Name: 입자 추적 Microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 배우세요 입자 추적 마이크로레올로지를 사용하여 세균 바이오필름의 점탄성 특성을 측정하는 방법을. 이 비파괴 기술은 고해상도로 바이오필름의 기계적 성질을 연구하는 데 효과적입니다.

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이 연구는 우수 프로그램의 연구 센터에서 교육 싱가포르 국립 연구 재단과 교육부에 의해 지원, 스타트 업 보조금 난양 기술 대학 (M4330002.C70), 및 AcRF 계층 2 (MOE2014-T2-2-172) 교육부, 싱가포르. 저자는이 프로토콜의 데모에 참여 조이 참마 Kuok Hoong 감사합니다.

1. 바이오 필름 재배 <ol><li> 균주의 제조 <ol><li> 일일 사전 생물막 재배, 냉동 세균성 문화에서 적절한 성장 배지 2 ㎖를 접종하여 플랑크톤 세균 문화를 준비합니다. 점액 P.에 대한 루리아 - 국물 매체 (10g의 L -1의 NaCl, 10g L -1 효모 추출물 및 10g의 L -1 트립 톤)를 사용하여 녹농균과 Δ의 화소와 Δ의 PSL 결함이있는 돌연변이. 37 ° C에서 200 rpm으로 진탕 조건에서 밤새 품어. 분광 광도계를 사용하여 OD 0.40 600 밤새 배양을 희석. </li><li> 바람직하게는 분해하지 않고 플로우 셀을 이미징 현미경 실하게 될 수 이동국 또는 트롤리에 앞서 14 설명한 플로우 셀 설정을 조립한다. </li><li> 2 L 또는 각 플로우 셀에 대한 5 L 병에 무균 성장 매체를 준비합니다. 최소 배지 (M9) (48 mM의 나 2 HPO 4, 22 mM의 사용KH 2 PO 4, 19 mM의 NH 4 CL, 9 밀리미터의 NaCl, 2 mM의 황산, 그리고 피에 대한 0.04 % 포도당 (중량 / 부피)와 0.2 % (중량 / 부피) 카사 미노산) 보충 0.1 mM의 염화칼슘 2) 녹농균 세포 생물막을 흐른다. </li><li> 마이크로 원심 튜브로 나누어지는 형광 마이크로 스피어와는 9,391.2 g에서 원심 분리기에서 5 분 2 O 멸균 H에 스핀 다운. 이전에 2 L 5 L 매체 병의 성장 매체에 추가로 아 지드 화 나트륨 (소독제)를 제거하기 위해 1 ml의 성장 매체에 뜨는 및 재현 탁를 제거합니다. 참고 : 마이크로 스피어의 다른 크기가 서로 다른 농도로 와서 지침에 따라 희석되어야한다. 예를 들어, 2.18 × 106 미세 ml로 -1 각각의 입자 크기를 수득하기 위해 1.0 ㎛의 직경의 미립자의 120 μL, 0.5 μm의 직경 미립자의 15 ㎕의 성장 배지 2 L에 0.2 μm의 직경 미소 0.96 μL를 분산. </li><li> upst 중간 병에 연결흐름 셀의 묶음과 성장 매체 전체 설치를 통과 할 수 있습니다. 흐름을 중지하고 흐름 세포 챔버로 희석 하룻밤 문화를 주입. 박테리아는 약 5.5 × 10 -3 m 초 -1, 또는 연동 펌프 8 rpm의 유량으로 성장 매체의 흐름을 계속하기 전에 1 시간 동안 커버 슬립을 기질에 부착 할 수있다. 참고 : 바이오 필름은 일반적를 3-7 일 동안 실온 (25 ℃로)에서 재배되고 있습니다. </li><li> 대안으로, 정적 배양 셋업, 입자 1 ml의 성장 배지로 하룻밤 배양의 10 μl를 첨가하여 하룻밤 배양을 마이크로 원심 튜브에 100 배 희석. 유동 생물막 사용에 비해 약 500 배 정적 배양 용 성장 배지에서의 입자 농도를 증가 (예를 들어 세척 및 성장 배지 10ml에 1.0 μm의 직경 분야의 600 μl를 재현 탁) 지속적으로 보충되는 유동 셀 생물막로서 입자하지만 정적 인 문화가 아니다. <ol><li> 200 추가1 8 잘 슬라이드의 챔버에 입자로 희석 하룻밤 문화의 L. 정적 인 상태에서 37 ° C에서 품어. 바이오 필름은 일반적으로 1 일 동안 성장하고 있습니다. 바이오 필름이 하루 이상 재배하는 경우 입자 신선한 성장 매체 매일 소모 된 성장 매체를 교체합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 현미경 <ol><li> 3 일, 5 일, 연동 펌프에서 흐름을 끄고 현미경 방으로 흐름 전지 설치를 가져온다. 플로우 셀 챔버의 입구 및 출구 부근 클램프 튜브 드리프트 흐름 (환경 변화에 대한 체계적인 에러 원인)을 방지 할 수있다. 직립 현미경의 현미경 무대에 흐름 세포를 놓습니다. 참고 : 마이크로 웰의 이미징 거꾸로 현미경을 사용합니다. </li><li> 다양한 위치 (microcolonies 및 평면 미분화 층)에서 바이오 필름에 포함 된 미세 운동의 비디오와 다른 일 (3 일 및 5)에 대한 응시 40X 오일 목적으로 형광 현미경을 사용하여시간과 공간의 조사. 