Name: 내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 학습하세요 강자성 베어 메탈 스텐트를 이용한 내피 세포 캡처 및 유지 방법을. CAD와 FEA를 활용한 설계와 돼지 실험을 통해 검증된 이 기술은 심혈관 기기의 치유와 혈액 적합성 향상에 기여합니다.

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저자는 Tyra Witt, Cheri Mueske, Brant Newman 및 Dr. Peter J. Psaltis, MBBS, PhD의 귀중한 기여에 감사드립니다. 이 연구는 유럽지역개발기금(European Regional Development Fund, FNUSA-ICRC)의 재정 지원을 받았다(No. CZ.1.05/1.100/02.0123), 미국심장협회 과학자 개발 보조금(AHA #06-35185N), 미국 국립보건원(T32HL007111) 및 그레인저 혁신 기금 – 그레인저 재단.

모든 동물 실험은 메이요 클리닉에서 기관 동물 관리 및 이용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 2205 스테인레스 스틸 스텐트 1. 설계 및 분석 <ol><li> CAD를 사용하여 베어 메탈 스텐트 설계 <ol><li> 스텐트 스트럿 두께와 같은 벽 두께와 &#39;돌출 보스 /베이스&#39;기능을 선택하여 압출 중공 실린더를 확인합니다. </li><li> 압출 실린더 접선 다른 스케치 평면에 스텐트 패턴을 디자인합니다. 압출 중공 원통의 원주에 일치하도록 평면 패턴의 폭을 만든다. </li><li> 랩 기능을 사용하여 중공 실린더에 플랫 패턴 디자인을 전송합니다. </li><li> 네이티브 형식으로도 FEA에 대한 수출 될 ACIS 형식으로 파트를 저장합니다. </li></ol></li><li> 스텐트 모델의 유한 요소 해석 <ol><li> 더 분​​석가에 대한 유한 요소 해석 소프트웨어의 일부 모듈에 ACIS 형식으로 저장 솔리드 형상을 가져 오기이다. </li><li> FEA 소프트웨어의 일부 모델러의 스텐트에 동축 2 분석 실린더 모델입니다. 외측 실린더는 크림 퍼 시뮬레이션 스텐트의 직경보다 큰 직경을 갖는 초기 및 내측 실린더는 인플레이션 풍선을 시뮬레이트하도록 1mm의 초기 직경을 갖는다. </li><li> 위를 조립하는 어셈블리 모델러의 &#39;인스턴스&#39;트리 항목을 더블 클릭 상대 위치에 부품을 말했다. </li><li> 감소 통합 20 노드 육면체 요소로서 요소 유형을 지정 FEA 소프트웨어 메쉬 모듈을 사용하여 소자의 크기를 지정하고, 상기 스텐트 메쉬. </li><li> 스텐트 및 모델 트리의 &#39;상호 작용의 특성&#39;에 각각 두 개의 실린더 사이의 마찰 강성 접촉 쌍을 지정합니다. </li><li> 스텐트 모델로 2205 스테인레스 스틸의 탄소 성 응력 - 변형 동작을 지정합니다. </li><li> 우선 C 시뮬레이션 1mm로 외통 압착하는 경계 조건을 정의스텐트의 rimping. 압착 스텐트의 휴식을 시뮬레이션하기 위해 외부 실린더를 제거합니다. 확장을 시뮬레이션 3mm로 내부 실린더를 확장하고 마지막으로, 스텐트의 반동을 시뮬레이션 할 수있는 내부 실린더를 제거합니다. </li><li> &#39;분석&#39;모델 트리 항목에 할당 된 프로세서와 RAM의 양의 수를 포함한 시뮬레이션 매개 변수를 정의하고 시뮬레이션을 실행합니다. </li><li> 시뮬레이션이 완료되면, 주 균주를 연구 결과 결과 파일 (filename.odb) 및 후 처리를 열고 반복적 재료의 파괴​​ 한도보다 작은 20 %의 주요 스트레인을 달성하기 위해 스텐트 디자인을 향상 . </li></ol></li></ol> 압착 및 확장 2. 스텐트 제조 및 테스트 <ol><li> 스텐트 제조 <ol><li> 이러한 개척자의 액션 정밀 제품으로 정밀 가공 회사에서 총 시추 및 정밀 연삭 바 원재료로 2205 스테인레스 스틸 튜브를 확보,OH. </li><li> 레이저 절단 및 전해에 대해 같은 워키 건, 일리노이 Laserage 기술 공사로 스텐트 절단 회사에 정밀 연마 튜브 및 플랫 패턴 스텐트 디자인을 전송합니다. </li><li> 또 다른 10 분 동안베이스 (10 %의 NaHCO3) 다음에 10 분 동안 강산 (50 % 염산)에 의해 그들을 담근다 전해 스텐트의 표면을 패시베이션. 주의 : 적절한 보호 장비와 흄 후드에서 화학 물질을 처리합니다. 마지막으로, 에틸 알코올 및 탈 이온수로 스텐트를 씻는다. 이 프로세스는 산세 불린다. </li></ol></li><li> 압착 및 확장을위한 제조 된 스텐트의 시험 <ol><li> 도구를 압착 개최 손을 사용하여 3 중 풍선에 스텐트를 압착. 스텐트와 압착 공구의 3 중 풍선을 잡으십시오. 방사상으로 풍선에 압착 할 수있는 스텐트를 변형 핸들을 누릅니다. </li><li> 균일 압착에 대한 현미경에 의한 구조의 실패의 흔적을 사용하여 압착 스텐트를 검사소성 변형. </li><li> 물 3 중 풍선을 가압하여 3mm의 설계 직경을 확장합니다. 미세 골절 균일 확장을위한 확장 된 스텐트를 검사합니다. </li></ol></li></ol> 잉여금 자기장에 대한 스텐트 3. 특성 주 : 2 인치 직경 1 인치의 높이의 원통 자석을이 연구에 사용 하였다. 자석의 극 축을 따라 정렬됩니다. 자석의 표면 자속 밀도는 약 1 T. <ol><li> 강한 네오디뮴 자석을 사용하여 직경 방향 또는 축 방향으로 자화 된 스텐트. 자화 약 1 분 동안 강한 자석에 가까운 스텐트를 잡습니다. </li><li> 직경 자기 또는 축 방향으로 자화 자기장 라인을 따라 축과 원통면 옆에 스텐트를 보유 할 자력선을 따라 직경이 평탄면 중 하나에 상기 스텐트를 잡아. 잉여금 자기 한 느낌스텐트의 D는 적어도 24 시간 동안 안정하지만, 자화 후 가능한 빨리 스텐트를 사용하는 것으로 확인되었다. </li><li> 유리 맨드릴 상에 개별적으로 스텐트를 장착 한 다음 자기 프로빙 조명기의 정밀 척에 유리 맨드릴 마운트. 자성 마이크로 센서 프로브 정확하게 XYZ가 자기 프로빙 어셈블리의 조명기를 사용하여 스테이지면 (도 4)를 만지지 않고 스텐트 부근에 위치 될 수있다. </li><li> 멀리 스텐트에서 자성 마이크로 센서의 기준선 판독을 측정하고 자기 프로빙 조명기의 XYZ 스테이지를 사용하여 프로브를 위치시킴으로써 상기 스텐트의 표면에 잔류 자기장을 측정한다. </li></ol> 4. 