November 25th, 2015
이 프로토콜은 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하고 형광 역학 측정을 사용하여 테스트하는 방법을 설명합니다. 게이트는 공식 화학 반응 네트워크(CRN)의 동작을 근사화하기 위해 다중 구성 요소 시스템으로 모듈식으로 구성될 수 있으며, 이는 분자 프로그래밍 언어로서 CRN의 새로운 용도를 보여줍니다.
이 절차의 전반적인 목표는 박테리아 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 박테리아 플라스미드를 매우 순수한 소스로 사용하여 강력한 DNA 게이트를 생성한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 저의 동료인 Sam Dip과 저가 될 것입니다: 대량 생산을 시작한 다음 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 그리고 엘루시안에 따른 제조업체의 지침에 따라 DNA 분리 키트를 사용하여 DNA 게이트를 포함하는 격리를 시작합니다.
표준 기법을 사용하여 플라스미드 DNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 플라스미드 1mg에 대해 제한 효소 PV U2 HF 4개 단위를 추가하여 DNA를 분해합니다. 다음으로, 두 개의 등가 부피의 얼음처럼 차가운 절대 에탄올을 샘플에 추가합니다.
DNA를 침전시키기 위해 최소 1시간 동안 섭씨 영하 80도에서 혼합물을 배양합니다. 다음 10, 000에서 14, 000 시간 G 및 30 분 동안 0 섭씨 온도에 표본을 원심 분리해서 침전된 DNA를 펠릿으로 만드십시오. SNAT를 제거하고 1000마이크로리터의 실온 95% 에탄올을 샘플에 추가합니다.
그런 다음 샘플을 10-15회 다음으로 뒤집고 10분 동안 10, 000-14, 000배 G 및 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리하십시오. 완료되면 상층액을 제거하고 벤치에서 10-20분 동안 DNA를 자연 건조합니다. 침전된 DNA에서 상등액을 제거할 때 펠릿을 방해하지 않도록 주의하거나 수율이 크게 감소합니다.
건조되면 DNA 펠릿을 최대 200마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물과 와류에 현탁시켜 혼합합니다. 200마이크로리터 이상의 물을 추가하면 일반적으로 샘플을 희석하여 사용할 수 있습니다. 동역학 실험에서는 제조업체의 지침에 따라 분광 광도계를 사용하여 재현탁된 DNA를 측정합니다.
그런 다음 플라스미드 1마이크로그램당 1개씩 니킹 효소 M-B-B-S-R-D 4단위를 추가하고 해당 효소 완충액을 추가합니다. 샘플을 섭씨 65도에서 1시간 동안 배양하여 조인트 게이트를 소화합니다. 다음으로, 플라스미드 1마이크로그램당 1개의 니킹 효소 NT BST mb 8단위와 해당 효소 완충액을 추가하여 포크 게이트를 분해합니다.
샘플을 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. 형광 리포터를 준비하기 위해 먼저 Resus를 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 현탁 및 정량화합니다. 그런 다음 리포터의 하단 가닥 10마이크로리터를 트리스 아세테이트 EDTA 완충액의 상단 담금질 가닥 13마이크로리터와 12.5밀리몰의 마그네슘과 혼합합니다.
모든 세균총, 4개의 표지된 가닥이 담금질되도록 하려면 담금질제 표지된 가닥의 30%를 초과하여 첨가해야 합니다. 다음으로, 열 순환기를 사용하여 리포터 C 복합체를 anil합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 섭씨 20도까지 분당 섭씨 1도의 속도로 냉각합니다.
완료되면 보정 후 샘플을 섭씨 4도에서 보관했습니다. 온도가 안정화되는 동안 먼저 온도 조절기를 섭씨 25도로 설정하여 형광 측정을 시작합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 kinetics 측정을 위한 적절한 파라미터를 설정합니다.
