내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

본 실험의 전반적인 목표는 자기 나노입자가 표지된 혈관 내피세포를 포착하고 유지할 수 있는 강자성 무코팅 금속 스텐트를 개발하는 것입니다. 이를 위해 컴퓨터 보조 설계(CAD) 및 유한 요소 분석(FEA) 소프트웨어를 사용하여 2205 스테인리스강 스텐트를 설계함으로써, 압착 및 확장 과정 중 스텐트 재료와 구조의 기계적 거동을 정확하게 파악합니다. 이후, 제작된 스텐트를 기계적으로 압착 및 확장하여 기계적 무결성을 입증하고, 스텐트의 자기장 유지력을 연구하여 자기적 거동을 검증합니다.

그런 다음 스텐트를 돼지에 삽입하고 자성 나노입자로 표지된 혈관 내피세포를 전달하여 관상동맥 순환 내에서의 세포 포획 및 유지 여부를 검증합니다. 결과적으로, 생체 내 실험에서 적출한 혈관의 조직학적 분석을 통해 본 연구에서 개발한 강자성 스텐트가 자성 표지된 혈관 내피세포를 포획하고 유지할 수 있음을 확인하였습니다. 신속한 내피화는 치유를 촉진하고 혈액 적합성을 향상시킬 수 있으므로, 이 기술의 함의는 다양한 심혈관 장치 개발로 확장될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법이 생소한 연구자들은 스텐트 설계에 포함된 CAD 및 FEA 절차의 복잡성으로 인해 어려움을 겪으며, 세포 배양 또한 초보자에게는 도전적인 과제가 될 수 있습니다. 엄격한 무균 환경 유지의 중요성 때문에, 저희는 스텐트의 치유 능력을 향상시키고자 했으며 이에 생체 세포를 스텐트에 부착시키기 위해 자기력을 이용하는 아이디어를 고안하였습니다. 크림핑(crimping) 및 확장 과정 중 발생하는 재료 거동의 복잡성과 스텐트의 자기적 세포 포집 방식의 신규성으로 인해 스텐트 개발 및 세포 부착 단계는 학습하기 까다로우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

먼저, CAD 소프트웨어를 사용하여 벽 두께를 스텐트 스트럿 두께와 동일하게 설정한 돌출 보스/베이스 기능을 선택함으로써 돌출된 중공 실린더를 제작하십시오. 돌출된 실린더에 접하는 별도의 스케치 평면에 스텐트 패턴을 설계하십시오. 평면 패턴의 너비를 돌출된 중공 실린더의 둘레와 일치하도록 설정하십시오.

Wrap 기능을 사용하여 평면 패턴 설계를 중공 실린더로 전사합니다. 해당 파트를 기본 포맷과 FEA 수출용 ACEs 포맷으로 각각 저장합니다. 유한 요소 분석을 수행하려면, ACEs 포맷으로 저장된 솔리드 기하학 구조를 FEA 소프트웨어의 파트 모듈로 가져와 소프트웨어의 파트 모델러에서 추가 분석을 진행합니다. 스텐트에 동심이 되도록 두 개의 분석용 실린더를 모델링합니다. 어셈블리 모델러의 인스턴스 트리 항목을 더블 클릭하여 FEA 소프트웨어의 메쉬 모듈을 통해 파트들을 상대적 위치에 맞춰 조립합니다.

요소를 20노드 6면체 감소 적분 요소(20 node hexed element with reduced integration)로 지정하십시오. 모델 트리의 상호작용 속성 내에서 요소 크기를 지정하고 스텐트를 메싱하십시오. 스텐트와 두 실린더 사이에 각각 마찰이 없는 강체 접촉 쌍(frictionless rigid contact pairs)을 지정하십시오.

