하여 CS-MA를 합성. <ol><li> MES의 1.952 g 및 탈 이온수 200 ㎖의 염화나트륨 5.84 G (DiH 2 O)을 용해하여 50 mM의 2 morpholinoethanesulfonic 산 (MES) 및 0.5 M 염화 나트륨 (NaCl을)의 완충 용액을 준비합니다. 완충 용액에 콘드로이틴 설페이트 나트륨 염 5 g의 용해. </li><li> (: EDC = 1 : 2의 몰비 NHS)로 0.532 g (4.62 mmol)의 N- 히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 및 1.771 g (9.24 밀리몰), 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC)를 추가 5 분을위한 솔루션 및 교반. </li><li> 용액을 24 시간 동안 실온에서 반응을 유지한다 (2 : 1 : EDC : AEMA NHS = 1의 몰비) 0.765 g (4.62 밀리몰)의 2- 아미노 에틸 메타 크릴 레이트 (AEMA)를 추가한다. </li><li> 투석 튜브 (12 ~ 14 kDa의 MWCO)를 사용하여 4 일 동안 탈 이온수에 대한 투석 (diH 2 O)에 의한 혼합물을 정화. </li><li> P 필터0.22 μm의 필터를 통해 urified 솔루션 및 건조기, 진공 O / N에서 솔루션을 포함하는 개방형 튜브를 놓습니다. 모든 튜브는 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다. 빛과 습기로부터 보호 -20 ° C에서 용해 된 폴리머를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 세포 캡슐화 <ol><li> (셀 - 라덴 3D 하이드로 겔을 펀칭에 대한) PCR 필름과 원통형 막대를 압력솥과 자외선 아래에서 조직 문화 후드에서 0.2 μm의 필터링 된 70 % 에탄올에 침수에 의해 주문 제작 원통형 겔 금형을 소독. </li><li> 기포 또는 누수를 방지하기위한 간극없이 멸균 PCR 막을 겔 몰드의 하부를 밀봉. 멸균 150mm 판에 보관하십시오. </li><li> 종래의 하이드로 겔의 생체 모방 전지 밀봉에 날, 콜라게나 제 II에서 O / N 처리 및 콜라게나 제 IV 용액 고밀도 연골 세포 단층을 해리. 콜라게나 VI 각 연골 세포 성장 미디어 콜라게나 II 125 U / ㎖와 160 U는 / ㎖를 사용하여37 ° C에서. </li><li> 50 ㎖ 튜브를 가지고 추가 5 % 중량 / 부피 (w / v)의 폴리 (에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트) (PEGDA, MW = 5,000g / 몰), w 3 % / V 콘드로이틴 설페이트 - 메타 크릴 레이트 (CS-MA)를, 및 DPBS에 V 광개시제 / W 0.05 %. 솔루션을 혼합하여 따로 보관 유지하는 튜브를 소용돌이. 빛으로부터 튜브를 보호합니다. </li><li> , 50 mL의 팔콘 튜브에 세포를 수집 해리 5 분 동안 460 XG에 카운트 원심. 흡 인물은 모든 셀 관으로부터 미디어 및 15 × 106 세포 / ml의 밀도로 세포를 다시 일시 중단 상기 혼합 겔 물질을 추가한다. 공기를 피하는 형성 거품 동안 30 회 철저하게 섞는다. </li><li> 피펫 (72) 사용자 정의 만든 원통형 겔 금형에 셀 하이드로 겔 현탁액 또는 단독으로 하이드로 겔의 μL 및 5 분 동안 3 mW의 / 평방 미터에 자외선 (365 nm 파장)에 대한 노출을 통해 겔화를 유도한다. 더 셀 내용 일부 하이드로 겔 솔루션을 준비합니다. 미래의 생화학 적 및 기계적 시험에 대한 음성 대조군 이러한 구조를 사용합니다. MeasuUV 강도 측정기 UV 광의 세기 재. 강도를 조정하기 위해, UV 광원 겔화시 하이드로 겔 지지체 사이의 거리를 변경. 참고 : 하이드로 겔 (CS)를 포함하기 때문에, 무 세포 기여 만 휴대 개그를 표현하기 위해 세포 함유 하이드로 겔의 생화학 개그 내용에서 제외됩니다. </li><li> 오프 쉽게 껍질의 필름을 잘라 메스를 사용하여 조심스럽게 제거합니다. 원통형 막대의 도움으로, 비중 합 젤 느슨한 세포를 씻어 살균 DPBS 5 ㎖로 6 웰 플레이트에 젤을 밀어. </li><li> 문화 아니라 각으로 연골 세포의 성장 매체의 1.5 ml에 포함 된 24 웰 플레이트의 세포 함유 하이드로 겔. 우물에 세척 하이드로 겔을 전송하는 일회용 주걱을 사용합니다. </li><li> 생존 / 세포 독성 키트를 사용하여 라이브 죽은 염색 24 시간 후 캡슐에 의해 세포 생존 능력을 평가합니다. 