Name: 인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 인간 유선 상피 세포의 3D 배양법을 통해 호르몬이 유방 상피 형태 발생에 미치는 영향을 연구하는 방법을. T47D 세포를 활용한 이 표준화된 기법은 생리학적으로 관련성 높은 유방암 치료 연구에 활용됩니다.

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우리는 크게 셰릴 Schaeberle에 의해 편집 기여를 주셔서 감사합니다. 이 연구는 에이 보조금 # 02-2009-093과 02-2011-095, 및 AMS에 NIEHS / NIH ES 08314에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 환경 보건 과학 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

시약 1. 준비 <ol><li> 10-3 M의 재고 솔루션을 만들 수있는 합성 progestagen의 promegestone (R5020) 및 에탄올 17-β-에스트라 디올 (E2)를 녹인다. 1 ㎎ / ㎖ 모액을 증류하여 탈 이온수 프로락틴을 녹인다. 10 -2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 DMSO에 항 에스트로겐 ICI 182,780을 녹인다. 최대 6 개월 동안 -20 ° C에서 이러한 솔루션을 저장합니다. </li><li> 숯불 덱스 트란 (CD)의 혈청 및 CDFBS 매체를 제거 : <ol><li> 30 분 동안 57 ° C의 물 중탕에 소 태아 혈청 (FBS)을 열 - 불 활성화. 참고 : 사용이 프로토콜의 나머지 부분에 대해서만 산 세척 유리합니다. </li><li> 필요한 숯의 양을 계산한다. 상기 활성탄에 의한 변위를 보상 5 % 중량 / 부피의은 분말 활성탄 무게 혈청 량보다 10 % 더 많은 양을 사용. </li><li> 혈청 양과 동일한 양을 사용하여 차가운 탈 증류수로 두 번 세척 숯. 각 세척 C에 대한숯 펠렛 2 분 50 XG에 entrifuge. 세척 사이에 물을 제거합니다. 마지막 숯 펠렛 0.5 % 중량 / 부피의 덱스 트란 T-70을 추가합니다. 5 분 100 XG에 증류수, 탈 이온수와 원심 분리기에 다시 일시 중지합니다. 물을 대기음. </li><li> 펠렛에 혈청의 적절한 볼륨을 추가하고 혈청에 숯 덱스 트란 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 60 분 37 ºC에서, (6 RPM) 압연 동안 품어. 20 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 상층 액이 흐린 나타나는 경우, 원심 분리를 반복; 그러나, 혈청은 현재 완전히 명확하지 않을 수 있지만, 여과시 삭제됩니다. </li><li> 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 0.45 미크론 필터를 통해 다시 0.80 미크론 필터를 통해 여과하고. 마지막으로, 0.20 미크론 필터로 멸균 필터. 스토어는 -20 ºC에서 유리 튜브 또는 T-25 배양 플라스크에 CDFBS 필터링. </li><li> 숯 덱스 트란은 태아 미디어 (CDFBS 미디어) 소 함유 박탈 : 페놀 레드가없는 DMEM의 375 ml의 DMEM의 125 ㎖의 혼합/ F-12. 37.5 ml의를 제거하고 숯 덱스 트란 박탈 소 태아 혈청의 동일한 볼륨으로 교체. 2 mM의 최종 농도 106 U / ㎖ 페니실린 및 L- 글루타민을 추가합니다. 그 결과 매체는 75 % DMEM, 25 % DMEM / F-12, 7.5 %의 숯불 덱스 트란 제거-FBS, 2mM의 L 글루타민, 10 (6) U / ㎖ 페니실린이다. </li></ol></li><li> 10X PBS, 1N의 NaOH와 증류수 탈 이온수를 준비합니다. 필요한 콜라겐 용액의 부피에 따라 각각의 충분한 양을 준비한다. 필터링 모든 솔루션을 소독. 최대 1 개월 4 ° C에서 10 배 PBS와 멸균 증류수 탈 이온수를 저장합니다. 1N NaOH 용액을 보관하지 마십시오. </li><li> 제조업체에서 제공하는 &quot;콜라겐 I, 쥐 꼬리의 대체 겔화 절차&quot;에 대한 프로토콜에 따라 1 ㎎ / ㎖ 최종 농도 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 각 겔 콜라겐 용액 1.5 ㎖로한다. 예를 들어, 제조 콜라겐 용액 (피펫 동안 손실을 고려하여 0.5 mL)을 18.5 mL의 제조12 젤. 바로 콜라겐 솔루션을 사용하거나 최대 2 ~ 3 시간 동안 얼음에 개최. </li><li> 카마 졸업생 염료 : <ol><li> 증류수 500 ㎖에 1g 카민 2.5 g 알루미늄 칼륨 설페이트 결합. 20 분 동안 교반하는 동안 끓인다. 이상 끓는 않도록주의하세요. 추가 증류수로 다시 500 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 항균 활성에 대한 티몰의 결정을 추가하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 병을 커버합니다. 각 사용하기 전에 실험실 등급의 종이 필터를 통해 필터링합니다. 최대 3 개월 카민 용액을 다시 사용합니다. 실온에서 저장, 빛으로부터 보호. </li></ol></li><li> 콜라게나 제 용액 / V w 0.125 %의 농도로 DMEM / F12 배지에서 콜라겐을 분해. 이 솔루션을 보관하지 마십시오. </li></ol> 쥐의 꼬리 콜라겐 타입 1 젤과 호르몬 치료 2. 