자기 세포 캡처 연구 <ol><li> 얻기 세포, 형광 염료와 SPION 및 염색 라벨 <ol><li> 5,7에 기재된 돼지의 말초 혈액으로부터 내피 세포 생장 (EOC)를 도출. unti했다 T-75 플라스크 문화L 약 80 %의 합류 (5 × 6 6 8X10에 세포). </li><li> 10 nm의 직경 마그네타이트 FE (3 O 4) 8,9에 기재된 바와 같이 50 nm 두께의 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 쉘에 의해 둘러싸인 코어로서 SPIONs 합성. </li><li> O 37 ℃에서 16 시간 동안 세포 배양 배지의 200 μg / ml의 농도로 유도 SPION EOC 부화 </li><li> 부드럽게 세포 배양 배지를 흡인. 부드럽게 플라스크에 인산 완충 식염수 (PBS) 10 ㎖를 첨가 요동하고 PBS를 흡입하여 세포를 세척한다. </li><li> 실험 중 시각화 형광 염료 (CM-DII)와 세포를 얼룩. 이는 5 μL / ㎖의 농도로 세포 배양 배지 10 ㎖에 염료를 첨가하여 37 ℃에서 30 분 동안 세포와 함께 배양하여 제조사의 지침에 따라 수행된다. </li><li> 단계 4.1.4에서와 같이 PBS로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 용액 3 ㎖로 배양플라스크에서 세포를 올립니다. </li><li> 5 분 세포 펠렛을 형성하기 위해 500 XG에 PBS로, 15ml의 원뿔형 튜브에 가기를 세포 현탁액을 전송하고, 원심 분리기. </li><li> 1-2x10 106 세포 / ml의 농도로 PBS에 세포 펠렛을 다시 중지하고 수회와 원추형 튜브의 피펫 팅하여 잘 혼합한다. </li></ol></li><li> 체외 세포 연구 <ol><li> 설계 및 제작합니다 (예를 들어, 3D 인쇄) 단지 유리 커버 슬립의 표면 위의 스텐트를 유지하는 간단한기구. </li><li> 전자기 자기야을 이용한 스텐트 탈자 또는 강한 네오디뮴 자석을 사용하여 직경 방향 또는 축 방향으로 자화 스텐트. </li><li> 축 방향으로 자화 된 직경 자기 또는 비 착자 제어 스텐트를 포함하는 접시로 PBS에 현탁 SPION 라벨링 EOC 피펫. 이미지 반전 형광 현미경을 사용하여 즉시 형광을 위해 PBS에 현탁 EOC와 스텐트. </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. 인 - 생체 내 동물 연구 <ol><li> 스텐트 시술 <ol><li> 4 건강한 요크셔 돼지에서 말초 혈액을 그립니다 - 5,7에 설명 된대로 삼주 전에 각각 주입 스텐트 문화 EOC하기 - 약 50 kg의 무게. </li><li> (매일 아스피린 325 밀리그램과 클로피도그렐 75 mg)을 수술 3 일전부터 항 혈소판 약물을 관리합니다. </li><li> 스텐트 시술 당일, 근육 Telazol, 크 실라와 아트로핀과 돼지를 마취 (5 / 2-3 / 0.05 밀리그램 / 각각 ㎏) 해당 기관의 동물 관리 및 사용 지침에 명시된대로. </li><li> 삽관 및 1-2.5 % 아이소 플루 란 마취의 흡입에 돼지를 놓습니다. </li><li> 돼지의 복부 목 영역을 면도하고 일반 멸균 조건의 절차를 실시하고 있습니다. </li><li> 임플란트 (1) 및 기준 자화 심장 도관 기술을 이용하여 우측 관상 동맥 (RCA)에 1 비자 성 스텐트. <ol><li> Cathete동물의 rization은 훈련 중재 심장 전문의에 의해 수행되어야한다. 9 프랑스어 칼집과 오른쪽 경동맥에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 목표 관상 동맥 Cannulate 및 투시 화상을 얻기 위해 요오드화 조영제를 주입. </li><li> 동맥에서 0.014 인치 표준 관상 동맥 가이드 와이어를 놓습니다. 풍선을 사전이 가이드 와이어를 이용하여 스텐트 3-3.5 mm 직경의 혈관에 스텐트를 배포합니다. </li></ol></li><li> 와이어 풍선 위에를 사용하여 이식 된 스텐트에 대한 RCA 근위 내의 혈류를 폐색하고 2 분 동안 중심 카테터를 통해 PBS 4 mL에 현탁 SPION 표지 약 2 × 6자가 EOC을 제공한다. </li><li> 추가 폐색의 2 분 후 RCA 혈액의 흐름을 복원합니다. </li><li> 회복실에 동물을 전송하고이 의식을 회복 할 때까지 밀접하게 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 항 혈소판 약물을 투여 계속 (아스피린 325 밀리그램과 클로피도그렐 75mg)을 희생 할 때까지 작동 가능 게시합니다. </li></ol></li><li> 스텐트 이식편 및 조직학 <ol><li> 이전에 설명한 바와 같이 첫 번째 동물을 마취하여 동물에게 수술 후 7 일 안락사 후 정맥 적용 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 나트륨 펜 토바 비탈 (100 ㎎ / ㎏)의 치사량을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 수술 스텐트 동맥 세그먼트를 수확. 30 분 이상 동안 10 % 포르말린 버퍼 외식 동맥 수정. 또한 조직 학적 분석을 위해 포르말린 버퍼에 샘플을 남겨주세요. </li><li> 금속 스텐​​트 조직학을 수행 할 수있는 설비에 고정 된 샘플을 아웃소싱. 이 처리 중에, 샘플은, 메틸에 포함되는 횡단 및 철 입자 러시안 블루 염색으로 염색 된 Mallory의 기법을 사용하여 조직 학적 분석. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 베어 메탈 스텐트의 기능을 할 수 있으며 SPION 표지 내피 세포를 유치 할 수있는 자기 스텐트를 개발했다. 자기 스텐트와 관련된 이전 연구에서 연구팀은 (는) 강자성 스텐트 5,10-14의 불가능에 자성 재료로 만든 니켈 코팅 된 상업 스텐트 및 코일 또는 메쉬를 사용했습니다. 다른 그룹은 나노 입자로드 내피 세포 3을 대상으로 시판 304 등급의 스테인레스 스틸 스텐트의 상자성 특성을 사용했다. 스텐트를받는 환자 및 상자성 스텐트 유치 및 자성 나노 입자를 유지하도록 3,5- 외부 자장을 필요에 니켈 코팅은 극성 일 수있다. 따라서, 설계 및 기능 강자성 스텐트를 개발하는 것은 셀 배달 어플리케이션뿐만 아니라 다른 임상 적용 10,15-20 중요하다. 2,205 스테인리스 - - 본 연구를 위해 선택된 재료의 양면 특성상 w를 만든다강자성 eakly. 예컨대 316L 스테인레스 (70 %) 6,21,22</s...