2205 스테인리스강의 ELA 응력-변형률 거동을 스텐트 모델에 할당합니다. 우선 외부 실린더를 1mm까지 압착하여 크림핑 과정을 모사하도록 경계 조건을 정의합니다. 이후 외부 실린더를 제거하여 크림핑된 스텐트의 이완을 모사합니다.

팽창을 모사하기 위해 내부 실린더를 3mm까지 확장하고, 마지막으로 내부 실린더를 제거하여 스텐트의 반동을 모사합니다. 시뮬레이션이 완료되면 결과 파일을 열고 결과를 후처리하여 주 변형률(principle strains)을 분석합니다. 재료의 파괴 한계보다 낮은 20%의 주 변형률을 달성할 수 있도록 스텐트 설계를 반복적으로 개선합니다.

퓸 후드 내에서 적절한 보호 장구를 착용한 상태로 2205 스테인리스강 튜브를 확보하고 텍스트 프로토콜에 따라 스텐트를 절단한 후, 전해 연마된 스텐트의 표면을 부동태화하기 위해 50% hydrochloric acid에 10분간 침지하고, 이어서 10% sodium bicarbonate에 다시 10분간 침지하여 산세척(acid pickling)을 완료합니다. 에탄올과 탈이온수로 스텐트를 세척합니다. 그 후, 스텐트의 크림핑(crimping) 테스트를 위해 스텐트와 3단 접이식 풍선을 잡습니다.

핸드헬드 크림핑 툴의 핸들을 눌러 벌룬 위에 크림핑할 스텐트를 변형시킵니다. 현미경으로 크림핑된 스텐트를 관찰하여 크림핑이 균일한지 및 결함 징후가 없는지 확인한 후, 물을 사용하여 3중 접힘 벌룬(trifold balloon)에 압력을 가해 스텐트를 설계 직경인 3 mm로 확장합니다. 강력한 네오디뮴 자석을 사용하여 확장된 스텐트의 미세 균열 여부와 균일한 확장 상태를 검사합니다.

스텐트의 직경이 자기장 라인과 평행하도록 평평한 면 중 하나에 스텐트를 고정하여 직경 방향으로 자화시킵니다. 또는, 스텐트의 축이 자기장 라인과 평행하도록 원통형 표면 옆에 스텐트를 고정하여 축 방향으로 자화시킬 수 있습니다. 스텐트를 강한 자석 가까이에 약 1분 동안 유지합니다.

자성화를 위해 스텐트를 유리 맨드릴에 각각 장착한 다음, 유리 맨드릴을 자기 프로빙 고정 장치의 정밀 척에 장착합니다. 자기 프로빙 고정 장치의 X, Y, Z 스테이지를 사용하여 자기 마이크로센서 프로브가 표면에 닿지 않도록 스텐트 가까이에 정밀하게 위치시킵니다. 스텐트에서 멀리 떨어진 곳에서 자기 마이크로센서의 기저선 값을 측정하고, x, y, Z 스테이지를 사용하여 프로브를 이동시켜 스텐트 표면의 잔류 자기장을 측정합니다.

텍스트 프로토콜 배양법에 기술된 대로 돼지 말초혈액에서 내피 성장 세포(endothelial outgrowth cells, EOCs)를 유도한 후, T 75 플라스크에서 세포가 약 80% 밀도로 증식할 때까지 배양합니다. 초자성 산화철 나노입자(super paramagnetic iron oxide nanoparticles, pyon)를 합성한 후, 세포 배양 배지에 200 µg/mL 농도로 pyon을 EOCs에 첨가합니다. 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다.

세포 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 플라스크에 10 milliliters의 PBS를 첨가합니다. 그 다음 가볍게 흔들어준 후 흡입하여 제거합니다. 제조사의 지침에 따라 세포를 염색하기 위해 10 milliliters의 배양액에 CM DAI와 같은 형광 염료 5 micrograms per milliliter를 첨가하고 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다.

