Name: 플라스미드 유래 구현 화학 반응 네트워크 용 DNA 가닥 변위 게이츠 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 학습하세요 박테리아 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하고 형광 동역학 측정으로 테스트하는 방법을. 이 기술은 순수한 DNA 소스를 활용하여 강력한 게이트를 생성하며 합성 게이트보다 회로 누출이 적고 촉매 순환 회전율이 더 안정적입니다.

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도 1, 2, 3, 4, 6, 8, 표 2, 3, 10, 15, 16은 참조 번호 (29)에서 수정된다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다 (NSF-CCF 1,117,143 및 GS에 NSF-CCF 1162141을 부여). Y.-JC는 대만 정부 동호회에 의해 지원되었다. SDR은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 활동 프로그램 (GRFP)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
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<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
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<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
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<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+E.+coli+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li>
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<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문은 고순도의 플라스미드 DNA에서 ndsDNA 게이트를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 형광 동력학 분석을 이용하여 게이트의 성능을 특징으로 제시된다. 실험 데이터는 합성 시스템은 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)을 이용하여 정제 가닥 조립 되더라도 플라스미드 유래 된 시스템의 성능을 능가 합성 대응을 보여준다. 가능성, 플라스미드 유래 게이트의 향상된 성능은 생물학적 DNA의 매우 높은 순도에 주로 기인한다. 합성 DNA는 일반적으로 완전히 PAGE 또는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 정제 과정에서 제거되지 않은 길이 n-1, 및 부 생성물의 발생, 특히 올리고 뉴클레오티드의 결실 다양한 오류를 포함한다. 여기에보고 된 것과 유사한 개선은 또한 생물학적 소스 (21)로부터 유래 된 DNA를 사용하는 촉매 헤어핀 증폭기의 이전 연구에서 관찰되었다. <p cl엉덩이 = &quot;jove_content&quot;&gt; 그러나, 플라스미드 유래의 게이트에도 사용이 완전히 적어도 두 가지 이유가있는 게이트 성능 오차 제거 할 수 너무 많은와 게이트에 이어질 수있는 제 오버 분해 또는 절단 정밀도 부족 잘못된 위치에 흠이나 흠. 두 경우 모두, 게이트는 바람직하지 않은 반응에 참여할 가능성이 높습니다. 이러한 문제점은 사용 된 효소의 양 (도 4 참조)의 최적화에 의해 완화 될 수있다. 둘째,이 실험에서 대부분의 입력과 보조 가닥 합성 DNA이었다 따라서 삭제 및 돌연변이가 포함되어 있습니다. 원칙적으로, 모든 단일 가닥 및 보조 입력 스트랜드는 또한 사전 부호화 M13 바이러스 게놈 (26)의 칼자국을내는 효소 절단을 통해 파지 미드 DNA로부터 수득 될 수있다. 아마도 회로 성능은 또한 세균 유래의 게놈을 ssDNA를 사용하여 향상시킬 수있다. 플라스미드 유래 게이트의 사용은 회로 성능을 개선하는 것으로 확인되었지만, 분석비용과 처리 시간의 플라스미드 유래 게이트의 생산이 다소 저렴 (표 15)이지만, 상업적으로 합성 올리고 (표 16)에서 조립 및 게이트의 정화에 비해 처리 시간이 2 ~ 3 배 더 오래 걸립니다 것으로 나타났다. 플라스미드 유래 게이트의 기본 비용 유전자 합성 및 제한 효소의 사용이다. (30 nm에서 15 반응에 대한 충분한) 게이트의 300 pmole의 경우, 게이트에 참여하기위한 예상 비용 때문에 다른 새김 효소의 사용으로 약 $ 170, 포크 게이트되는 비용 차이에 대한 $ 200. 대조적으로, PAGE 정제 비용을 포함해서 약 $ 260 같은 게이트 비용 가닥의 화학적 합성. 플라스미드 유래 게이트 용 기본 시간 비용은 DNA 합성과 마찬가지로 합성 유전자 회사에 아웃소싱 될 수 있고, 클로닝 절차이다. 그러나, 한번 조립 플라스미드 유래의 게이트는 숙주 플라스미드 쉽게 복제 될 수있는 이점을 가지고ND 세균성 글리세롤 주식의 형태로 저장 될 수있다. 이로써 위에 게이트 여러 번 재사용 할 수있다. 기대, 플라스미드 유래 게이트의 향상된 성능을 실험적으로 지금까지 DNA CRNs으로 입증 된 것보다 다이나믹 행동의 훨씬 더 큰 범위를 가능하게 할 수있다. 예를 들어, 최근의 이론적 워크 47, 48은 매크로 스케일에서 자기 조직화 공간 패턴이 반응 확산 장치를 통해 DNA CRNs로 실현 될 수 있음을 제안 하였다. 여기에 제시된 방법은 자기 패터닝 재료 용 DNA 분자 기본 요소를 구성하기위한 가능한 경로를 제공한다. 도전하지만, 프로그래밍 방식으로 매크로 규모의 형태학을 개발하는 것은 생체 재료 연구에서 재생 의학에 이르기까지 다양한 분야에서 상당한 영향을 미칠 것입니다.