스테인리스스틸, 코발트 크롬, 백금 크롬과 같은 혈전성 물질로 제조된 혈관 스텐트(베어 메탈 스텐트(BMS) 및 약물 방출 스텐트(DES))를 이식받은 환자는 혈전 형성을 방지하기 위해 항혈소판 요법이 필요합니다. 진동자극(BMS)은 빠르게 치유되지만 불완전한 치유로 인해 말기 재협착의 영향을 받습니다. DES는 치유가 지연되어 장기적인 항혈소판 요법이 필요합니다. 치유가 불완전하거나 지연되어 혈전증이 생기는 것을 피하기 위해 항혈소판제는 출혈 위험을 증가시키고 특정 환자에게는 적합하지 않을 수 있다1,2. 이상적인 스텐트는 완전하고 빠르게 치유되므로 장기적인 항혈소판 요법과 말기 재협착을 피할 수 있습니다. 이러한 완전한 치유는 이식 후 스텐트가 내피 세포의 단층으로 빠르게 코팅되는 경우에만 달성할 수 있습니다. 금 또는 기타 생체 고분자와 같은 생체 적합성 물질로 스텐트를 코팅하면 혈전 저항성이 향상되는 것으로 나타났지만, 이러한 기술 중 어느 것도 내피 세포로 코팅하여 가능한 이상적인 혈액 호환성을 달성하지 못했습니다3,4.
스텐트는 순환하는 전구 세포를 끌어당겨 이식 후 내피 세포로 코팅할 수 있습니다. 이 자체 파종 기술은 리간드와 항체를 활용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 순환하는 내피 전구 세포의 수가 적기 때문에 제한됩니다. 유망한 전략은 짧은 기간의 혈류 폐색 동안 이식 직후 스텐트에 세포를 직접 전달하는 것입니다3,5. 이 전략에는 세포를 빠르게 포획하여 혈류를 회복한 후에도 스텐트에 세포를 유지하는 기술이 필요합니다. 우리는 자기 스텐트를 사용하여 이식 후 전달된 자기 표지된 내피 세포를 끌어당기고 유지하는 기술을 개발했습니다. 이를 위해서는 자기적으로 표지된 내피 세포를 포착하고 유지할 수 있는 충분한 자기 특성을 가진 기능적 BMS가 필요합니다6.
이 백서에서는 2205 스테인리스강 스텐트를 설계, 제조 및 테스트하는 방법에 대해 설명합니다. 스텐트는 CAD와 FEA를 사용하여 설계되었습니다. 제조된 스텐트는 네오디뮴 자석을 사용하여 자화되었으며 잔류 자기장은 자기 저항 마이크로센서 프로브를 사용하여 측정되었습니다. 그런 다음 체외 실험 중에 배양 접시에서 자기 표지된 세포 포획을 위해 스텐트를 테스트했습니다. 마지막으로, 스텐트는 4마리의 돼지에 자기 및 비자성 스텐트를 이식하고 스텐트 동맥을 조직학적으로 분석하여 생체 내에서 테스트되었습니다.