3D 문화 T47D의 세포 참고 : 4 ° C에서 멸균 혈청 피펫과 피펫 팁을 유지합니다. <ol><li> 처리장단일 세포 현탁액을 Re 및 세포 수를 수행한다. 분할 T47D 세포 배양은 70 %의 합류에 도달하기 전에. 필요한 셀의 양을 포함하는 양을 원심 분리기. 한 젤은 약 75,000 T47D 세포를 포함하는 것을 고려하십시오. </li><li> 초기 피펫을 사용하여 콜라겐의 적절한 부피 세포 펠렛을 다시 일시. 각 겔은 콜라겐의 1.5 ml의로 구성되어 있음을 고려한다. 거품을 도입 피하기 위해 조심스럽게 세포와 콜라겐을 섞는다. </li><li> 세포의 분포에 정전기의 영향을 방지 판을 풀기 후 정전기 감소 브러시​​로 12 웰 플레이트의 경계, 상단과 하단 브러시합니다. 후드의 작업 표면과 접촉시 정전기의 발생을 방지하기 위해, 또한 정전기 감소 brush.Gently로 닦았 된 다른 12 웰 플레이트 (빈 접시)의 상단에이 판을 배치 믹스의 1.5 ml에 부어 12 웰 플레이트의 각 웰에. </li><li> 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 일을 제거전자 인큐베이터에서 플레이트와 후드에 다시 배치합니다. </li><li> P200 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 잘 국경에서 부드럽게 원을 그리 젤을 분리합니다. 겔은 웰의 바닥으로부터 분리한다. </li><li> CDFBS 배지에서 희석 호르몬 웰에 첨가한다. 10 -7 M 최종 농도에서 10 -10 M 최종 농도와 프로락틴에서 E2 및 R5020을 사용합니다. 대조군으로 추가 호르몬하지만 여전히 사용되는 호르몬 주식과 동일한 DMSO의 높은 볼륨을 포함하지 않고 CDFBS 미디어를 사용합니다. 각 잘 미디어 1.5 ml에 포함되어 있는지 확인합니다. 37 ° C, 5 % CO 2, 100 % 내부의 3D 문화를 배치 습도 조직 문화 인큐베이터. 2 일마다 미디어를 변경, 1 ~ 2 주 동안 문화를 유지한다. </li></ol> 전체 마운트 3. 젤 처리 <ol><li> 문화 미디어를 제거하고 각 웰에 PBS 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 슬라이드에 젤을 전송합니다. 곡선을 사용하여 반 겔을 잘라D 수술 블레이드. 절반으로 처리를 계속 조직 학적 분석을 위해 나머지 절반을 저장합니다. </li><li> 전체 슬라이드에 마운트의 절반 젤을 전송합니다. 5 분 동안 젤 건조하자 다음 10 % 포르말린을 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다. 참고 : 모든 배양은 실온에서 수행해야합니다. </li><li> 통 O의 /의 N에 코 플린 항아리에 젤을 수정합니다. </li><li> 세척 통에 10 분마다 두 번 PBS와 슬라이드. 전송은 70 %의 EtOH에 슬라이드; 통에 1 시간 동안 품어. 카마 졸업생 O / N로 전송 슬라이드. </li><li> 다음 날, 1 시간마다 70 % EtOH로 95 % EtOH로 100 %의 EtOH에 통에 슬라이드를 탈수. 이전 두 번 1 시간마다 자일 렌 통에 유지하는 슬라이드. 젤 1.5 mm 두께 된 커버를 탑재 톨루엔 기반 장착 매체를 사용합니다. </li><li> 일반 빛 (현미경 입체경)에서 전체 마운트를 검사합니다. 형상 및 루멘의 자세한 분석을 위해 공 초점 현미경을 사용하여 633 nm의 오펜 레이저와 카민 염료를 시각화. </li></ol>조직학 분석 처리 4. 젤 처리 <ol><li> 10 % 포르말린을 함유하는 20 mL 유리 바이알에 겔의 나머지 절반을 전송하고 진탕 O / N에 고정한다. </li><li> 통에 10 분마다 PBS로 두 번 젤을 씻으십시오. 파라핀 삽입에 대한 처리 카세트에 배치 젤. </li><li> 70 %의 EtOH로 전송 겔은, 1 시간 동안 배양하고 1 시간 동안 95 % EtOH로 다음 1 시간 동안 신선한 95 % EtOH로 변경, 100 %의 EtOH를 1 시간, 1 시간 동안 신선한 100 %의 EtOH로 변경합니다. 1 시간 동안 신선한 크실렌 다시 이때 겔은 실온에서 100 % EtOH로 O / N에 저장 될 수 있거나, 1 시간 동안 배양하고, 크실렌. </li><li> 전사 카세트 회 이상 신선한 파라핀 반복 진공 배양기에서 60 ℃에서 1 시간 동안 파라핀. </li><li> 깨끗한 파라핀 플라스틱 금형을 입력합니다. 카세트를 열고 젤을 제거하고 플라스틱 금형 포함 된 파라핀에 넣습니다. 파라핀과 함께 작성하고 상단에 라벨을 포함하는 카세트의 상단을 추가하고 블록이 식지. </li><li> 비접촉식를 제거IC에서 금형 및 섹션 마이크로톰을 사용하여 블록. 그는 염색 및 면역 세포 5 음 두꺼운 부분을 얻습니다. </li></ol> 콜라게나 치료를 사용하여 젤의 세포에서 세포의 5. 추출 <ol><li> 웰에서 겔을 제거하고 PBS를 함유하는 페트리 접시로 옮긴다. 린스 젤 잠시. </li><li> 0.125 % 콜라게나 제 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 겔을 전송. 작은 조각으로 젤을 파괴하기 위해 최대 피펫 아래로 4-5 시간. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 품어 (겔 용해 세포 현탁액에 때까지) </li><li> 혈청 보충 배지 2 ㎖를 추가합니다. 원심 분리 (1,000 XG, 5 분), 폐기 뜨는하여 세포를 수집, 세포를 다시 일시 중지하고 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