짧은 시간 규모 내에서 발생하는 사건을 조사하기 위해 더 높은 프레임 속도로 짧은 비디오를 찍기 (예 : 25-50 빠른 역학에 대한 초당 프레임의 프레임 속도에서 1.5-3 분 동영상), 낮은 프레임 속도와 더 이상 비디오는 긴 시간에 걸쳐 사건을 조사하기 위해 저울 (2.5-5 프레임 / 느린 역학 삼성 전자의 프레임 속도로 예를 들어 15 ~ 30 분 동영상). 참고 : 비디오는 일반적으로 5-10 입자를 포함하고, 파일 크기가 일반적으로 1.0-2.5 기가 바이트입니다. 큰 microcolonies 더 많은 입자를 보유 할 수있다. 각 범주에 대한 5-10 동영상 (다른 microcolonies의 평면 미분화 층에서 서로 다른 위치의 예를 들어 5-10 비디오를) 가져 가라. 바이오 필름은 microcolonies, 채널, 빈 공간과 평면 미분화 층으로 구성 될 수있다 이종 구조를 가지고있다. </li><li> 피지 / ImageJ에 읽을 수있는 적절한 형식의 비디오 (예를 들어 czi, TIF)를 저장합니다. </li><li> 완성 된 VID를 통해 스크롤하여 드리프트에 대한 동영상을 확인EO와 입자가 동시에 동일한 방향으로 이동하지 않는 것이 관찰. 드리프트 Z 스테이지 동작, 플로우 셀의 전류, 진동 방지 테이블, 공기 압력 또는 온도 변화의 불균형에 의해 야기 될 수있다. 올바른 마이너 보통 현미경 소프트웨어와 함께 제공되는 포스트 - 프로세싱 기술을 사용 표류. 드리프트가 해결 될 수없는 것을 특징 비디오를 폐기하십시오. 입자 추적 분석시 필요한 다음 매개 변수를 녹음 해상도 (PX / 음), 프레임 수, 시간. </li><li> 현미경 단계에서 유동 세포를 제거하고 바이오 필름을 배양 계속 연동 펌프를 다시 시작합니다. </li></ol> 3. 입자 추적 분석 <ol><li> 오픈 소스 소프트웨어 (ImageJ에)에 플러그인 TrackMate을 사용하여 입자의 궤적을 얻습니다. 피지 다운로드 <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a> . 피지와 플러그인 메뉴에서 비디오를 열고, 추적 및 TrackMate을 선택합니다. </li><li> 확인하거​​나 일에 설정을 조정단계 2.4에 기록 된 영상 파라미터와 일치하도록 보정 초기 설정을 제안하는 전자 창. </li><li> ImageJ에를 사용하여 TrackMate에서 입자를 감지합니다. <ol><li> (예, 000) &#39;로그 검출기&#39;, 입력 입경과 임계 값을 선택한다. 보라색 ​​원이 비디오에 걸쳐 입자를 따르는 것이 확인 &#39;미리보기&#39;버튼을 클릭하는 동안 영상을 스크롤합니다. 필요에 따라 직경 및 임계 값 조정 : 퍼플 원이 빈 공간에 표시하는 경우의 임계 값을 증가시킨다. 충분한 입자가 검출되는 경우에 상기 임계 값을 감소시킨다. 검출을 입자를 완료하기 위해 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> 추가 또는 &#39;초기 임계&#39;에서 검출 된 입자를 제거, &#39;보기 선택&#39;초기 입자 검출 만족 인 경우 창 조정하지 않고 계속 &#39;필터 선택&#39;을 할 수있는 옵션이 표시되면 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> OPTI에서 &#39;단순 LAP 추적기&#39;를 선택입자가 거의 생물막에 초점이 이동하지 쉽게 추적으로의 줄에 창 &#39;추적 방법을 선택합니다&#39;. 제안 또는 낮은 연결과 격차 폐쇄 최대 거리 값을 사용하고 다음을 클릭합니다. </li><li> 그 입자 추적 입자가 TrackMate에 의해 그려진 트랙을 따라야하고, 원치 않는 또는 누락 된 트랙이 없는지 확인하기 위해 비디오를 스크롤하여 만족 확인합니다. 다양한 필터링 단계를 건너 뜁니다. &#39;작업 선택&#39;마지막 창으로 이동합니다. 드롭 다운 메뉴에서 &#39;XML 파일로 내보내기 트랙&#39;을 선택하고 &#39;실행&#39;을 클릭합니다. 트랙을 저장할 폴더를 선택합니다. 참고 : 입자의 궤적과 microrheology의 사용 분석을위한 공공 영역에서 사용할 수있는 다양한 프로그램이 있습니다. msdanalyzer과 TrackArt는 매트랩 환경에서 실행 입자 추적 분석 프로그램의 예입니다. </li></ol></li><li> 의 메뉴에서 선택하여 XML 파일의 입자의 궤적을 가져 matlab에 준비MATLAB 파일&gt; 설정 경로 ... 