<table><tbody><tr><td>2205 스테인레스 스틸</td><td>Carpenter Technology Corporation</td><td></td><td>라운드 바 스톡 재료</td></tr><tr><td>Abaqus</td><td>Dassault 시스템</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>아트로핀</td><td></td><td></td><td>처방약.</td></tr><tr><td>클로피도그렐</td><td></td><td></td><td>상업명: Plavix. 처방약.</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Life Technologies</td><td>V-22888</td><td>분자 프로브, Eugene, OR</td></tr><tr><td>내피 성장 매체-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 압착 도구</td><td>Blockwise engineering</td><td>M1-RMC</td><td></td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00011324</td><td>주의: 보호 장비를 착용하고 흄 후드</td></tr><tr><td>Isoflurane 마취</td> 아래에서 다루십시오.<td>Piramal Critical Care, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>NdFeB 자석 2 "Dia x 1"두께</td><td>놀라운 자석</td><td>D1000P</td><td>축 방향 자화 디스크 자석 평면면에 극이 있음</td></tr><tr><td>Over-The-Wire 삼중 풍선</td><td></td><td></td><td>상업적으로 이용 가능한 모든 OTW 삼중 풍선을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>일반적으로 PBS</td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이트 (NaHCO3)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>MFCD00003528</td><td></td></tr><tr><td>소듐 펜토바르비탈</td><td>Zoetis</td><td></td>로 알려져 있습니다<td>. 상업적인 이름: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.&nbsp; 허가된 수의사만 주문할 수 있는 규제 물질</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault 시스템</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>SpinTJ-020 마이크로 센서</td><td>MicroMagneitcs Sensible Solutions</td><td></td><td>Long probe STJ-020 마이크로센서</td></tr><tr><td>SPION</td><td>Mayo Clinic</td><td></td><td>내부적으로 합성된 나노 입자(참조: Lee, S. J. et al. 폴리(D,L 라타이드-코-글리콜라이드)로 캡슐화된 자성 산화철의 나노 입자 그리고 자기 공명 영상 조영제에 대한 그들의 응용. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi : DOI 10.1016 / j.jmmm.2003.12.416 (2004))</td></tr> <tr><td>Telazol</td><td>Zoetis</td><td></td><td>규제 물질은 면허가있는 수의사</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Gibco, Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Animal Health</td><td></td><td>상업명 : Rompun. 면허가 있는 수의사만 주문할 수 있는 통제된 일광</td></tr></tbody></table>욕