왓슨 - 크릭 염기 쌍의 예측은 동적 DNA 나노 기술은 동적 속성 1, 2와 분자 장치를 설계하는 프로그램 방법으로 등장 할 수있다. 특히, DNA 가닥 변위 - 프로그램, 경쟁력 혼성화 반응 - 동적 DNA 시스템 엔지니어링을위한 강력한기구 인 것을 입증했다. DNA의 나선 치환 반응에서, 들어오는 올리고 뉴클레오티드 상보 적 결합 파트너의 결합 이전에 &quot;출력&quot;가닥 변위. 다수의 이러한 반응은 반응 순서 및 개개의 타이밍을 3 단계에 걸쳐 고도의 제어와 다단계 반응 캐스케이드로 서로 연결된다. DNA 나선 치환 캐스케이드은 디지털 및 아날로그 회로 분자 4-7, 8-10 나노 전환, 자율 분자 모터 11-15 및 비공유 증폭기 13,16-21 촉매를 생성하는데 사용되어왔다. 또한, D가닥 치환 반응을 사용하여 NA 디바이스 시뮬레이션 및 컴퓨터 보조 설계 소프트웨어를 사용하여 22-24의 다양한 애플리케이션을 위해 설계 될 수있다. 현재, 화학​​적으로 합성 된 DNA는 DNA 나노 기술의 주요 재료로 작용한다. 그러나, DNA 합성 과정에서 오류 및 결과 불완전한 올리고 뉴클레오티드, 잘못된 부반응시킴으로써 DNA 동적 장치의 성능을 제한하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, &quot;누설&quot;반응에도 반응 트리거 부재 출력 올리고 뉴클레오타이드의 방출을 초래할 수있다. 이러한 효과는 초기 누출의 경우에도 최소한 결국 캐스케이드 (19, 20)의 전체 활성화가 발생합니다 촉매 반응 계곡에서 가장 명백하다. 반대로, 반응은 종종 일부 구성도 의도 입력 7,25의 존재하에 유발하지 않기 때문에 활성화 기대 수준에 도달하지 못한다. 의 성능을 확인하기 위해 DNA를 기반생물학적 단백질 기반 대상에 필적 나노 소자는, 예컨대 에러 모드 대폭 저감 할 필요가있다. 세균의 플라스미드 또는 다른 생물학적 DNA는 나노 기술 응용 프로그램을위한 고순도의 DNA의 상대적으로 저렴한 소스의 역할을 할 수있다. 많은 양의 DNA가 박테리아에서 복제함으로써 생성 될 수 있고, 생명체의 극한 교정 능력 얻어진 DNA의 순도를 보장한다. 사실, 몇 가지 최근의 논문은 나노 기술 응용 21,26-28에 대한 생물학적 DNA의 잠재적 인 유틸리티를 인정했다. 그러나, 플라스미드 DNA의 완전 이중 가닥 특성은 지금까지 일반적으로 다수의 올리고 뉴클레오티드로 구성되며, 이중 가닥과 단일 가닥 영역 모두를 포함하는 DNA 동적 장치를 제조하기위한 재료로서 사용을 금지하고있다. 최근 종이 (29)이 문제가 해결되었고, 주로 흠 이중 가닥 DNA (ndsDNA)로 구성되어 새로운 DNA 게이트 구조에서 소개했다디. 중요한 ndsDNA 게이트 시스템은 임의의 형식적인 화학 반응 네트워크 (CRN) (29)에 의해 지정된 역학을 실현하는 설계 될 수있다. ndsDNA 게이트 따라서 진동과 혼란, 쌍 안정성 및 메모리, 부울 논리 또는 알고리즘 행동 30-38을 나타내는 동적 시스템을 만들 원칙적으로 사용될 수있다. 예를 들어, 참조 번호. 29 &quot;합의&quot;프로토콜의 구현 분자량, 분산 컴퓨팅 29,39,40 알고리즘의 타입을 제공하는 세 CRN 반응을 보여 주었다. 이 작품은 처음 빠르게 기능 분자 시스템을 (그림 1A)를 합성하는 &quot;프로그래밍 언어&quot;로 CRN의 형식주의에 대한 새로운 사용을 보여 주었다. 여기서, 플라스미드 DNA에서 ndsDNA 게이트를 유도 상세한 프로토콜이 제공된다. 먼저 시퀀스 설계 프로세스를 검토한다. 그런 다음이 포함 방법 합성 올리고 뉴클레오티드에 대한 설명을 다음과게이트 서열은 플라스미드에 클로닝하고 서열을 확인 및 세균 배양을 통해 증폭. ndsDNA 게이트가 효소 처리에 의해 플라스미드로부터 유도 될 수있는 방법 다음에,이 도시되어있다 (도 2 참조). 