그리고는 스크립트가 피지 패키지와 함께 사용할 수 폴더를 추가 할 수 있습니다. </li><li> msdanalyzer와 입자의 궤적을 분석하기 위해, 압축 파일 또는 tar.gz 파일에 대한 링크를 다운로드 at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> @msdanalyzer 폴더 (15)를 추출하고 matlab에 경로에 속하는 폴더에 드롭 (예 : C : Documents and Settings &lt;사용자 이름&gt; 내 문서 matlab에를 ). matlab에를 시작하고 입력하여 분석을 시작합니다 : 엄마 = msdanalyzer (2, &#39;음&#39;, &#39;초&#39;) UM 및 초 비디오에서 현실 공간과 시간 단위한다. <ol><li> 입력하여 입자의 궤적을 가져옵니다 [트랙, MD] =의 importTrackMateTracks ( &#39;FileName.xml&#39;, &#39;clipZ&#39;;, &#39;scaleT&#39;) 엄마 = ma.addAll (트랙); 여기서 &#39;clipZ&#39;는 Z의 2D 비디오의 차원, 그리고 &#39;scaleT&#39;을 제거합니다. </li><li> 그래프를 사용하여 위에 궤적을 그린다 : ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> 사용하여 입자의 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 계산한다 : 엄마 = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> 각 입자의 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 플롯 : 그림 ma.plotMSD </li><li> ) 3.5.1.4에 3.5.1.1를 반복하여 (3 일에서 야생형 microcolonies에 포함 된 예를 들어 입자) 다른 같은 categery의 비디오에서 입자의 궤적을 결합합니다. </li><li> 앙상블 평균 또는 모든 곡선의 평균 플롯 : ma.plotMeanMSD 로그 스케일로 선형에서 y 축과 x 축으로 변경합니다. 긴 지연 시간에, MSD 곡선으로 인해 더 이상 시간 척도에서의 불충분 한 통계에 잡음이된다. MSD 곡선는 또한 동적 오류로 가파르게 상승 할 수있다. 곡선의 이들 영역은 브러시 툴을 사용하여 제거 할 수있다&gt; 곡선의 끝을 선택하고 선택 &#39;칫솔질&#39;도구 메뉴에서 &#39;Unbrushed 제거&#39;. </li></ol></li><li> 에 Ezyfit 다운로드 <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> 및 matlab에 경로에 속하는 폴더에 Ezyfit를 추가 (예 : C : Documents and Settings &lt;사용자 이름&gt; 내 문서 matlab에를 ). efmenu 설치 matlab에 작업 공간에 입력하여 Ezyfit 메뉴를 설치합니다. 그림 창에서 Ezyfit 메뉴를 MATLAB를 다시 시작합니다. Ezyfit 메뉴 &#39;쇼 맞추기&#39;&gt; &#39;전원&#39;&gt; &#39;* X ^ N&#39;에서 선택하여 전원 법에 MSD 곡선에 맞는 n은 추정 확산 지수 (α)입니다했다. 참고 : msdanalyzer는 MSD 곡선 피팅을위한 매트랩 도구 상자를 피팅 곡선을 필요로한다. Ezyfit 커브 피팅을 수행 할 수있는 다른 무료 소프트웨어입니다. </li><li> 지우기 현재 입자의 궤적과 근골격계 질환은 다른 지역 또는 시간에 새로운 입자 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 계산합니다 : 맑은 </리&gt; <li> 다양한 평균 MSD 매체 (제어) 입자의 곡선, 그리고 microcolonies 다양한 균주의 미분화 지역, 복사 비교를 위해 하나의 그래프에 곡선을 붙여 계산 한 후. 샘플 강성과 낮은 MSD 값으로 가교 증가. 평면 곡선은 낮은 α를 가지고 샘플은 높은 α와 가파른 곡선보다 더 탄성이다. </li><li> 커브를 선택 및 중간 및 범위 등의 데이터 통계를보고 &quot;도구&quot;로 이동합니다. 비드 MSD는 크리프 컴플라이언스에 비례, J 비드 관계에 따라서 매립 된 물질 (t), <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> 여기서 J = 크리프 준수, D = 입자 직경, 케이 B = 볼츠만 상수, T = 온도 T = 시간. </li></ol></li></ol>