이전과 같이 PBS를 사용하여 세포를 부드럽게 세척한 다음, 0.25% trypsin EDTA 용액을 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 플라스크에서 세포를 떼어냅니다. 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. PBS를 채워 부피를 맞춘 후, 500 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 세포 펠릿을 형성합니다.

PBS를 사용하여 세포를 mL당 100만에서 200만 개의 농도로 재현탁합니다. 인 비트로(in vitro) 세포 연구를 위해 유리 커버슬립 표면 바로 위에 스텐트를 고정할 수 있는 간단한 고정 장치를 설계하고 제작합니다. 전자기 탈자기를 사용하여 스텐트를 탈자하거나, 강력한 네오디뮴 자석을 사용하여 스텐트를 직경 방향 또는 축 방향으로 자화시킵니다. PBS에 현탁된 spy-on labeled e ooc를 축 방향으로 자화되었거나 직경 방향으로 자화되었거나 또는 자화되지 않은 대조군 스텐트가 들어 있는 디쉬에 피펫으로 분주합니다.

그 다음, 도립 형광 현미경 이미지와 함께, 텍스트 프로토콜에 따라 네 마리의 건강한 요크셔 돼지에게 항혈소판제를 투여하고 마취시킨 후 스텐트 식립을 수행하기 위해 PBS에 현탁된 EOC가 포함된 스텐트를 준비합니다. 표준 심장 카테터 삽입 기술을 사용하여 우관상동맥(RCA)에 자화된 스텐트 하나와 비자화된 스텐트 하나를 식립합니다. 가이드와이어를 사용하여 오버-더-와이어 벌룬으로 벌룬과 스텐트를 전진시킨 후, 식립된 스텐트 근위부의 RCA 내 혈류를 차단합니다. 그런 다음 2분 동안, s scions로 표지되어 4 mL의 PBS에 현탁된 약 200만 개의 자가 EOC를 중앙 카테터를 통해 주입합니다. 추가로 2분간 차단한 후, RCA의 혈류를 복원하고 스텐트를 회수하여 조직학적 분석을 수행합니다. 여기에서 보여주는 텍스트 프로토콜에 따르면, FEA 기반의 반복적인 스텐트 설계 결과, 극한 변형률인 30%보다 낮은 20%의 주 변형률로 압착 및 확장이 가능한 스텐트가 도출되었습니다.

트라이플 풍선 카테터에 압착된 후 트라이플 풍선을 사용하여 3mm로 확장된 레이저 절삭 및 전해 연마 스텐트에서 파손 징후는 나타나지 않았습니다. 변형된 스텐트의 사진은 FEA로 계산된 변형과 잘 일치하였으며, 현미경 사진에서도 잔류 자기장 측정 결과에서 예상한 바와 같이 파손이 관찰되지 않았습니다. 표지된 세포에 대한 SPY는 축 방향으로 자화된 스텐트의 벤드(Ben) 세그먼트에 우선적으로 끌렸으며, 직선 세그먼트에는 더 균일하게 끌렸습니다.

직경 방향으로 자화된 스텐트의 조직학적 이미지에서 스텐트 지주 근처의 철 염색이 확인되었으며, 이는 7일간의 이식 기간 동안 EOC가 스텐트로 끌려와 유지되었음을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때는 부적절한 입력 매개변수를 사용했을 때의 FEA 및 CAD 개념을 이해하는 것이 중요합니다. 입력 매개변수가 부적절할 경우, 스텐트가 너무 뻣뻣하거나 파손될 가능성이 높은 잘못된 스텐트 설계 결과가 나올 수 있습니다.

본 절차를 수행한 후, 스텐트의 장기 내구성과 생체 적합성은 어떠한가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 가속 피로 시험 및 독성 시험과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 수년간의 개발 끝에, 우리는 이제 돼지 모델에서 검증된 기능적 기술을 보유하게 되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 강자성 스텐트를 개발하고, 자기 표지 및 동맥 세포의 포획과 유지 능력을 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.