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

심혈관 스텐트에 내피 세포가 급속 스텐트 혈전증을 감소시키고 출혈 위험을 줄일 수있는 항 혈소판 요법을 피하기 위해 필요하다. 초 상자성 산화철 나노 입자 (SPION)로 표지 내피 세포 생장 (EOC)를 캡쳐하고 유지하기 위해 자력을 이용의 가능성은 이미 밝혀졌다. 그러나이 기술은 빠른에 내피 증명 시험관 내 및 생체 내 시험 하였다 자기 및 생체 물질로부터 기계적 작용 성 스텐트의 개발이 필요하다. 우리는 컴퓨터 이용 설계 (CAD)를 이용하여 2,205 듀플렉스 스테인레스 약하게 강자성 스텐트를 개발하고 설계는 또한 유한 요소 해석 (FEA)을 사용하여 정제 하였다. 스텐트의 최종 설계는 기계적 권축과 팽창시에 재료의 파단 한계 이하 주 변형률을 나타냈다. 백 스텐트를 제작하고, 그 중 일부는 기계적 시험, RET에 사용 된ained 자기장 측정 시험관 세포 캡처 연구 및 생체 내 주입 연구. 텐 스텐트은 실패없이 사이클을 압착 및 확장 입었 있는지 확인하기 위해 배포를 테스트 하였다. 다른 스텐트 (10)는 강한 네오디뮴 자석을 이용하고, 그들의 자화 유지 자기장을 측정 하였다. 스텐트는 유지 자기가 우리의 시험관 연구에서 SPION 표지 EOC를 캡처하기에 충분한 것으로 나타났다. SPION 표지 EOC 캡처 및 보유 1 자화 스텐트 4 돼지의 각 1 비 자화 제어 스텐트를 주입하여 큰 동물 모델에서 확인되었다. 스텐트 동맥 7 일 이후 외식 및 조직 학적으로 분석 하였다. 본 연구에서 개발 된 약하게 자기 스텐트 유치와 빠른 치유를 촉진 할 수 SPION 표지 내피 세포를 보유 할 수 있었다.

<html> FEA (도 1)에 기초하여 반복적 스텐트 디자인은 압착 및 30 %의 궁극적 인 스트레인 미만 20 %의 주요 균주 스텐트 확장 할 수 있었다. 압착 및 확장 테스트 (그림 2) 골절의 징후를 보이지 않았다. 변형 된 스텐트의 사진은 FEA 계산 변형와 잘 일치를 보였다 또한 현미경 사진은 골절을 (그림 3)가 없었다. 유지 자기장 측정 (그림 4 및 5)에서 예상대로, SPION 표지 세포는 우선적으로 축 방향으로 자화 스텐트에 구부러진 부분에 매력을보다 균일 한 직경 자기 스텐트 (그림 6)에서 직선 세그먼트에 매료되었다. 조직학 이미지는 칠일 주입 기간 (그림 7) 동안 스텐트에 EOC 유치 및 유지를 증명하는 스텐트 스트럿 근처 철 염색을 보여 주었다. &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files...

우리의 목표는 설계, 제조 및 내피 세포 캡처를위한 강자성 스텐트를 테스트했다. 열 스텐트 파괴에 대해 시험하고, 10 이상이 유지 자성 스텐트에 대해 시험 하였다. 마지막으로, 10 스텐트는 시험관 시험하고 8 개의 스텐트는 세포 캡처 및 보존을 보여 4 돼지에 이식했다.