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Microrheology는 미생물 바이오 필름 등의 이기종 시스템, 로컬 유변학 적 측정을위한 유용한 도구입니다. 그것은 여러 시간 지점 위에 동일한 생물학적 샘플 내의 유동 학적 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있도록, 비파괴 기술이다. 이 프로토콜에서, 입자 추적 microrheology 그들이 탄성 생물막 매트릭스의 가교 효과에 미치는 영향을 조사하기 위해 펠 PSL 엑소 폴리 사카 라이드 및 돌연변이에 적용 하였다. 펠 점탄성 및 패자 생물막을 선호하는 반면 PSL 높은 효과적인 가교 탄성 생물막의 개발을 선호. 모두 엑소 폴리 사카 라이드가 생성되는 경우, 생물막 microcolonies 덜 효과​​적으로 펠 이상 PSL의 감소와 일치, 생물막이 성숙 가교된다. 다른 종의 박테리아에 의해 형성된 생물막은 별개의 EPS 조성이 있습니다. 점액 (P)의 EPS 주로 consi 본 연구에 사용 된 aeruginosa의 균주<html> 엑소...

대부분의 박테리아 세포는 모두 플랑크톤 (자유 생활)과 성장 (1)의 표면에 부착 (고착) 모드를 사용 할 수 있습니다. 성장면 부착 모드에서, 박테리아 세포는 분비 및 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 바이오 필름을 형성하기 위해 다량으로 자신을 싸는. EPS는 주로 단백질, 엑소 폴리 사카 라이드, 세포 DNA로 구성되어 생물막 형성이 필수적이다. 그것은 박테리아가 공간적으로 구별하기 위해 사용하고 유해 환경 조건 및 호스트 응답에서 박테리아를 보호 할 수있는 물리적 발판 역할을한다. EPS의 다른 구성 요소는 크게 생물막 구조 4 개조 할 수 EPS 구성 요소의 표현에 biofilm 형성 (3) 변경에 별개의 역할이있다. EPS 구성 요소는 또한 5 시그널링 분자로서 기능 할 수 있으며, 최근의 연구는 이주 및 생물막 DIFF 안내하는 미생물 세포와 상호 작용하는 특정 EPS 성분을 보여 주었다erentiation 6-8. EPS에 대한 연구는 크게 EPS 9, 10의 특정 구성 요소에 결함이있는 돌연변이에 의해 생성 된 바이오 필름의 형태 학적 분석을 기반으로 고급. 또한, EPS 보통 매크로 스케일 (벌크 특성) (11)을 특징으로한다. 형태 학적는 평균 값을 반환 생물막의 이질성 내에 존재 세부 사항을 잃고 양적 세부 사항 및 벌크 특성을 결여 할 수 있지만 분석한다. 마이크로 규모 EPS의 정비사 특성의 실시간 특성을 진행하는 경향이 증가하고 지금 있습니다. 이 프로토콜은 입자 추적 microrheology는 녹농균 생물막 (4)의 탄성률과 효과적인 가교에 매트릭스 성분 펠의 시공간 효과 PSL 엑소 폴리 사카 라이드를 결정하는 방법을 설명 할 수있다. 수동 microrheology는 간단하고 저렴한 RH입니다날짜 (12, 13)에 대한 물질의 공간 microrheological 샘플링의 가장 높은 처리량을 제공 eology 방법. 패시브 microrheology에서, 프로브가 샘플 분야에 배치되어 열 에너지 (K B 형 T)에 의해 구동들은 브라운 운동을 비디오 현미경으로 이어진다. 여러 입자를 동시에 추적 될 수 있고, 입자의 시간에 따른 좌표는 종래 랜덤 워크를 따른다. 따라서, 평균 입자가 동일한 위치에 남아있다. 그러나, 변위의 표준 편차 또는 평균은 입자의 변위 (MSD)를 제곱, 0이 아니다. 점성 액체의 흐름 때문에 시간이 진행됨에 따라, 점성 유체의 입자 MSD는 선형 적으로 증가한다. 대조적으로, 중합체 가교 점탄성 검색된 또는 탄성 물질들이 유동 저항 돕고, 입자 MSD 곡선 (도 1a)의 대지에 이어지는, 그 변위에 한정된다. 이러한 관찰은 다음 관계를 MSDαt <sα는 물질의 탄성과 점성 기여 비율과 관련이 확산 지수 인 α&gt;까지. 점탄성 물질 &lt;α &lt;1, 및 탄성 물질에 α 0에 점성 유체의 이동 입자 α = 1에 대해서는 = 0으로 MSD는 또한 재료의 경향 영구적 위에 변형 인 크리프 컴플라이언스를 계산하는 데 사용될 수있다 시간이 얼마나 쉽게 재료 스프레드를 추정하고있다. 입자의 크기, 밀도 및 표면 화학 microrheological 실험 올바른 응용에 중요하다 (이 경우에 생물막의 매트릭스 폴리머는,도 1b 참조)를 조사 시스템에 대해 선택된다. 우선, 입자는 입자 자체보다 훨씬 작은 구조를 갖는 물질의 레올로지를 측정한다. 물질의 구조는 입자, 파의 움직임과 유사한 규모의 경우ticle는 개별 구조의 형상 및 방향에 의해 교란된다. 그러나 입자를 둘러싸는 구조가 매우 작은 경우,이 효과는 작고, 입자 (도 1b)에 균일 한 환경을 제시하고, 평균화. 둘째로, 입자의 밀도는 침강이 방지 및 관성력 무시할되도록 (수성 매체 1.05 g 용액 -1) 매체와 유사 할 것이다. 폴리스티렌 그릴 대부분의 입자는 위의 기준을 충족. 운동은 물질의 구조와 열 에너지와의 충돌에 의해 구동, 임의의 경우 입자 MSD의 유변학 적 해석에만 유효 이상적으로, 입자는 바이오 필름 매트릭스의 폴리머와 상호 작용하지 않습니다. 이것은 프로브 입자가 결합하거나 미리 성장한 생물막의 표면에서 반사하는 경향이 있는지 여부를 확인함으로써 관찰 될 수있다. 그러나, 바이오 필름에 인력의 부족에도 불구하고, 입자가 매트릭스에 혼입 될 수 있어야한다.또한, 바이오 필름의 물리 화학적 이질성은 다른 입자가 생물막의 다른 지역에서 프로브로서 더 적합하다 발생할 수 있습니다. 따라서, 다른 크기 및 표면 화학의 입자는 생물막에 적용되어야한다. 이와 같이, 입자는 MSD 성분 유 동학에 기여 생물막의 확산 방법에 관한 다른 유용한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 다른 프로브의 사용은 하나의 생물막의 공간 물리 이질성에 대한 정보를 도출 할 수있다. 이 방법은 바이오 필름의 기계적 특성이 다른 종의 도입에서 변경되는 방법을 조사하기 위해 혼합 종 생물막으로 생물막의 기계적 특성에 영향 항균 처리를 테스트하는 데 사용되는, 또는 적용 할 수있다. 입자 근골격계 질환은 생물막 분산의 특성을 유용 할 수 있습니다. 이러한 연구는 잠재적으로 생물막 처리 개선, 바이오 필름에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다유용한 활동을위한 생물막의 차 엔지니어링.