마지막으로, 형광 역학 분석을 이용하여 게이트 작동을 테스트하는 방법이 요약되어있다. 반응 메커니즘 예로서, 프로토콜은 촉매 화학 반응 A + B-&gt; B + C에 초점을 맞춘다. 종 A, B, 및 C ( &quot;신호&quot;,도 1b)가 다른 모든 단일 가닥 DNA 분자에 대응한다. 이들 분자의 서열과 완전히 무관 한 가닥은 서로 직접 반응하지 않는다. 모든 신호들의 시퀀스, 즉 두 개의 다른 기능 영역, 나선 치환 반응에서 함께 작용 시퀀스 : 1)으로 발 짧은 도메인 (나선 치환 라벨 (R)의 개시를 위해 사용되며, TB, TC) TAeaction, 2) 긴 도메인 (를 A, B, C) 즉, 신호 식별을 결정 라벨. 신호 가닥 사이의 상호 작용은 흠 이중 가닥 DNA (ndsDNA) 게이트 단지로 및 보조 단일 가닥 종 (&lt;TR R&gt;, &lt;TB C&gt;와 &lt;TR B&gt; &lt;I TC (라고 AB와 포크 기원전 가입) 매개되는 &gt;). + B-&gt; B + C 공식 반응은 각각의 반응 단계가 후속 반응 (도 1b) 용으로 발을 노출 나선 치환 반응 단계들의 시리즈를 통해 실행된다. 신호 C는 포크 게이트에 결합 된 상태에서이 예에서, 신호 A와 B는 초기 용액에 자유 롭다. 반응 B와 C의 끝에 용액이다. 보다 일반적으로, 게이트에 결합되는 신호들은 용액에서 자유롭게 신호가 활성화되어있는 동안, 즉, 그들이 나선 치환 반응에 참여할 수있는 등의 비활성입력. 반응 시간 코스는 형광 리포터 전략 (도 1C)를 사용하여 이어진다. 이전의 연구 (29)에,이 반응 메커니즘은 정확한 화학량뿐만 아니라 대상의 반응 속도론을 행하게하는 것이 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>Phusion 고충실도 PCR 마스터 믹스, HF 버퍼</td><td>NEB</td><td>M0531S,</td><td></td></tr><tr><td>PVUII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L,</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S,</td><td></td></tr><tr><td>깁슨 어셈블리 마스터 믹스</td>, <td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>훌륭한 육수, 변성</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 미니프렙 키트 (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-Prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이중 가닥 게놈 블록</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 형광측정기</td><td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>합성 석영 셀&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN 겔 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 백본</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>암피실린 저항성이 있는 고복제 수 플라스미드. 시퀀스는 http://parts.igem.org 에서 찾을 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