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

본 실험의 전반적인 목표는 자기 나노입자가 표지된 혈관 내피세포를 포착하고 유지할 수 있는 강자성 무코팅 금속 스텐트를 개발하는 것입니다. 이를 위해 컴퓨터 보조 설계(CAD) 및 유한 요소 분석(FEA) 소프트웨어를 사용하여 2205 스테인리스강 스텐트를 설계함으로써, 압착 및 확장 과정 중 스텐트 재료와 구조의 기계적 거동을 정확하게 파악합니다. 이후, 제작된 스텐트를 기계적으로 압착 및 확장하여 기계적 무결성을 입증하고, 스텐트의 자기장 유지력을 연구하여 자기적 거동을 검증합니다.그런 다음 스텐트를 돼지에 삽입하고 자성 나노입자로 표지된 혈관 내피세포를 전달하여 관상동맥 순환 내에서의 세포 포획 및 유지 여부를 검증합니다. 결과적으로, 생체 내 실험에서 적출한 혈관의 조직학적 분석을 통해 본 연구에서 개발한 강자성 스텐트가 자성 표지된 혈관 내피세포를 포획하고 유지할 수 있음을 확인하였습니다. 신속한 내피화는 치유를 촉진하고 혈액 적합성을 향상시킬 수 있으므로, 이 기술의 함의는 다양한 심혈관 장치 개발로 확장될 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 생소한 연구자들은 스텐트 설계에 포함된 CAD 및 FEA 절차의 복잡성으로 인해 어려움을 겪으며, 세포 배양 또한 초보자에게는 도전적인 과제가 될 수 있습니다. 엄격한 무균 환경 유지의 중요성 때문에, 저희는 스텐트의 치유 능력을 향상시키고자 했으며 이에 생체 세포를 스텐트에 부착시키기 위해 자기력을 이용하는 아이디어를 고안하였습니다. 크림핑(crimping) 및 확장 과정 중 발생하는 재료 거동의 복잡성과 스텐트의 자기적 세포 포집 방식의 신규성으로 인해 스텐트 개발 및 세포 부착 단계는 학습하기 까다로우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저, CAD 소프트웨어를 사용하여 벽 두께를 스텐트 스트럿 두께와 동일하게 설정한 돌출 보스/베이스 기능을 선택함으로써 돌출된 중공 실린더를 제작하십시오. 돌출된 실린더에 접하는 별도의 스케치 평면에 스텐트 패턴을 설계하십시오. 평면 패턴의 너비를 돌출된 중공 실린더의 둘레와 일치하도록 설정하십시오.Wrap 기능을 사용하여 평면 패턴 설계를 중공 실린더로 전사합니다. 해당 파트를 기본 포맷과 FEA 수출용 ACEs 포맷으로 각각 저장합니다. 유한 요소 분석을 수행하려면, ACEs 포맷으로 저장된 솔리드 기하학 구조를 FEA 소프트웨어의 파트 모듈로 가져와 소프트웨어의 파트 모델러에서 추가 분석을 진행합니다. 스텐트에 동심이 되도록 두 개의 분석용 실린더를 모델링합니다. 어셈블리 모델러의 인스턴스 트리 항목을 더블 클릭하여 FEA 소프트웨어의 메쉬 모듈을 통해 파트들을 상대적 위치에 맞춰 조립합니다.요소를 20노드 6면체 감소 적분 요소(20 node hexed element with reduced integration)로 지정하십시오. 모델 트리의 상호작용 속성 내에서 요소 크기를 지정하고 스텐트를 메싱하십시오. 스텐트와 두 실린더 사이에 각각 마찰이 없는 강체 접촉 쌍(frictionless rigid contact pairs)을 지정하십시오.2205 스테인리스강의 ELA 응력-변형률 거동을 스텐트 모델에 할당합니다. 우선 외부 실린더를 1mm까지 압착하여 크림핑 과정을 모사하도록 경계 조건을 정의합니다. 이후 외부 실린더를 제거하여 크림핑된 스텐트의 이완을 모사합니다.팽창을 모사하기 위해 내부 실린더를 3mm까지 확장하고, 마지막으로 내부 실린더를 제거하여 스텐트의 반동을 모사합니다. 시뮬레이션이 완료되면 결과 파일을 열고 결과를 후처리하여 주 변형률(principle strains)을 분석합니다. 재료의 파괴 한계보다 낮은 20%의 주 변형률을 달성할 수 있도록 스텐트 설계를 반복적으로 개선합니다.퓸 후드 내에서 적절한 보호 장구를 착용한 상태로 2205 스테인리스강 튜브를 확보하고 텍스트 프로토콜에 따라 스텐트를 절단한 후, 전해 연마된 스텐트의 표면을 부동태화하기 위해 50% hydrochloric acid에 10분간 침지하고, 이어서 10% sodium bicarbonate에 다시 10분간 침지하여 산세척(acid pickling)을 완료합니다. 에탄올과 탈이온수로 스텐트를 세척합니다. 그 후, 스텐트의 크림핑(crimping) 테스트를 위해 스텐트와 3단 접이식 풍선을 잡습니다.핸드헬드 크림핑 툴의 핸들을 눌러 벌룬 위에 크림핑할 스텐트를 변형시킵니다. 현미경으로 크림핑된 스텐트를 관찰하여 크림핑이 균일한지 및 결함 징후가 없는지 확인한 후, 물을 사용하여 3중 접힘 벌룬(trifold balloon)에 압력을 가해 스텐트를 설계 직경인 3 mm로 확장합니다. 강력한 네오디뮴 자석을 사용하여 확장된 스텐트의 미세 균열 여부와 균일한 확장 상태를 검사합니다.스텐트의 직경이 자기장 라인과 평행하도록 평평한 면 중 하나에 스텐트를 고정하여 직경 방향으로 자화시킵니다. 또는, 스텐트의 축이 자기장 라인과 평행하도록 원통형 표면 옆에 스텐트를 고정하여 축 방향으로 자화시킬 수 있습니다. 스텐트를 강한 자석 가까이에 약 1분 동안 유지합니다.자성화를 위해 스텐트를 유리 맨드릴에 각각 장착한 다음, 유리 맨드릴을 자기 프로빙 고정 장치의 정밀 척에 장착합니다. 