샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적으로 더 관련성이 높은 3D 환경 내에서 세포 거동을 연구하기 위해 샌드위치와 같은 배양물을 조립하는 것입니다. 이것은 먼저 복부 및 등쪽 기질을 준비하고 피브로넥틴과 같은 단백질로 코팅함으로써 수행됩니다. 다음으로, 세포는 표준 2D 배양과 유사하게 배치됩니다.

그런 다음 등쪽 기질이 겹쳐져 세포가 복부 및 배쪽으로 자극됩니다. 마지막으로, 상처 치유 분석법과 같은 실험을 수행할 수 있습니다. 궁극적으로 샌드위치 유사 배양은 라이브 이미징, 면역 형광 또는 세포 추출과 같은 표준 2D 배양을 위해 이미 개발된 절차에 의해 분석됩니다.

추가 분석을 위해. 기존 3차원 시스템에 비해 이 문화 기술의 주요 장점은 복부와 등쪽 부위 모두에서 지형, 화학, 강성 및 단백질 함량과 같은 재료 상호 작용의 다양한 매개변수를 연구할 수 있어 높은 수준의 다양성을 제공한다는 것입니다. 리핀, 면역형광 및 세포 추출과 같은 일부 3차원 시스템에 방해가 될 수 있는 실험 절차 외에도 흄 후드에서 작동하는 솔벤트 주조로 폴리락트산 또는 PLLA의 평판 필름을 생성하기 위해 100밀리리터의 클로로포름에 2g의 PLLA를 첨가하고 실온에서 약 3시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지 교반합니다.

유리 페트리 접시에 스테인리스 스틸 와셔를 놓습니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PLLA 용액을 와셔에 추가합니다. 구멍이 몇 개 있는 알루미늄 호일을 사용하여 접시를 덮고 PLLA를 실온에서 30분 동안 천천히 증발시킵니다.

다음으로, 미량의 용매를 증발시키기 위해 섭씨 120도에서 5분 동안 샘플을 가열합니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 약 30분 동안 식힌 후 18.2메가옴센티미터의 물을 사용하여 접시의 샘플을 덮고 8분 동안 실온에서 배양합니다. 배양 후 면도날을 사용하여 페트리 접시에서 와셔를 떼어냅니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 와셔 가장자리의 결함을 제거하고 샘플을 자연 건조시킵니다. PLLA는 가수분해 저장에 의해 분해될 수 있기 때문에 진공 상태의 샘플은 실험 당일까지 건조됩니다. 또한 ELLA 섬유는 텍스트 프로토콜에 따라 생산할 수 있으며 멸균 배양 후드 아래에서 등쪽 기질로 사용할 수 있습니다.

칼슘 및 마그네슘과 함께 docos PBS 또는 DPBS에 있는 FI 닌 밀리리터당 20마이크로그램을 샘플에 추가하고 단백질 코팅 후 1시간 동안 실온에서 배양합니다. DPBS를 사용하여 샘플을 두 번 세척하고 사용할 준비가 될 때까지 P, 칼슘 및 마그네슘과 함께 DPBS에 보관하고 유리 덮개의 종자 세포를 미끄러뜨리고 세포가 복부 기질에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 12웰 플레이트의 새 웰로 옮깁니다.

핀셋을 사용하여 등쪽 기질을 세포에 조심스럽게 오버레이합니다. 그런 다음 1ml의 매체를 추가합니다. 와셔의 무게는 등쪽 기질이 뜨는 것을 방지합니다.

샘플을 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도로 되돌리고 배지를 일주일에 두 번 변경하여 샌드위치와 같은 배양 내 세포 이동을 연구합니다. 앞에서 설명한 것처럼 복부 및 등쪽 기질을 피브로넥틴으로 코팅한 후 유리 덮개의 종자 세포는 고밀도로 미끄러지고 샘플을 배양하고 세포가 합류할 수 있도록 합니다. 다음으로, 파이펫 팁을 사용하여 세포 단층을 긁어 틈으로 분리된 두 개의 세포 집단을 만듭니다.

복부 장착 기판을 타임 랩스 획득에 적합하고 등쪽 기판이 내부에 들어갈 수 있을 만큼 충분히 큰 새 우물에 놓습니다. 그런 다음 앞에서 설명한 것처럼 핀셋으로 등쪽 기질을 세포에 오버레이하고 배지로 다시 채웁니다. 샘플을 타임 랩스 현미경 아래에 놓고 20분마다 갭 폐쇄 이미지를 캡처합니다.

이미지 J의 mito BO와 같은 소프트웨어를 사용하여 샌드위치의 갭 폐쇄를 분석합니다. 문화처럼요. 황산염은 등쪽 수용체가 자극되는 시간과 등쪽 상호 작용의 특성에 크게 의존합니다.

예를 들어, 하이드로겔과 같은 다른 3D 시스템과 유사하게, 여기에서 볼 수 있듯이 등쪽 전기 방적 PLLA 섬유는 피브로넥틴으로 코팅될 때 세포 정렬을 지시하지만 BSA와 같은 비접착성 단백질로 코팅될 때는 그렇지 않습니다. 또한, 일반 등쪽 PLLA를 가진 샌드위치 유사 배양물은 C two C 12 세포를 사용하여 근육 형성 수준의 증가를 유발했습니다. 이것은 또한 등쪽의 생물학적 자극에 달려 있습니다.

이 비디오에서 볼 수 있듯이 서로 다른 등쪽 단백질과의 상호 작용으로 인해 뚜렷한 분화율이 나타나기 때문에 상처 치유 분석법의 배양과 같이 샌드위치 내에서 이동하는 섬유아세포는 길쭉한 형태를 채택하고 세포에 비해 더 짧은 거리를 이동합니다. 3D 피브로넥틴 및 콜라겐 겔과 유사한 2D 기질에서 배양됩니다. 배양과 같은 샌드위치는 2D 조건에 비해 세포 매개 ECM 재구성을 증가시킵니다.

이 과정은 등쪽 기계적 자극과 세포골격 안정성에 의존합니다. BLE와 같은 수축성 억제제의 사용으로, 스타틴은 S 과정을 방해했습니다 S 좋아, 그래서 이 비디오를 본 후, 당신은 샌드위치와 같은 배양을 조립하는 방법에 대해 명확하게 이해할 수 있을 것입니다. 이 방법은 질병 모델, 개발 연구 및 약물 테스트의 응용 프로그램을 포함하여 반응 의학 및 암을 위한 미세환경과 같은 3D를 엔지니어링할 수 있습니다.