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여기에서는 유방 상피에 대한 호르몬의 작용을 테스트하기 위해 호르몬 민감성 3D 배양 모델을 설명합니다. 호르몬에 대한 반응은 조직 형태, 세포 증식 및 유전자 발현 수준에서 평가할 수 있습니다 12. 이 기술의 한 가지 한계는 배양이 플라스틱 바닥판에서 성장하기 때문에 배양 기간 동안의 시각화가 광학 현미경으로 제한된다는 것입니다. 3D 배양 시스템은 배양 1의 라이브 이미징을 허용하기 위해 유리 바닥판에 적용될 수 있습니다.
세포가 유지되는 방식은 호르몬 반응성 표현형의 유지에 중요한 것으로 보입니다. 이러한 세포에서 E2 반응성을 자주 확인하는 것이 중요합니다. 새 바이알을 해동한 후 네 번째 계대에서 E2 용량-반응 곡선을 수행하고, 그 이후에는 10회 계대마다 일상적으로 수행하는 것이 좋습니다. 10 -10 M의 E2 농도는 1주 동안 CDFBS 배지에서 성장한 것과 비교할 때 일반적으로 2D 배양에서 3배, 3...

표준 2D 배양과는 달리, 3 차원 세포 배양 대리 모델 생리 관련 컨텍스트 번 유사한 조직에서 상피 세포 행동 연구 허용한다. 유선의 3D 문화는 유선 개발 및 신 생물의 여러 측면을 명료하게 도왔다. 그러나, 현재 3D 배양 모델의 대부분은 작업에 사용되는 인간 상피 세포주 호르몬 수용체 발현 6,7,9 부족하기 때문에 호르몬 작용을 연구하는 것이 적합하다. 여기서, 우리는 호르몬 작용 (12) 연구에 적합 인간의 유방 상피 세포의 3 차원 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 원래 유방 침투 유관 암종 54 세의 여성 환자로부터 얻은 흉수에서 파생 된 시판 호르몬 응답 인간 유방 상피 세포주 T47D 3,11,13을 사용한다. 우리는 매트릭스 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1을 사용합니다. 이 3D 숭배URE 모델은 인간 유방 상피 세포에 대한 세 가지 mammotropic 호르몬 (에스트라 디올, promegestone (황체 호르몬의 유사체) 및 프로락틴)의 작용의 연구에 적합하다. 호르몬에 의한 상피의 형태는 형태 계측 학적 분석 (12)에 의해 시간이 지남에 따라 정량적으로 평가 될 수있다. 적절한 파종 밀도는 이러한 3D 문화 2 주 동안 유지 될 수 있습니다. 현재까지 구조물의 발달은 상피 형태에서 호르몬 작용 강력한 정량 평가 충분하다. 겔은 세포 증식에​​ 대해 이전 시점에서 수확 될 수 있고, 유전자 발현 분석. 또한,이 모델은 순차 호르몬 치료의 효과를 시험하기에 적합하다; 예를 들어, 다음 주 중에 호르몬의 다른 호르몬 / 조합으로 첫 주 동안 에스트라 디올 치료 및 교체 후. 예컨대 ICI 182,780 같은 항 에스트로겐 화합물 및 에스트로겐의 효과도 STU 수이 3D 문화 모델 (12)를 사용하여 죽었다.