자기 프로빙 고정 장치의 X, Y, Z 스테이지를 사용하여 자기 마이크로센서 프로브가 표면에 닿지 않도록 스텐트 가까이에 정밀하게 위치시킵니다. 스텐트에서 멀리 떨어진 곳에서 자기 마이크로센서의 기저선 값을 측정하고, x, y, Z 스테이지를 사용하여 프로브를 이동시켜 스텐트 표면의 잔류 자기장을 측정합니다.텍스트 프로토콜 배양법에 기술된 대로 돼지 말초혈액에서 내피 성장 세포(endothelial outgrowth cells, EOCs)를 유도한 후, T 75 플라스크에서 세포가 약 80% 밀도로 증식할 때까지 배양합니다. 초자성 산화철 나노입자(super paramagnetic iron oxide nanoparticles, pyon)를 합성한 후, 세포 배양 배지에 200 µg/mL 농도로 pyon을 EOCs에 첨가합니다. 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다.세포 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 플라스크에 10 milliliters의 PBS를 첨가합니다. 그 다음 가볍게 흔들어준 후 흡입하여 제거합니다. 제조사의 지침에 따라 세포를 염색하기 위해 10 milliliters의 배양액에 CM DAI와 같은 형광 염료 5 micrograms per milliliter를 첨가하고 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다.이전과 같이 PBS를 사용하여 세포를 부드럽게 세척한 다음, 0.25% trypsin EDTA 용액을 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 플라스크에서 세포를 떼어냅니다. 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. PBS를 채워 부피를 맞춘 후, 500 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 세포 펠릿을 형성합니다.PBS를 사용하여 세포를 mL당 100만에서 200만 개의 농도로 재현탁합니다. 인 비트로(in vitro) 세포 연구를 위해 유리 커버슬립 표면 바로 위에 스텐트를 고정할 수 있는 간단한 고정 장치를 설계하고 제작합니다. 전자기 탈자기를 사용하여 스텐트를 탈자하거나, 강력한 네오디뮴 자석을 사용하여 스텐트를 직경 방향 또는 축 방향으로 자화시킵니다. PBS에 현탁된 spy-on labeled e ooc를 축 방향으로 자화되었거나 직경 방향으로 자화되었거나 또는 자화되지 않은 대조군 스텐트가 들어 있는 디쉬에 피펫으로 분주합니다.그 다음, 도립 형광 현미경 이미지와 함께, 텍스트 프로토콜에 따라 네 마리의 건강한 요크셔 돼지에게 항혈소판제를 투여하고 마취시킨 후 스텐트 식립을 수행하기 위해 PBS에 현탁된 EOC가 포함된 스텐트를 준비합니다. 표준 심장 카테터 삽입 기술을 사용하여 우관상동맥(RCA)에 자화된 스텐트 하나와 비자화된 스텐트 하나를 식립합니다. 가이드와이어를 사용하여 오버-더-와이어 벌룬으로 벌룬과 스텐트를 전진시킨 후, 식립된 스텐트 근위부의 RCA 내 혈류를 차단합니다. 그런 다음 2분 동안, s scions로 표지되어 4 mL의 PBS에 현탁된 약 200만 개의 자가 EOC를 중앙 카테터를 통해 주입합니다. 추가로 2분간 차단한 후, RCA의 혈류를 복원하고 스텐트를 회수하여 조직학적 분석을 수행합니다. 여기에서 보여주는 텍스트 프로토콜에 따르면, FEA 기반의 반복적인 스텐트 설계 결과, 극한 변형률인 30%보다 낮은 20%의 주 변형률로 압착 및 확장이 가능한 스텐트가 도출되었습니다.트라이플 풍선 카테터에 압착된 후 트라이플 풍선을 사용하여 3mm로 확장된 레이저 절삭 및 전해 연마 스텐트에서 파손 징후는 나타나지 않았습니다. 변형된 스텐트의 사진은 FEA로 계산된 변형과 잘 일치하였으며, 현미경 사진에서도 잔류 자기장 측정 결과에서 예상한 바와 같이 파손이 관찰되지 않았습니다. 표지된 세포에 대한 SPY는 축 방향으로 자화된 스텐트의 벤드(Ben) 세그먼트에 우선적으로 끌렸으며, 직선 세그먼트에는 더 균일하게 끌렸습니다.직경 방향으로 자화된 스텐트의 조직학적 이미지에서 스텐트 지주 근처의 철 염색이 확인되었으며, 이는 7일간의 이식 기간 동안 EOC가 스텐트로 끌려와 유지되었음을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때는 부적절한 입력 매개변수를 사용했을 때의 FEA 및 CAD 개념을 이해하는 것이 중요합니다. 입력 매개변수가 부적절할 경우, 스텐트가 너무 뻣뻣하거나 파손될 가능성이 높은 잘못된 스텐트 설계 결과가 나올 수 있습니다.본 절차를 수행한 후, 스텐트의 장기 내구성과 생체 적합성은 어떠한가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 가속 피로 시험 및 독성 시험과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 수년간의 개발 끝에, 우리는 이제 돼지 모델에서 검증된 기능적 기술을 보유하게 되었습니다.이 영상을 시청하고 나면 강자성 스텐트를 개발하고, 자기 표지 및 동맥 세포의 포획과 유지 능력을 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