분광 형광계용 소프트웨어를 연 후 여기 및 방출 흑백 모두에 대해 슬립 폭을 2.73나노미터로 설정합니다. 그런 다음 매 62번째 시점마다 적분 시간을 10초로 설정하고 총 측정 시간을 24시간으로 설정합니다. 마지막으로, 실험에 사용된 식물 숲과 일치하도록 excitation 및 emission 파장을 설정합니다.
다음으로, 410.2 마이크로리터의 뉴클레아제 자유 물과 125 밀리몰의 마그네슘을 함유한 52.8 마이크로리터의 10 엑스트라 아세테이트 EDTA 버퍼를 합성 석영 셀에 추가합니다. 또한 2 마이크로 리터의 300 밀리 몰 폴리 T 가닥을 추가 한 다음 10-15 초 동안 합성 석영 셀을 소용돌이칩니다. 다음으로, 9 마이크로 리터의 리포터 가닥은 10 마이크로 몰에서, 각 보조 가닥은 10 마이크로 몰에서 6 마이크로 리터입니다.
그런 다음 45 마이크로 리터의 조인트 게이트와 포크 게이트에서 하나의 마이크로 몰로 용액을 위아래로 최소 20 회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 마지막으로, 10 % 나트륨의 9 마이크로 리터에서 0.15 % SDS의 최종 농도를 달성하기 위해 덕트 황산염을 수행하고 최소 20 회 위아래로 피펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합하고 즉시 합성 석영 셀을 스펙트럼 플루터의 챔버에 넣고 역학 측정을 시작합니다. 5분 동안 측정한 후 3마이크로리터의 입력 가닥을 추가합니다.
합성 쿼트 셀에 10 마이크로몰을 추가합니다. 데이터 수집 프로그램이 일시 중지된 동안 최소 20회 이상 위아래로 피펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합한 다음 광 커버를 닫고 안정될 때까지 반응 역학을 계속 기록합니다. 플라즈마 유래 게이트와 합성된 게이트에 대한 상태 역학 데이터가 여기에 실험에 나와 있습니다.
신호 가닥 A의 농도는 고정되어 있고 촉매 신호 B의 양은 변합니다. 신호 C는 중단 없이 반응의 진행 상황을 판독하는 데 사용됩니다. 촉매 사이클 회전율은 주어진 시간에 각 촉매 B에 대해 생성된 신호 C의 양으로 정의됩니다.
이상적인 촉매 시스템의 경우, 이 회전율 수치는 시간이 지남에 따라 선형적으로 증가해야 하며 기판이 제한되지 않는 한 촉매의 양과 무관해야 합니다. 여기서 합성된 시스템은 플라즈마 파생 시스템보다 훨씬 일찍 회전율의 이상적인 선형 증가에서 벗어나는 것이 관찰되며, 이는 바람직하지 않은 부반응을 통한 촉매의 격리를 나타냅니다. 여기에서 플라즈마 파생 게이트와 합성된 게이트의 회로 누설을 비교하며, 플라즈마 파생 게이트를 사용한 누출 신호의 비율은 반응 10시간 후 합성된 게이트를 사용한 누출 신호보다 약 8% 적은 것으로 관찰되었습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 박테리아 플라스미드에서 강력한 DNA 게이트를 생성하고 형광 역학 측정을 사용하여 게이트를 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 프로토콜은 박테리아 플라스미드로부터 DNA 가닥 변위 게이트를 파생하고 이를 형광 동력학 측정을 통해 테스트하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 게이트를 다중 구성 요소 시스템으로 모듈식으로 구성하고 공식 화학 반응 네트워크의 동작을 시뮬레이션할 수 있습니다.
Plasmid-derived DNA strand displacement gates enable scalable, high-fidelity production of programmable DNA components for molecular computation and synthetic biology. This approach addresses the need for robust, reproducible DNA materials in the construction of chemical reaction networks (CRNs) and molecular devices. The method enhances predictive confidence and operational reliability at the interface of discovery biology and molecular engineering.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying robust DNA gates for hypothesis testing, assay development, and molecular network engineering.