문화 신선한 연골 세포 촉진제로 변경 3~6주의 세포 함유 하이드로 겔과 빈 하이드로 겔2 일마다 분석을 위해 수확 전에 미디어 WTH. </li></ol> 4. RNA 추출 및 유전자 발현 분석 <ol><li> 조심스럽게 미디어를 기음과 세포 - 라덴뿐만 아니라 빈 제어 하이드로 겔에 멸균 PBS 1X했습니다. </li><li> 멸균 주걱의 도움으로, 깨끗한 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 각각의 하이드로 겔을 전송하고 각 튜브에 트라이 시약 250 μL를 추가합니다. RNA를 분리 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> RNA 분리 및 정량 사용 각 샘플에서 그것의 1 μg의 이후 대용량 cDNA를 역 전사 키트를 사용하는 cDNA로 반전 전사를 수행합니다. </li><li> 정량 PCR에 관심의 유전자의 발현의 시험에의 TaqMan 유전자 발현의 배열을 사용합니다. 내부적 GAPDH 유전자 발현 수준을 정상화. </li><li> PCR 조건 : 10이어서 우라실 DNA 글리코와 이전 증폭 물을 불 활성화하여 50 ℃에서 2 분의 인큐베이션을 포함60; 95 ° C에서 배양 분당의 Taq 중합 효소를 활성화합니다. 이어서 95 ° C에서 15 초로 구성된 PCR 사이클의 마흔을 수행하고, 60 ℃에서 1 분. </li></ol> 5. 생화학 적 분석 <ol><li> 각 셀 하이드로 겔 구조를 들어 DNA와 다음과 같은 황산 글리코 사 미노 글리 칸 (sGAG) 생산을 정량화. </li><li> 조심스럽게 미디어를 기음과 세포 - 라덴뿐만 아니라 빈 제어 하이드로 겔에 멸균 PBS 1X했습니다. 빈 튜브를 달아 티슈 페이퍼에 그것을 블로 팅 후 내부의 하이드로 겔을 넣고 하이드로 겔의 중량 젖은 무게를 기록한다. </li><li> 효소 소화에 대한 별도의 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 -20 ° C에서 각각의 하이드로 겔을 동결 이상 (GAG에 대한) (DNA에 대한) Picogreen 분석 및 디메틸 메틸렌 블루 분석을 실행하는 소화 제품의 나누어지는을 사용합니다. </li><li> 하이드로 겔의 효소 소화 papainase 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 제 phosphat 나트륨 7.1 g을 칭량하여 PBE 버퍼를 준비전자 이염 (나 2 HPO 4) 및 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 나트륨 염 (EDTA-나 2) 1.6 g을. , DH 2 O 500ml에 녹이고 6.5로 pH를 조정하고 0.22 mm 필터를 통해 정화 된 용액을 필터. </li><li> PBE 완충액 20ml에 -L- 시스테인 0.035 g을 녹인다. 솔루션 및 멸균 파파인 효소의 100 μl를 필터링합니다. </li></ol></li><li> 준비 분석을 수행 할 때, -20 ° C에서 튜브를 타고 얼어 붙은 하이드로 겔을 준비 파파인 솔루션의 300 μl를 추가합니다. 박격포와 유 봉 젤 크러시와 모터 유봉과 잘 섞는다. </li><li> 추가 파파인 용액 500 μL에 볼륨을 가져와. 제어 겔에 대해 동일한 절차를 수행한다. 16 시간 3,9 60 ° C에서 품어. 소화 하이드로 겔을 포함하는 용액 따라서 DNA와 개그 정량에 사용 할 수 있습니다. 제조자의 PR 다음 표준 람다 파아지 DNA와 Picogreen 분석법을 이용 DNA 함량을 측정otocol. </li><li> 1,9- 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB) 표준 10 상어 콘드로이틴 설페이트와 염료 결합 분석법을 이용하여 황산 GAG 함량을 정량화. 해당 젖은 무게 GAG의 양을 분할함으로써 GAG 함량을 결정한다. </li></ol> 6. 기계적 시험 <ol><li> 10 N 하중 셀이 장착 5944 인스 트론 시험 장치를 이용하여 일축 압축 시험을 수행한다. <ol><li> 체외 배양의 바람직한 일 후, 세포 - 하이드로 겔 지지체와 무 세포 제어 하이드로 겔에 압축 시험을 수행한다. </li><li> RT에서 PBS 욕에서 시험편을 담그고 하중 조건 하에서 연골 조직에 의해 경험 생리 변형 때문에 15 % (11, 12)의 최대 변형률 1 % 스트레인 / sec의 속도로 압축하는 것은 10 내지 20 %의 것으로보고되었다 (13, 14). </li></ol></li><li> 3 차 다항식을 사용하여 변형 곡선과 곡선 맞춤 대 스트레스를 만듭니다. COMPR 결정15 %의 변형률 값의 곡선에 맞게 방정식에서 (메모리) 접선 계수. </li></ol>