<table><tbody><tr><td>12웰 조직 배양 플레이트(매)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15ml 폴리스티렌 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>활성탄</td><td>시그마</td><td>C-5510</td><td></td></tr><tr><td>카민 명반</td><td>시그마</td><td>C1022-100G</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 3</td><td>Worthington</td><td>S0C11784</td><td></td></tr><tr><td>HeNe</td><td></td><td></td><td>633nm 레이저</td></tr><tr><td>Dextran T-70</td><td>Abersham/Pharmacia</td><td>17-0280-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, 페놀 레드 없음&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11339-021</td><td>호르몬 사용을 위한 페놀 레드 프리 미디어</td></tr><tr><td>DMEM, 저포도당, 피루브산, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음</td><td>Life Technologies</td><td>11054-020</td><td>호르몬 사용을 위한 페놀 레드 프리 미디어</td></tr><tr><td>17-&beta;-Estradiol</td><td>EMD Millipore</td><td>3301</td><td>에탄올에 용해</td></tr><tr>에<td>탄올</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>호르몬과 함께 사용하려면 숯 덱스트란을 제거해야 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>필터 (115 ml)</td><td>Nalgene</td><td>380-0080, 245-0045, 120-0020</td><td>0.88, 0.45, 0.20 micron, 각각&nbsp;</td></tr><tr><td>포르말린, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93-20</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780 (풀베스트런트)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4409-25MG</td><td>DMSO 마이크로톰에 용해됨</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>조직 포매 매체</td><td>McCormick Scientific</td><td>39502004</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>시그마</td><td>7794-10MU</td><td>증류수 10ml에 용해</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>프로락틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L4021-50UG</td><td>증류수 탈이온수에 용해</td></tr><tr><td>Promegestone</td><td>Perkin Elmer</td><td>NLP004005MG</td><td>에탄올</td></tr><tr><td>랫테일 콜라겐에 용해됨&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>354236</td><td>로트는 다양한 농도를 포함할 수 있으니, 주의하십시오</td></tr>. <tr><td>Scalpel</td><td>Miltex</td><td>4311</td><td></td></tr><tr><td>반밀폐형 벤치탑 티슈 프로세서</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5881</td><td>1N NaOH 재고 준비</td></tr><tr><td>StaticMaster 안티스태틱 브러시&nbsp;</td><td>Amstat</td><td>C3500</td><td></td></tr><tr><td>스트라이프 혈청학 피펫&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>T-25 플라스크</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430168</tr><tr><td>조직 카세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-403E</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Vials, 유리, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>자일렌&nbsp;</td><td>폭스바겐</td><td>95057-822</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3d 문화 모델

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

유방 상피 형태 형성 과정은 호르몬의 영향을 받습니다. 2D 배양을 사용하여 유방 상피에 대한 호르몬 작용에 대한 연구는 세포 증식 및 유전자 발현 종말점으로 제한됩니다. 그러나 유기체에서 유방 형태 형성은 3D 환경에서 발생합니다. 3D 배양 시스템은 단층 세포 배양(2D)과 유기체의 복잡성 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 호르몬 작용을 연구하기에 적합한 인간 유방 상피의 3D 배양 모델을 설명합니다. 시판되는 호르몬 반응성 인간 유방 상피 세포주, T47D 및 쥐꼬리 콜라겐 유형 1을 매트릭스로 사용합니다. 이 3D 배양 모델은 주요 유방자극 호르몬인 에스트라디올, 프로게스틴 및 프로락틴에 반응합니다. 이러한 호르몬이 상피 형태 형성에 미치는 영향은 종말점에 따라 1주 또는 2주 치료 후에 관찰할 수 있습니다. 3D 배양물은 상피 형태 형성, 세포 증식 및 유전자 발현 분석을 위해 수확할 수 있습니다.