플라스미드 유래 구현 화학 반응 네트워크 용 dna 가닥 변위 게이츠

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA 나노 기술은 엔지니어링 재료로서 다량의 고순도 DNA를 필요로 합니다. 플라스미드 DNA는 높은 충실도로 복제되고, 박테리아 배양을 통해 쉽게 증폭되며, 박테리아 글리세롤 스톡의 형태로 무기한 저장될 수 있기 때문에 이러한 요구를 충족할 수 있습니다. 그러나 플라스미드 DNA의 이중 가닥 특성은 지금까지 일반적으로 단일 가닥 또는 분지 도메인을 포함하는 DNA 나노 구조 또는 장치의 구성에 대한 효율적인 사용을 방해했습니다. 최근 연구에서 nicked double stranded DNA(ndsDNA) 가닥 변위 게이트가 플라스미드 DNA에서 공급될 수 있음이 밝혀졌습니다. 다음은 이러한 ndsDNA 게이트가 플라스미드에서 효율적으로 인코딩될 수 있는 방법과 소수의 효소 처리 단계를 통해 플라스미드에서 파생될 수 있는 방법을 자세히 설명하는 프로토콜입니다. 또한 형광 역학 측정을 사용하여 ndsDNA 게이트를 테스트하기 위한 프로토콜도 제공됩니다. NdsDNA 게이트는 임의의 화학 반응 네트워크(CRN)를 구현하는 데 사용할 수 있으므로 CRN 형식주의를 규범적 분자 프로그래밍 언어로 사용할 수 있는 경로를 제공할 수 있습니다. 이 기술을 시연하기 위해 촉매 역학을 사용한 다단계 반응 캐스케이드가 구성됩니다. 또한, 플라스미드 유래 성분이 합성 DNA로부터 조립된 동일한 성분보다 더 우수한 성능을 발휘하는 것으로 나타났습니다.

이 프로토콜은 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하고 형광 역학 측정을 사용하여 테스트하는 방법을 설명합니다. 게이트는 공식 화학 반응 네트워크(CRN)의 동작을 근사화하기 위해 다중 구성 요소 시스템으로 모듈식으로 구성될 수 있으며, 이는 분자 프로그래밍 언어로서 CRN의 새로운 용도를 보여줍니다.