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이 프로토콜에보고 된 바와 같이, 3D 하이드로 겔은 일반적으로 단층 배양 물 (15)가 발생 섬유 연골 세포로 세포의 탈분화 과정을 회피 배양 연골 세포 표현형을 유지할 수있다. 또한, chondrocytes- 하이드로 겔 구조의 장기 문화는 연령과 질병에 관련된 고유 세포 기능을 유지하는 유리한 환경을 밝혔다. 3D 생체 모방 하이드로 겔의 사용은 몇 가지 장점을 갖는다. 우선, 콘드로이틴 설페이트의 포함 (CS), 관절 연골에서 발견되는 주요 성분은, chondroitinase 분비하여 하이드로 겔 매트릭스를 분해 및 세포 외 매트릭스 5, 16 새로 합성 된 연골 누워 세포를 가능하게한다. 또한, CS는 도시 된 관절염 관절의 항 염증 특성을 가지고있다. 하이드로 겔은 또한 생체 모방 연골 복구 세포 전달을위한 발판 재료로서 사용될 수 있고, 화학적으로 변형 될 수있다좋은 생체 조직 (17, 18)를 통합 촉진한다. PEG-CS 하이드로 겔의 사용은 장기간의 연골 세포의 배양 및 생화학 적 및 기계적 성질의 평가를 허용한다. 여기에서 우리는이 플랫폼은 연골 엔지니어링을위한 최적의 세포 유형을 정의하기 위해 차별화 된 연골 세포의 다양한 소스의 비교 분석에 유용 할 수 방법을 보여줍니다. 흥미롭게도, 하이드로 겔에 캡슐화 된 연골 세포는 자신의 고유 능력에 따라 가능한 유지 및 증식. 하이드로 겔 조성물 지지체는 사실상 건강한 소아 및 성인 연골 세포의 성장은도 2에 도시 된 바와 같이. 기술 된 하이드로 겔의 조성과 구조는 연골 조직의 형성을 촉진하는 글리코 사 미노 글리 칸에 의해 평가 기능 외 기질의 증착 (GAG로 나타낸 바와 ) 정량. 추가적인 장점은 연골 - 하이드로 겔 구조이다새로 형성된 연골 조직의 기계적 특성에 대해 평가 될 수있다. 일축 압축 시험 비교를 위해 무 세포 하이드로 겔에서 수행되어야합니다. 하이드로 겔은 사실 때문에 CS 부분의 강성 극한 강도를 갖는다. (변형 속도 / s 1 %에서) 5-20%의 일축 압축 변형은 하중 조건 하에서 연골 조직에 의해 경험 생리 균주 보낸 연골 조직 (11, 12)의 기계적 시험에 적용될 수는 10-20 인 것으로보고되었다 % (13, 14). 기계적 시험에 세포 - 라덴과 무 세포 모두 하이드로 겔의 응답은 문화 엔드 포인트에서 평가 하였다. 설명 된 예에서는 OA 연골 세포를 포함하는 구조체의 하부의 강성 대조적 성인 및 청소년 연골 함유 구조체의 강성을 비교 관찰 위에. 셀 하이드로 겔 구조의 기계적 특성의 기능적 특성의 평가를 허용세포 성숙 능력에 대한 심층적 인 분석을 제공 형성 조직. 결론적으로, 연골 조직을 생성하기 위해 다른 연골 세포 모집단의 잠재력을 연구하는 3D 생체 모방 하이드로 겔의 사용은 광범위하게 적용될 수있다. 여기에 기술 된 시험 관내 연구 이외에도, 세포 함유 구조체의 생체 내 이식 생리 컨텍스트에서 세포 성숙 및 재생 가능성을 연구하기 위해 구상 될 수있다. 추가적인 생체 모방 인자 하이드로 플랫폼의 추가 수정은 연골 세포의 증식 및 성숙을 최적화하기 위해 구상 될 수있다.