<table><tbody><tr><td>형광구</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &#956; M 카르복실레이트 변형이 있는 적색 형광(580/605) 미세구</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Epifluorescent Microscope</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>연동 펌프</td></tr><tr><td>플로우 셀 챔버</td><td>덴마크 기술 대학교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>버블 트랩</td><td>기술 대학교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3mm 외경, 1&nbsp; mm 내경</td></tr><tr><td>투명 폴리프로필렌 플라스틱 커넥터&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 인치. (1.588의 mm)</td></tr><tr><td>바인더 클립</td><td></td><td></td><td>튜빙</td></tr><tr><td>클램프 Coverslips</td><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&trade;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>주사기 3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp; G 바늘</td><td>테루모</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp; L 저장/미디어 병</td><td>VWR&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트롤리</td><td></td><td></td><td>생물막 설정을 유지하기 위해</td></tr></tbody></table>

입자 추적 microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

박테리아 세포는 세포외 고분자 물질(EPS)로 자신을 감싸서 생물막으로 알려진 표면 부착 생물막 군집을 형성할 수 있습니다. EPS는 박테리아 세포를 수용하는 물리적 및 보호 골격 역할을 하며 단백질, 외다당류 및 DNA를 포함한 다양한 물질로 구성됩니다. EPS의 조성은 변경될 수 있으며, 이는 환경적 단서에 대한 반응으로 스트리머와 같은 대체 생물막 구조를 추가로 개발하거나 지원하기 위해 생물막의 기계적 특성을 리모델링할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 EPS 성분이 생물막의 기계적 특성과 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 정량적 설명은 거의 없습니다. 물질의 흐름에 대한 연구인 유변학은 많은 생물막이 유동 조건에서 성장하고 지속적으로 전단 응력에 노출되기 때문에 생물막과 특히 관련이 있습니다. 또한 표면에 생물막이 퍼지는 것에 대한 측정 및 통찰력을 제공합니다. 여기에서 입자 추적 미세유변학은 개발 중 생물막의 다양한 부분에서 서로 다른 매트릭스 구성 요소의 점탄성과 효과적인 가교 역할을 검사하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 마이크로 스케일에서 생물막의 기계적 특성을 측정할 수 있으며, 이는 생물막 제어 및 엔지니어링에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.