플라스미드 유래 구현 화학 반응 네트워크 용 DNA 가닥 변위 게이츠

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 박테리아 플라스미드를 매우 순수한 소스로 사용하여 강력한 DNA 게이트를 생성한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 저의 동료인 Sam Dip과 저가 될 것입니다: 대량 생산을 시작한 다음 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 그리고 엘루시안에 따른 제조업체의 지침에 따라 DNA 분리 키트를 사용하여 DNA 게이트를 포함하는 격리를 시작합니다.표준 기법을 사용하여 플라스미드 DNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 플라스미드 1mg에 대해 제한 효소 PV U2 HF 4개 단위를 추가하여 DNA를 분해합니다. 다음으로, 두 개의 등가 부피의 얼음처럼 차가운 절대 에탄올을 샘플에 추가합니다.DNA를 침전시키기 위해 최소 1시간 동안 섭씨 영하 80도에서 혼합물을 배양합니다. 다음 10, 000에서 14, 000 시간 G 및 30 분 동안 0 섭씨 온도에 표본을 원심 분리해서 침전된 DNA를 펠릿으로 만드십시오. SNAT를 제거하고 1000마이크로리터의 실온 95% 에탄올을 샘플에 추가합니다.그런 다음 샘플을 10-15회 다음으로 뒤집고 10분 동안 10, 000-14, 000배 G 및 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리하십시오. 완료되면 상층액을 제거하고 벤치에서 10-20분 동안 DNA를 자연 건조합니다. 침전된 DNA에서 상등액을 제거할 때 펠릿을 방해하지 않도록 주의하거나 수율이 크게 감소합니다.건조되면 DNA 펠릿을 최대 200마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물과 와류에 현탁시켜 혼합합니다. 200마이크로리터 이상의 물을 추가하면 일반적으로 샘플을 희석하여 사용할 수 있습니다. 동역학 실험에서는 제조업체의 지침에 따라 분광 광도계를 사용하여 재현탁된 DNA를 측정합니다.그런 다음 플라스미드 1마이크로그램당 1개씩 니킹 효소 M-B-B-S-R-D 4단위를 추가하고 해당 효소 완충액을 추가합니다. 샘플을 섭씨 65도에서 1시간 동안 배양하여 조인트 게이트를 소화합니다. 다음으로, 플라스미드 1마이크로그램당 1개의 니킹 효소 NT BST mb 8단위와 해당 효소 완충액을 추가하여 포크 게이트를 분해합니다.샘플을 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. 형광 리포터를 준비하기 위해 먼저 Resus를 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 현탁 및 정량화합니다. 그런 다음 리포터의 하단 가닥 10마이크로리터를 트리스 아세테이트 EDTA 완충액의 상단 담금질 가닥 13마이크로리터와 12.5밀리몰의 마그네슘과 혼합합니다.모든 세균총, 4개의 표지된 가닥이 담금질되도록 하려면 담금질제 표지된 가닥의 30%를 초과하여 첨가해야 합니다. 다음으로, 열 순환기를 사용하여 리포터 C 복합체를 anil합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 섭씨 20도까지 분당 섭씨 1도의 속도로 냉각합니다.완료되면 보정 후 샘플을 섭씨 4도에서 보관했습니다. 온도가 안정화되는 동안 먼저 온도 조절기를 섭씨 25도로 설정하여 형광 측정을 시작합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 kinetics 측정을 위한 적절한 파라미터를 설정합니다.분광 형광계용 소프트웨어를 연 후 여기 및 방출 흑백 모두에 대해 슬립 폭을 2.73나노미터로 설정합니다. 그런 다음 매 62번째 시점마다 적분 시간을 10초로 설정하고 총 측정 시간을 24시간으로 설정합니다. 마지막으로, 실험에 사용된 식물 숲과 일치하도록 excitation 및 emission 파장을 설정합니다.다음으로, 410.2 마이크로리터의 뉴클레아제 자유 물과 125 밀리몰의 마그네슘을 함유한 52.8 마이크로리터의 10 엑스트라 아세테이트 EDTA 버퍼를 합성 석영 셀에 추가합니다. 또한 2 마이크로 리터의 300 밀리 몰 폴리 T 가닥을 추가 한 다음 10-15 초 동안 합성 석영 셀을 소용돌이칩니다. 다음으로, 9 마이크로 리터의 리포터 가닥은 10 마이크로 몰에서, 각 보조 가닥은 10 마이크로 몰에서 6 마이크로 리터입니다.그런 다음 45 마이크로 리터의 조인트 게이트와 포크 게이트에서 하나의 마이크로 몰로 용액을 위아래로 최소 20 회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 마지막으로, 10 % 나트륨의 9 마이크로 리터에서 0.15 % SDS의 최종 농도를 달성하기 위해 덕트 황산염을 수행하고 최소 20 회 위아래로 피펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합하고 즉시 합성 석영 셀을 스펙트럼 플루터의 챔버에 넣고 역학 측정을 시작합니다. 5분 동안 측정한 후 3마이크로리터의 입력 가닥을 추가합니다.합성 쿼트 셀에 10 마이크로몰을 추가합니다. 데이터 수집 프로그램이 일시 중지된 동안 최소 20회 이상 위아래로 피펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합한 다음 광 커버를 닫고 안정될 때까지 반응 역학을 계속 기록합니다. 플라즈마 유래 게이트와 합성된 게이트에 대한 상태 역학 데이터가 여기에 실험에 나와 있습니다.신호 가닥 A의 농도는 고정되어 있고 촉매 신호 B의 양은 변합니다. 신호 C는 중단 없이 반응의 진행 상황을 판독하는 데 사용됩니다. 촉매 사이클 회전율은 주어진 시간에 각 촉매 B에 대해 생성된 신호 C의 양으로 정의됩니다.이상적인 촉매 시스템의 경우, 이 회전율 수치는 시간이 지남에 따라 선형적으로 증가해야 하며 기판이 제한되지 않는 한 촉매의 양과 무관해야 합니다. 여기서 합성된 시스템은 플라즈마 파생 시스템보다 훨씬 일찍 회전율의 이상적인 선형 증가에서 벗어나는 것이 관찰되며, 이는 바람직하지 않은 부반응을 통한 촉매의 격리를 나타냅니다. 여기에서 플라즈마 파생 게이트와 합성된 게이트의 회로 누설을 비교하며, 플라즈마 파생 게이트를 사용한 누출 신호의 비율은 반응 10시간 후 합성된 게이트를 사용한 누출 신호보다 약 8% 적은 것으로 관찰되었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 박테리아 플라스미드에서 강력한 DNA 게이트를 생성하고 형광 역학 측정을 사용하여 게이트를 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