자가 복구 가능성이 제한되어 있기 때문에 인간의 관절 연골은 돌이킬 수 없는 손상을 자주 겪습니다. 현재 관절 연골 손상 치료를 위한 효율적인 세포 기반 접근법을 개발하는 데 광범위한 노력이 집중되고 있습니다. 이러한 세포 기반 치료법의 성공 여부는 최적의 세포 공급원을 선택하고 재생 잠재력을 유지하는 데 크게 좌우됩니다. 연골세포는 연골 복구를 위한 일반적인 세포 공급원이지만 공급이 제한되어 있으며 2D 단층 배양에서 체외 확장 중에 역분화되어 유리질 연골 생성을 제한할 수 있습니다 1. 
이 프로토콜의 목적은 다양한 연령과 질병 상태의 인간 연골 세포에 대한 체외 비교 연구를 위한 3차원 하이드로겔 플랫폼을 구축하는 것입니다. 기존의 2차원(2D) 배양과 달리 3차원(3D) 하이드로겔은 연골세포가 형태와 표현형을 유지할 수 있도록 하고 연골세포가 연골 조직을 생산할 수 있도록 생리학적으로 관련된 환경을 제공합니다 2,3. 연골세포 배양을 위한 3D 물리적 구조를 제공하는 것 외에도 하이드로겔은 천연 연골 세포외 기질(ECM)의 기능을 모방합니다. 특히, 콘드로이틴 설페이트 메타크릴레이트(chondroitin sulfate methacrylate)의 포함은 분비된 부분비 인자(paracrine factor)4에 대한 잠재적 저장소를 제공하고 세포 매개 분해 및 매트릭스 회전율(matrix turnover)5을 가능하게 합니다. 아가로스 및 알긴산 겔을 포함한 다양한 연구에서 많은 3D 하이드로겔 배양 시스템이 널리 활용되고 있지만, 당사는 연골세포 배양에 몇 가지 뚜렷한 이점이 있는 생체 모방 3D 배양 시스템을 사용했습니다. 콘드로이틴 설페이트(CS)는 관절 연골에 풍부한 성분이며 PEG-CS 하이드로겔은 연골 생성 표현형을 유지 및 강화하고 세포 매개 기질 분해 및 회전율을 촉진하는 것으로 나타났습니다 2,5. 또한, 하이드로겔 스캐폴드의 기계적 특성은 PEG의 농도를 변경하여 쉽게 조절할 수 있으므로 연골 세포 또는 관련 세포 유형 6,7의 재생 가능성을 더욱 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. PEG/CSMA는 또한 생체 적합성이 있으므로 예를 들어 연골 결손에 직접 임상적으로 적용할 수 있는 잠재력이 있습니다. 이 시스템의 한계는 아가로스와 같은 단순한 시스템에 비해 세포 생존력에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 복잡성과 광중합 사용이지만, 연골세포 배양의 이점이 잠재적인 한계를 능가합니다.
3D 하이드로겔 배양은 세포 표현형(유전자 발현, 단백질 면역 염색) 및 기능적 결과(연골 매트릭스 생산의 정량화, 기계적 테스트)를 평가하기 위한 기존 분석법과 호환됩니다. 이 유리한 3D 환경은 장기 3D 배양에서 세 가지 다른 연령 집단의 인간 연골 세포의 조직 재생 잠재력을 비교하기 위해 테스트되었습니다. 
결과는 표현형 및 기능 분석을 통해 평가되었습니다. 유년기, 성체 및 골관절염 연골세포는 3D 생체 모방 하이드로겔 배양에서 차등 반응을 보였습니다. 3주 및 6주 후, 연골형성 유전자 발현은 청소년 및 성인 연골세포에서 상향 조절되었지만, OA 연골세포에서는 하향 조절되었습니다. 아그레칸(aggrecan), 제2형 콜라겐(type II collagen) 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)을 포함한 연골 조직 성분의 침착은 소아 및 성인 연골세포에서 높았지만 OA 연골세포에서는 그렇지 않았다. 생성된 연골 구조체의 압축 계수도 유사한 경향을 보였습니다. 결론적으로, 소아 연골 세포와 성인 연골 세포 모두 하이드로겔에서 최대 6주간의 3D 배양까지 연골 생성 및 연골 기질 배치를 보였습니다. 대조적으로, 골관절염 연골세포는 연골 표현형의 상실과 견고한 연골을 생성하는 최소한의 능력을 드러냈습니다.