도 1은 호르몬 성 3 차원 배양 물을 제조하는 절차를 요약 한 것이다. 상피 구조 단독 E2의 존재하에 2 주 동안 배양 및 다른 호르몬과 조합하여 겔 마운트 전체에서 관찰된다. 어떤 호르몬은 배양 배지 (CDFBS 매체) (그림 2)에 추가되지 않은 경우에만 단일 세포 또는 2-3 셀 그룹이 존재한다. 이 상태는 음성 대조군으로 작용한다. 모양, 크기, 루멘 존재 다를 3D 문화 양식 구조에서 셀. 겔 구조의 분포는 일반적으로 불균일하다. 이전에 나타낸 바와 같이, 중앙 4에서 볼보다 겔의 경계를 따라 일반적으로보다 구조가있다. 이 때문에 공간 이질의, 표본 간의 비교는 샘플에 걸쳐 지역 대응으로 제한되어야한다. 콜라겐 타입 1이 영향을 표현형을 유도하는 종결과 상피 구조 5 차 품질. 여기에 사용 된 쥐의 꼬리 콜라겐 타...

호르몬 작용을 연구하기에 적합한 인간 유방 상피의 3D 배양 모델을 설명합니다.

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

생리학적으로 유의미한 이 3D 배양법의 전반적인 목표는 주요 유선 형성 호르몬이 유선 상피 형태 형성(morphogenesis)에 미치는 작용을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 에스트로겐, 프로게스테론 및 프로락틴이 유선 상피 형태 형성에 어떤 영향을 미치는지와 같이 내분비학 및 유선 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 표준화된 방법의 주요 장점은 호르몬 민감성 유선 상피 세포가 체내(in vivo)에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 호르몬에 반응하여 3D 구조를 형성한다는 점입니다.이 기술은 복잡한 인간 유방 상피의 생리학적 관련 배양 시스템이므로, 그 영향은 유방암 치료법으로 확장될 수 있습니다. 우리는 인간 유방 형태 형성 과정이 호르몬의 영향을 받는 방식을 연구하기 위한 표준화된 in vitro 모델이 부족하다는 점에 주목하여 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 먼저 T47D 세포의 단일 세포 현탁액 내 세포 수를 측정하는 것으로 시작하십시오.세포 유지 방법은 호르몬 반응성 표현형을 유지하는 데 매우 중요합니다. 새로운 바이알을 해동한 후 4번째 계대 및 이후 매 10회 계대마다 T47D 세포의 반응성을 정기적으로 확인하는 것을 권장합니다. 그런 다음 겔당 75,000개의 세포를 원심 분리하여 가라앉힙니다.그리고 차가운 피펫을 사용하여 겔당 1.5 milliliters의 콜라겐에 펠렛을 기포 없이 부드럽게 재부유시킵니다. 다음으로, 정전기 방지 브러시를 사용하여 12-well 플레이트의 상단과 하단 테두리를 닦아냅니다. 그리고 이 플레이트를 정전기가 제거된 또 다른 빈 12-well 플레이트 위에 올려놓습니다.겔 준비 과정 중 발생하는 정전기는 세포 분포에 영향을 미쳐, 겔을 도포하는 동안 세포가 바닥으로 가라앉아 2D 모델 층으로 성장하게 만들 수 있습니다. 플레이트가 준비되면, 세포-콜라겐 혼합물 1.5 milliliters를 각 웰에 조심스럽게 더 넣습니다. 그런 다음 플레이트를 37 degree Celsius 인큐베이터에 넣습니다.30분 후, 호르몬이 첨가된 갓 조제한 cdFBS 배지 1.5 milliliters를 각 웰에 추가합니다. 그리고 멸균된 P200 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 원을 그리듯 움직여 각 겔을 웰의 가장자리에서 조심스럽게 떼어냅니다. 그 다음, 3D 배양물을 37 degree Celsius, 5%CO2, 100%humidity 조건의 조직

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.

인지질 매개체는 3차원 배양에서 형질전환을 유도했습니다.

이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

이 프로토콜은 통제된 3차원 배양 시스템에서 유선의 형태형성의 주요 특징을 재현하는 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법을 설명합니다.

유방 형태 형성을 재현하는 3차원 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법

학습하세요 인간 유선 상피 세포의 3D 배양법을 통해 호르몬이 유방 상피 형태 발생에 미치는 영향을 연구하는 방법을. T47D 세포를 활용한 이 표준화된 기법은 생리학적으로 관련성 높은 유방암 치료 연구에 활용됩니다.

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

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