보이드 (바이오 필름 ​​위의 매체), 평원 (세포의 미분화 평면 층) 및 microcolonies (그림 2A의 라벨 참조)에 포함 된 바이오 필름의 다른 지역에서 바이오 필름의 로컬 점탄성 특성을 조사 하였다. 일에서 성숙하는 동안 바이오 필름의 점탄성 특성의 시간적 변화는 3-5도를 측정 하였다. 보이드의 입자 MSD 순수한 매질 입자 MSD에 제어 및 비교로서 사용 하였다. 반면, 생물막에 갇혀 입자가 고정 된 위치에서 진동과 MSD 값은 점탄성 물질의 전형적인 그 강하게 탄성 젤에게 (그림 3)에서였다. 점액 P. aeruginosa의 야생 유형과 Δ 펠 돌연변이 균주 (그림 2A와 2B)는 자신의 바이오 필름에 3 일에 의해 얇은 일반에 흩어져 microcolonies을 개발했다. 3 일에 일반은 너무 얇았다유변학 적 특성의 조사. 점액 <em...

입자 추적 미세유변학은 재료의 점탄성을 조사합니다. 여기서 이 기술은 박테리아 생물막의 다양한 매트릭스 구성 요소에 대한 점탄성, 크리프 규정 준수 및 효과적인 가교 역할을 결정하는 데 사용됩니다. 매트릭스는 박테리아가 분비하는 고분자 물질로 구성되며 그 구성 요소는 생물막 구조와 기계적 특성을 결정합니다.