<table><tbody><tr><td>청소년 연골 세포 (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>성인 연골 세포 (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>폴리 (에틸렌 글리콜 디 아크릴레이트)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2- 모르 폴리 노 에탄 술폰산</td><td>시그마</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>광개시</td>제 <td>Irgacure&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>콘드로이틴 황산염 나트륨 염&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시숙신이미드&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoethyl methacrylate</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>스펙트럼 연구소&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 2</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 4</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>DMEM/F12 매체</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>살아있는/죽은 분석</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri 시약</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염&nbsp;</td><td>시그마</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-디메틸메틸렌 블루&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 조명 장비 - XX-15LW 벤치 램프, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Instron 5944 테스트 시스템&nbsp;</td><td>인스트론 코퍼레이션</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3d 하이드로 겔 공사장 공중 발판

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

인간의 관절 연골은 손상에 매우 취약하며 자가 복구 및 재생 가능성이 제한적입니다. 연골 조직을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 전략은 관절 연골을 복구할 수 있는 유망한 솔루션을 제공합니다. 조직 복구를 위한 최적의 세포 공급원을 선택하기 위해서는 다양한 세포 공급원에 의한 조직 공학 연골의 생물학적, 생체역학적 차이를 체계적으로 조사할 수 있는 적절한 배양 플랫폼을 개발하는 것이 중요합니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체모방 하이드로겔 배양 플랫폼을 적용하여 소아, 성인, 골관절염(OA) 연골세포의 연골 재생 가능성을 체계적으로 조사했습니다. 3D 생체모방 하이드로겔은 합성 성분인 폴리(에틸렌 글리콜)와 생리 활성 성분인 콘드로이틴 설페이트로 구성되어 있으며, 이는 연골 세포의 체외 배양을 위한 생리학적으로 관련된 미세환경을 제공합니다. 또한, 골격은 생체 내에서 연골 복구를 위한 세포 전달에 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 골격에서 조작된 연골 조직은 정량적 유전자 발현, 면역형광 염색, 생화학 분석 및 기계적 테스트를 사용하여 평가할 수 있습니다. 이러한 결과를 활용하여 유전자 발현 수준과 조작된 연골 조직의 생화학적 및 생체역학적 특성 모두에서 다양한 연령의 연골 세포의 차등 재생 잠재력을 특성화할 수 있었습니다. 3D 배양 모델은 정상 또는 비정상 발달의 서로 다른 단계에서 연골 세포와 전구 세포 간의 분자 및 기능적 차이를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

PEG 및 CS 부분 (그림 1)를 포함하는 생리 활성 하이드로 겔은 인간의 관절 연골 세포의 2,3,5,7의 문화와 성숙을위한 이상적인 플랫폼을 나타냅니다. 다양한 연령 및 질환 상태에서 연골 세포는 배양 한 방법 및 그 표현형, 유전자 발현 및 생성 된 연골 조직의 생화학 적 및 기계적 성질에 대해 분석 할 수있다. 세 연골 세포 샘플, juvenile- 6개월, adult- 34년 및 osteoarthritic- 74년는 3D 생체 모방 히드로 겔 문화 3 주 후에 수확했다. 유전자 발현이 정상 연골, 청소년 및 성인 둘 분석, 연골 세포 및 유전자 Col2a1 Col6a1의 발현 증가를 보였다. Col6a1 (도 2)의 발현을 유지 유리한 생체 모방 환경에서 배양 표현형 불구 연골의 손실을 표시하는 동안 반대로, 병든 연골 Col2a1의 극적인 감소를 나타내었다. CS-PEG 하이드로 겔은 또한, 연골 세포가 증식하는 동적 환경 역할 PEG 및 CS의 기존 매트릭스를 소화하고 그들의 pericellular 및 세포 외 기질, 성숙한 연골 조직의 주성분을 침착. 체외 배양 3 주 후 연골 세포의 확장, 이러한 능력을 감안할 때이 Picogreen 염료와 DNA의 정량에 의해 추정 할 수있다. 세포의 세 그룹의 비교 분석은 OA 연골 세포는 배양 1 일째에 비해 극적으로 감소 발휘하면서 청소년 및 성인 인구의 셀 밀도는 변하지 것을 보여준다. DNA 함량의 감소는 장기 배양 (도 3) 중에 가능한 세포 사멸을 시사 다른 OA 연골 위해 아니지만 관찰되었다. 분비 매트릭스는 배양 3 주 후에 종료점 단계 DMMB 염료 결합 분석하여 설페이트 화 - GAG 함량으로 정량 하였다. GAG 컨텐츠 recor 같은 하이드로 겔의 습윤 중량을 기준으로 규격화DED 효소 소화와 무 세포 기여 전에 뺀다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 연골 세포는 하이드로 겔의 3 차원 배양 3 주 동안 GAG 유사한 상당한 양의 증착. 물리적 골격의 존재는 일축 압축 시험의 2,3를 통해 샘플의 생체 역학적 특성의 평가를 할 수 있습니다. 무 세포 하이드로 겔은 압축 계수의 감소를 겪는 동안, 세포 - 라덴 구조는 문화 3 주 (그림 4) 후 압축 계수를 유지했다. 표현형, 여기에 설명 된 생화학 및 생 역학적 분석 평가 및 엔지니어링 연골에 대해 서로 다른 연골 세포 인구의 잠재력을 이해 때문에 유용하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> 3D의 연골 세포의 막 다른 1. PEG-CS 생체 모방 하이드로 겔 그림스트럭처. 연골 세포는 폴리 (에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트) (PEGDA) 콘드로이틴 설페이트 - 메타 크릴 레이트 (CS-MA) 및 주문 제작 겔 원통형 금형에 캐스팅을 포함하는 혼합물에 재현 탁된다. 자외선 노출 후, 젤은 금형에서 수집 및 세포 생존 라이브 죽은 염색 24 시간 후 캡슐에 의해 평가된다 응고. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> 그림 3D 생체 모방 하이드로 겔에서 배양 된 연골 세포에서 연골 유전자의 2 식입니다. 3D 생체 모방 히드로 겔 문화 3 주 후에 청소년, 성인 및 OA 연골 세포로 연골 마커 Col2a1 및 Col6a1의 정량적 유전자 발현. 값이 1 일 때 오류 B에서 유전자 발현 수준으로 정상화된다ARS는 평균 ± SD 나타냅니다. * P는 &lt;양측 &#39;학생의 t 분포&#39;에 의해 결정되는 바와 같이, 0.05. Smeriglio 등에서 수정. (2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> 3D 생체 모방 하이드로 겔에서 배양 된 연골 세포 그림 3. DNA 콘텐츠. 3D 생체 모방 히드로 겔 문화 3 주 후에 청소년, 성인 및 골관절염 연골 세포에서 Picogreen 분석에 의한 DNA 정량. 값은 하루 1에서 DNA 수준으로 정상화되는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;BR /&gt; 그림 4. 개그 콘텐츠 측정 및 1 일에서 3 차원 생체 모방 히드로 겔 문화 3 주 후에 인간의 연골 세포의 일축 압축 시험. 1 일에서 연골 세포와 문화 3 주 후에 DMMB 분석에 의해 (A) 개그 정량 3D 생체 모방 하이드로 겔. 값은 무게 (전주) 적시에 정규화 및 μg의 / G로 표시됩니다. 하루에 1에서와 3D 생체 모방 히드로 겔 문화 3 주 후에 무 세포 및 세포 함유 하이드로 겔의 (B) 압축 계수 (kPa의). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a>