DNA 종이 접기 DNA 분자의 자기 조립을 프로그래밍하여 정확한 나노 물체를 제조하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 DNA 종이 접기는 생물학적 신호를 감지하고 모양이 연속적으로 원하는 효과를 전달, 이동하여 응답 할 수있는 로봇 로봇을 설계에 활용 될 수있는 방법에 대해 설명합니다.

DNA 종이 접기에서 바이오 반응 로봇을 설계

맞춤형 플라스미드의 합성은 노동과 시간이 많이 소요됩니다. 이 프로토콜은 맞춤형 DNA 클로닝 절차의 작업과 기간을 줄이기 위해 Gibson 어셈블리 클로닝을 사용하는 방법을 설명합니다. 설명된 프로토콜은 또한 기존의 cut-and-paste DNA 클로닝과 유사한 비용으로 포유류 발현을 위한 신뢰할 수 있는 태그가 지정된 단백질 구조를 생성합니다.

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우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

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여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

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모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

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CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

In vivo assembly는 박테리아의 고유 DNA 복구 효소에 의존하여 상동 재조합에 의한 DNA 단편을 조립하는 결찰 독립적 클로닝 방법입니다. 이 프로토콜은 시약이 거의 필요하지 않고 클로닝 효율이 99%에 달하기 때문에 시간과 비용 면에서 모두 효율적입니다.

고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용

학습하세요 박테리아 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하고 형광 동역학 측정으로 테스트하는 방법을. 이 기술은 순수한 DNA 소스를 활용하여 강력한 게이트를 생성하며 합성 게이트보다 회로 누출이 적고 촉매 순환 회전율이 더 안정적입니다.

플라스미드 유래 구현 화학 반응 네트워크 용 DNA 가닥 변위 게이츠

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