혈액 - 문의 autologous 세포 및 시험 biocompatibility과 biomaterials 것은 시딩의 티타늄에 대한 방법을 설명합니다. 이 방법은 돼지의 venae cavae에 주입 수술의 분 이내에 씨앗 내피 전구 세포와 티타늄 튜브를 사용합니다. 이 기술은 다른 많은 implantable 생명 의학 장치에 적용할 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

마우스 경동맥 동맥 스텐트 시술의 모델이 설명되어 있습니다. 다른 유사한 방법에 비해,이 절차를 편리하게 다른 약물 용출 스텐트 재 협착의 분자 메커니즘 혈관 벽의 반응에서 공부 할 수있는 가능성을 제공, 매우 빠른, 간단하고 액세스 할 수 있습니다.

재 협착의 연구에 대한 경동맥 스텐트 시술의 쥐과 모형

이 연구는 스텐트의 코팅이 없는 금속 표면에 아데노바이러스 유전자 벡터의 가역적 부착을 보고하고 메쉬 디스크를 모델링합니다. 벡터 고정화에 사용되는 cross-linker의 가수분해에 따라 transduction-competent 바이러스 입자가 지속적으로 방출되면 혈관 세포와 스텐트 동맥에서 내구성 있는 부위 특이적 transgene 발현이 발생합니다.

가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐​​트 표면에서 혈관 유전자 전송

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다.  이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

프로토콜에서는 두 개의 전기방사 나노섬유질 폴리우레탄 층 사이에 풍선 확장 스텐트를 끼워 소구경 스텐트 이식편을 제조하는 방법을 제시합니다.

전기 방사 및 풍선 확장 베어 메탈 스텐트를 사용하여 작은 구경 스텐트 - 이식의 제작

코발트 도핑된 마그네토페리틴의 합성 및 양이온화를 위한 프로토콜과 양이온화된 마그네토페리틴으로 줄기세포를 빠르게 자화하는 방법을 제시합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.

자성 나노 물질의 생체 기능화

여기에 제시된 펩티드 CD47(pepCD47)을 다비스포산 화학을 이용한 금속 스텐트에 대한 프로토콜이 제시된다. pepCD47을 사용하여 금속 스텐트의 기능화는 염증 세포의 부착 및 활성화를 방지하므로 생체 적합성을 향상시키게 합니다.

CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

학습하세요 강자성 베어 메탈 스텐트를 이용한 내피 세포 캡처 및 유지 방법을. CAD와 FEA를 활용한 설계와 돼지 실험을 통해 검증된 이 기술은 심혈관 기기의 치유와 혈액 적합성 향상에 기여합니다.

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

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