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

이 절차의 전반적인 목표는 3D 생체 모방 하이드로젤 배양을 수행하여 관절 연골 세포를 증식시키고 인간 관절 연골을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 전체 무릎 관절 치환술을 통해 얻은 대퇴골 과를 해부하고, 하연골골에서 연골 조직을 제거한 후, 효소 분해를 통해 세포외 기질로부터 연골 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 생체 모방 하이드로젤 제작을 위해 콘드로이틴 황산 메타크릴레이트 폴리머를 합성하는 것입니다.다음으로, 연골세포를 3D 생체모방 하이드로젤 내에 캡슐화하고, 제작된 구조체를 in vitro에서 3~6주 동안 배양합니다. 최종적으로 생화학적 및 기계적 테스트를 모두 사용하여 관절 연골세포의 성장과 성숙을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 연골세포 배양을 위해 3D 생체모방 하이드로젤 플랫폼을 활용하는 주요 장점은 연골의 천연 성분들을 포함하고 있어 생리학적으로 유의미한 미세환경을 제공한다는 점입니다.이는 연골세포가 더 오랜 기간 동안 생리와 표현형을 유지할 수 있다는 장점이 됩니다. 3차원 매트릭스 하이드로젤에 생체활성 폴리머인 콘드로이틴 표면을 포함함으로써 연골세포 매개 매트릭스 분해 전환이 가능해집니다. 또한, 하이드로젤 매트릭스의 기계적 및 생화학적 특성을 쉽게 수정할 수 있습니다.이 기술은 세포 표현형 및 기능적 결과를 평가하는 기존의 분석법과 호환됩니다. 또한 고령의 질환 단계와 관련된 연골세포의 고유 특성을 연구하고, 생리학적 맥락에서 세포 성숙도 및 재생 잠재력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 우선, 전슬관절 치환술 과정에서 일반적으로 폐기되는 신선한 연골 조직을 사용하여, 125 units/mL의 collagenase two 1부분과 160 units/mL의 collagenase four 1부분을 연골 성장 배지에 혼합하여 해리 배지를 준비하십시오.멸균된 메스를 사용하여 대퇴골 과부의 매끄러운 표면에서 생검 조직을 채취합니다. 그다음 생검 조직을 얇게 슬라이스합니다. 부피비 1:3의 비율로 연골 슬라이스를 혼합 해리 배지에 추가하고, 배양 접시를 37 °C에서 하룻밤 동안 두어 다음 날 세포외 기질로부터 연골세포가 방출되도록 합니다.해리된 세포가 포함된 소화된 조직을 70 micron 공극 크기의 나일론 메쉬로 여과합니다. 그 다음, 미리 데워둔 20 milliliters의 D-M-E-M-F 12 배지로 세포를 두 번 세척하고 600 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 이어서 hemocytometer 플레이트를 사용하여 분리된 연골세포의 수를 측정합니다.1 million 개의 세포를 60 millimeter 배양 접시에 분주하고 보충제가 첨가된 D-M-E-M-F 12 배지로 덮어줍니다. 표준 배양 기술에 따라 일차 연골세포 배양물을 고밀도 단층으로 유지합니다. 200 milliliters의 탈이온수에 1.952 grams의 2-morpholinoethanesulfonic acid와 5.84 grams의 sodium chloride를 첨가하고, 용액이 완전히 용해될 때까지 교반하여 chondroitin sulfate methacrylate를 합성합니다.다음으로, 완충 용액에 콘드로이틴 황산 나트륨염 5g을 녹입니다. 그런 다음 N-hydroxy CIN amide 0.532g과 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride 1.771g을 용액에 첨가하고 5분 동안 교반합니다. 성분들이 용해되면 2-aminoethyl methacrylate 0.765g을 용액에 첨가하고, 알루미늄 호일로 덮어 상온에서 24시간 동안 반응을 유지합니다.12~14 kilodalton 분자량 컷오프 투석 튜브를 사용하여 4일 동안 탈이온수로 최종 혼합물을 투석하여 정제합니다. 그 후, 정제된 용액을 0.22 micron 필터로 여과하고 minus 20 degrees Celsius에서 냉동합니다. 용액이 담긴 열린 튜브를 데시케이터에 넣습니다.알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단하고 하룻밤 동안 진공 상태를 유지하십시오. 용해된 폴리머는 세포 캡슐화 전날, 빛과 습기로부터 보호하기 위해 파라필름과 호일로 감싸 Falcon 튜브에 넣고 -20 °C에서 보관하십시오. 배양된 세포에서 배지를 제거하고 세포를 해리 배지로 덮으십시오.세포를 콜라게나제 용액에 넣어 37°C에서 하룻밤 동안 배양하고, 오토클레이브 PCR 필름과 원통형 로드를 멸균합니다. 그다음, 맞춤 제작된 원통형 겔 몰드를 조직 배양 후드 내 UV 광선 아래에서 0.2 µm 필터링된 70% 에탄올에 담가 하룻밤 동안 멸균합니다. 