입자 추적 Microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

본 방법론의 전반적인 목표는 불균질한 유동 셀(flow cell) 및 정적 바이오필름의 미세 도메인 내에서 실제 논리적 특성을 측정하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 특정 지표 성분, 서로 다른 종 또는 화합물이 바이오필름 신경학에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 전단력과 같은 물리적 힘에 대한 반응을 테스트하는 것과 같이 바이오필름 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 높은 공간 분해능을 가진 비파괴적 기술이며, 생물학 실험실의 표준 장비로 수행할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 하룻밤 동안 배양한 박테리아 배양액과 소모품 및 플로우 셀 설정을 위한 배지를 준비한 후, 아지드화 나트륨을 제거하기 위해 멸균수에 분산된 형광 마이크로스피어를 마이크로 원심분리 튜브에 소분합니다. 플로우 후드와 같은 멸균 환경에서 튜브를 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거한 뒤 1 mL의 성장 배지를 사용하여 마이크로스피어를 재현탁합니다. 그런 다음 플로우 셀 배양을 위한 나머지 성장 배지에 마이크로스피어를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 플로우 셀 배양을 설정하며, 마이크로웰 챔버에서 성장시킨 바이오필름을 위한 정적 배양 설정의 경우, 1 mL의 성장 배지에 하룻밤 동안 배양한 배양액 10 µL를 첨가하여 마이크로 원심분리 튜브에서 배양액을 100배 희석합니다.미세구체가 포함된 배지입니다. 그런 다음 희석된 배양액을 사용하여 마이크로웰 챔버를 채우고 37°C의 정적 조건에서 배양합니다. 3일째와 5일째에는 연동 펌프의 흐름을 끄고 플로우 셀 장치를 현미경실로 옮깁니다.그다음 유동으로 인한 표류를 방지하기 위해 플로우 셀 챔버의 입구와 출구 근처의 튜브를 클램프로 고정합니다. 플로우 셀을 정립 현미경의 스테이지 위에 놓고, 40 x 오일 렌즈와 형광 현미경을 사용하여 시간적 및 공간적 조사를 위해 마이크로 콜로니 및 평탄한 미분화 층과 같은 다양한 위치에서 바이오필름에 내장된 마이크로스피어의 움직임을 기록합니다. 짧은 시간 범위 내에서 발생하는 이벤트의 경우, 빠른 역학 분석을 위해 더 빠른 프레임 속도로 짧은 비디오를 기록합니다. 더 긴 이벤트의 경우, 더 느린 프레임 속도로 더 긴 비디오를 캡처합니다.역학이 느린 경우에는 CZI 또는 Tiff와 같이 Fiji ImageJ에서 읽을 수 있는 적절한 형식으로 비디오를 저장하십시오. 드리프트가 발생하지 않는지 확인하십시오. 완성된 비디오를 스크롤하며 입자들이 동시에 같은 방향으로 이동하지 않고, 무작위로 움직이는지 확인하면 됩니다.현미경 스테이지에서 플로우 셀을 제거하고 연동 펌프를 다시 작동시켜 바이오필름 배양을 계속합니다. 기록된 비디오의 입자 추적 궤적을 얻으려면 Fiji를 열고 파일을 불러옵니다. 플러그인 메뉴에서 tracking 및 trackmate를 선택합니다. 초기 보정 설정에서 해상도와 프레임 속도 파라미터를 확인하거나 조정하여 비디오 파라미터와 일치시킵니다. 입자를 검출하려면 LOG detector를 선택하고 입자 직경과 임계값을 입력합니다.예를 들어, 1000으로 설정하십시오. 미리보기 버튼을 확인하고 비디오를 스크롤하여 보라색 원이 비디오 전반에 걸쳐 입자를 잘 따라가는지 확인하십시오. 임계값(threshold value)을 높이십시오.빈 공간에 보라색 원이 나타나면 임계값(threshold value)을 낮추십시오. 검출된 입자 수가 충분하지 않은 경우, 다음 버튼을 클릭하여 입자 검출을 완료하십시오. 초기 입자 검출 결과가 만족스럽고 입자를 추가하거나 제거할 필요가 없다면 다음 버튼을 클릭하십시오. 이후 나타나는 세 개의 창(초기 임계값 설정, 뷰 선택, 필터 선택)에서는 별도의 조정 없이 선택만 하고 진행하십시오.다음으로, select A tracker method 창의 옵션 바에서 simple LAP tracker를 선택하십시오. 바이오필름 내의 입자는 초점에서 벗어나는 경우가 드물고 추적이 용이하므로, 권장 값 또는 낮은 linking 및 gap closing max distance 값을 사용하고 Next를 클릭하십시오. 비디오를 스크롤하여 입자가 TrackMate에 의해 그려진 경로를 잘 따라가는지, 그리고 원치 않는 경로가 있거나 누락된 경로는 없는지 확인하여 입자 추적이 적절히 이루어졌는지 점검하십시오.개별 추적 결과에 따라 입자를 제외하기 위한 다양한 필터가 제공됩니다. 이 과정이 필요하지 않은 경우, 마지막 창으로 이동하여 드롭다운 메뉴에서 action을 선택하고, export tracks to XML file을 선택한 뒤 execute를 클릭하십시오. 폴더를 선택하여 matlab에 추적 데이터를 저장하십시오.파일 세트 경로를 선택하여 입자 궤적 XML 파일을 가져올 준비를 하고, 입자 궤적 분석을 수행하기 위해 Fiji 패키지에 포함된 스크립트 폴더를 추가하십시오. 먼저 MSD analyzer를 다운로드하십시오. msd analyzer 폴더를 압축 해제한 후 MATLAB 경로에 포함된 폴더에 넣으십시오.MATLAB을 실행하고, 비디오의 물리적 공간 및 시간 단위가 각각 마이크로미터(µm)와 초(s)가 되도록 다음 내용을 입력하여 분석기를 시작하십시오. 다음으로, clip Z를 통해 Z 차원을 제거하여 입자 궤적을 가져오십시오. 2D 비디오 및 스케일의 경우, T를 통해 시간 차원의 단위를 프레임에서 초로 변환하고, 트랙을 추가하여 입자 궤적을 도식화하십시오.다음 내용을 입력하고, 여기에 표시된 명령어를 사용하여 입자의 평균 제곱 변위(mean square displacement) 또는 MSDS를 계산하십시오. 각 입자의 MSDS를 그래프로 나타내려면 figure와 MA dot plot msd를 사용하십시오. 