다음 날, 에탄올에서 몰드를 꺼내 조직 배양 후드 내에서 건조시킵니다. 이후 몰드를 멸균된 150 mm 플레이트에 넣습니다. 건조가 완료되면 오토클레이브 PCR 필름을 사용하여 몰드의 바닥을 밀봉합니다.누출을 방지하기 위해 기포나 빈 공간이 생기지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 50 milliliter 튜브를 준비하여 미리 제조한 chondroitin sulfate methacrylate 10%, polyethylene glycol di acrl 10%, 그리고 DPBS 내 weight per volume 5%의 Photo initiator를 각각 최종 농도가 3%, 5%, 0.05%가 되도록 첨가하십시오.튜브를 빛으로부터 차단하고 혼합물을 짧게 볼텍싱합니다. 해리된 세포를 50 milliliter falcon tube에 수집한 다음, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 460 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하고, 이를 혼합 겔 물질에 15 million cells/mL 밀도로 재현탁합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며 용액을 30회 혼합합니다. 그다음, 세포 하이드로젤 현탁액 또는 하이드로젤 단독으로 72 µL를 맞춤 제작된 원통형 젤 몰드에 피펫팅합니다. 365 nm UV 광선을 3 mW/cm² 세기로 5분간 조사하여 젤화를 유도합니다.젤화가 완료되면, 메스로 필름을 절개하여 조심스럽게 제거합니다. 원통형 막대를 이용하여 젤을 5 mL의 멸균 DPBS가 담긴 6-웰 플레이트로 밀어내어, 중합되지 않은 잔여 젤과 부유 세포를 씻어냅니다. 그 다음, 세척된 하이드로젤을 1.5 mL의 Chondra site 성장 배지가 각각 담긴 24-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.하이드로젤을 37°C에서 배양하고 이틀마다 배지를 교체합니다. 캡슐화 24시간 후, 표준 기술을 이용한 live dead 염색으로 세포 생존율을 평가합니다. 세포가 포함된 하이드로젤과 빈 하이드로젤을 수확 및 분석 전까지 3~6주 동안 배양합니다. 원하는 기간의 in vitro 배양이 완료되면, 세포 하이드로젤 스캐폴드와 무세포 대조군 하이드로젤의 압축 시험을 수행하기 위해 샘플을 인큐베이터에서 꺼냅니다.샘플을 하나씩 상온에서 10 Newton 로드셀이 장착된 기계적 시험 시스템의 PBS 배스 위에 놓습니다. 초당 1% 변형률의 속도로 최대 15% 변형률까지 압축합니다. 기계적 시험을 분석하기 위해, 각 샘플에 대한 응력-변형률 곡선을 생성하고 곡선 적합(curve fit)을 수행합니다. 3차 다항식을 사용하여, 변형률 15% 값에서의 곡선 적합 방정식으로부터 압축 접선 탄성계수를 결정합니다. 3D 생체모방 하이드로젤에서 3주간 배양한 후, 소아 및 성인의 정상 연골세포에 대한 유전자 발현 분석 결과, 연골세포 유전자인 collagen two A one 및 collagen six A one의 발현 증가가 나타났습니다. 반대로, 질환이 있는 연골세포는 collagen six A one의 발현은 유지하면서 collagen two A one의 발현이 급격히 감소하여, 유리한 생체모방 환경에서 배양되었음에도 불구하고 연골세포 표현형의 손실을 보였습니다.3주간의 배양 후 chondrocyte 확장은 pico green 염료를 이용한 DNA 정량으로 추정할 수 있습니다. 세 그룹의 세포에 대한 비교 분석 결과, juvenile 및 adult 세포군의 세포 밀도는 변화가 없었던 반면, osteoarthritic chondrocyte는 배양 1일 차에 비해 급격한 감소를 보였습니다. 분비된 chondrocyte matrix는 3주간의 배양 후 sulfated GAG 함량으로 정량하였습니다.여기서 보는 바와 같이, 연골세포는 3주간의 배양 기간 동안 상당한 양의 gag를 침착시켰으며, 이는 대조군과 비교하여 세포 함유 하이드로젤의 기계적 특성이 향상되는 데 기여했을 수 있습니다. 개별 연구에 이 절차를 적용하는 것 외에도, 이 3D 생체 모방 하이드로젤 배양 모델은 전층 연골 결손 모델로 쉽게 전환될 수 있으며, 장기적인 관절 연골 재생의 기능적 및 생화학적 결과를 특성화하는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 무릎 관절 표본에서 인간 연골세포를 분리하고, 장기적인 연골 배양 및 연골 생성물을 위한 3차원 하이드로젤 스캐폴드를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 3D OME 하이드로젤의 활용을 통해 본 연구진과 다른 연구자들은 다양한 성숙 연골세포 집단뿐만 아니라 새로운 줄기세포 및 전구세포 집단의 연골 형성 잠재력을 비교할 수 있을 것입니다.향후 이러한 기술을 확장하여 추가적인 모사 인자들을 통합함으로써, 연골 재생 및 복구에 활용될 수 있는 최적의 스캐폴드를 구성할 수 있을 것입니다.

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이 문서에 설명 된 방법은 동시 UV 중합과 bioprinter에 상용 잉크젯 프린터로 변환하는 방법을 보여줍니다. 프린터는 세포 및 생체 재료와 3 차원 조직 구조를 구축 할 수있다. 여기에 설명이 연구는 3D neocartilage을 건설했다.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

이질적인 세포 집단을 가진 하중지지 조직의 엔지니어링 및 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 하나의 구조 내에서 다양한 세포 집단의 공동 배양을 위한 플랫폼으로서 이중층 알기네이트 하이드로겔 디스크를 만드는 방법을 설명합니다.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

여기는 키토 산 기반의 주 사용 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 손쉬운 준비에 설명 합니다. 하이드로 겔의 기계적 강도 및 3D 세포 배양에서의 응용 프로그램을 조정 하는 방법은 제시 하는.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

우리는 인간 무릎 관절의 연골, 뼈, 지방 패드 및 활막을 재현하는 데 사용되는 인간 중간엽 줄기 세포에서 4가지 유형의 조직을 생성하는 자세한 방법을 제공합니다. 이 4 개의 조직은 맞춤형 생물 반응기에 통합되고 미세 유체를 통해 연결되어 무릎 관절 온 칩을 생성합니다.

관절 질환 모델링 및 약물 테스트를 위한 무릎 관절 칩 생성

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

배우세요 3D 바이오모방 하이드로겔을 이용한 관절 연골 세포 배양 및 연골 생성 방법입니다. 이 기술은 생리학적 미세환경에서 연골 세포의 생리와 표현형을 유지하여 재생의학 연구에 활용됩니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

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