그런 다음 동일한 범주의 다른 비디오에서 입자 궤적을 결합하십시오.import trajectory 명령어를 사용하여 궤적을 가져온 다음, 앞서 시연한 대로 MSD를 플로팅하고 계산하여 앙상블 평균 또는 전체 평균 곡선을 플로팅합니다. 다음과 같이 입력하십시오. 그런 다음 Y축과 X축을 선형 스케일에서 로그 스케일로 변경하십시오.지연 시간이 길거나 동적 오차로 인해 급격히 상승하는 곡선 영역을 제거하려면, 브러시 도구를 사용하여 곡선의 끝부분을 선택하십시오. 그런 다음 도구 메뉴에서 brushing을 선택하십시오. easy FITT를 설치하고 figure 창에 easy 메뉴가 나타나도록 MATLAB을 재시작한 후 unbred를 제거하십시오.텍스트 프로토콜에 따라, 'show fit power A times X to the N'을 선택하여 MSD 곡선을 멱법칙(power law)에 맞춥니다. 여기서 N은 추정된 확산 지수 alpha입니다. 그런 다음, 다른 위치나 시간에서의 새로운 입자 MSD를 계산하려면 'clear'를 입력하여 현재의 입자 궤적과 MSD를 삭제하십시오. 다양한 바이오필름 균주 및 서로 다른 시간대의 다양한 위치에 있는 입자들에 대해 여러 MSD 곡선을 계산한 후, 해당 곡선들을 하나의 그래프에 복사하여 붙여넣으십시오.비교를 위해 곡선을 선택하고 도구 메뉴로 이동하여 중앙값 범위와 같은 데이터 통계량을 확인하십시오. 비드의 MSD는 이 공식에 나타난 관계에 따라 비드가 내장된 재료의 크리프 컴플라이언스 JFT에 비례하며, 여기서 J는 크리프 컴플라이언스, D는 입자 직경, KB는 boatman's를 나타냅니다.대문자 T는 온도, 소문자 t는 시간을 나타냅니다. 본 실험에서는 공극, 평면, 미세 콜로니를 포함하여 야생형 P arosa 및 delta PE A 돌연변이 균주의 서로 다른 바이오필름 영역에 대한 점탄성 특성을 조사하였습니다. 공극 내 입자의 MSD는 대조군으로 사용되었으며, 순수 배지 내 입자의 MSD와 유사한 수준이었습니다.이와 대조적으로, 바이오필름에 갇힌 입자들은 고정된 위치에서 진동하였으며, 야생형 및 delta Pele 균주에 의해 형성된 바이오필름 내 입자의 MSD 값은 전형적인 점탄성 물질부터 강한 탄성 젤의 범위까지 나타났습니다. 3일 차 마이크로 콜로니의 입자 MSD는 0.1초에서 10초 사이의 시간 지연(time lags)에 대해 시간에 무관하게 나타났으며, 이는 마이크로 콜로니가 탄성을 가졌음을 나타냅니다. 해당 입자 MSD로부터 계산된 중앙값 크리프 컴플라이언스(creep compliances)는 각각 4.3 × 10⁻² Pa⁻¹ 및 3.6 × 10⁻² Pa⁻¹였습니다.5일째에 야생형 균주 내 마이크로 콜로니의 크리프 컴플라이언스(creep compliance)는 2.5 × 10⁻¹ Pa⁻¹로 증가했으며, 이는 매트릭스 내의 유효 가교 결합이 감소했음을 나타냅니다. delta P-S-L-B-C-D 돌연변이 균주에 의해 형성된 바이오필름은 분화 정도가 낮고 발달이 지연되었으며, 3일 이후에 마이크로 콜로니가 발달하는 두꺼운 평면 구조를 보였습니다. MSD 값으로 볼 때, 해당 바이오필름은 야생형 및 delta Pele 균주보다 가교 결합의 효율성이 훨씬 낮았습니다. 더 많은 비디오를 분석해도 MSD 곡선에 새로운 정보가 추가되지 않는 경우, 마이크로 도메인에서 충분한 통계치를 추출하였습니다.표면 화학 성분과 크기가 서로 다른 다양한 입자를 사용하여 미생물학 연구를 수행하는 것이 중요합니다. 건강 상태를 조사하기 위해 절차에 추가 실험을 포함할 수 있습니다. 전단력과 같은 물리적 힘이나 화학적 처리는 바이오필름의 방사선학적 특성에 영향을 미칩니다. 미생물학적 추출은 마이크로미터 규모에서 다른 방법으로는 쉽게 얻을 수 없는 구조적 정보를 제공합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 입자를 추적하고, MSD(평균 제곱 변위)를 분석하며, 바이오필름의 확산 지수를 구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 박테리아 병원체를 다루는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 모든 폐기물은 오토클레이브로 멸균하여 적절하게 처리해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Kurz, D. L. 외 다공성 매질에서 생체 클로깅을 연구하기 위한 마이크로플루이딕 플랫폼. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 바이오필름 형성을 연구하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 박테리아 현탁액이 마이크로채널에 주입된 후 바이오필름 현상을 위해 배양합니다. 그 후 유동을 재개하고, 압력 모니터링과 영상을 사용하여 시간에 따른 바이오필름 형성과 기공 폐쇄를 감지합니다.

바이오필름 형성 중 실시간 영상 및 압력 추적을 위한 마이크로유체 장치

이 논문은 세균 바이오 필름과 현장에서 인터페이스에서 미생물에 의해 만들어진 복잡한 생활 소재의 로컬 기계적 특성을 측정 할 수있는 전용 자기 핀셋의 개발에 씨앗을 품고 자기 입자의 원격 작동에 따라 원래의 방법을 보여줍니다.

에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동<em&gt; 현장에서</em세균 바이오 필름 물성&gt; 3D 매핑

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

이 문서는 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 매핑의 화학 수 화 상태에서 미세 반응 기, 액체 진공 인터페이스에 분석을 위한 시스템으로 사용에 대 한 biofilm 성장을 위한 메서드를 제공 합니다. 녹색 형광 단백질으로 Shewanella oneidensis 미스터 1 모델로 사용 되었다.

제자리에서 Shewanella oneidensis MR1 Biofilms SALVI 및 ToF 심즈의 특성

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