Name: 분석 예 르시 니아의 enterocolitica 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 배우세요 Yersinia enterocolitica의 이펙터 단백질 전좌 측정 방법을 베타-락타마제 융합 분석과 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여. 이 기술은 세균 병원성 메커니즘 연구에 민감하고 특이적인 도구를 제공합니다.

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FRET 획득 정량화 알고리즘을 제공해 주신 Antonio Virgilio Failla박사님과 pMK-bla 및 pMK-ova 구조를 제공해 주신 Erwin Bohn님께 감사드립니다.

1. 피크 방출 및 크로스 토크 결정 (또한 그림 2 참조) <ol><li> , 발광 피크와 도너 사이의 크로스 토크 (쿠마린 유도체의 V450) 및 억 셉터 (형광) 염료의 양을 결정 405㎚, 여기에서 개별 형광 표지 된 세포 모두의 스펙트럼 스캔을 수행하기 위해. </li><li> 기증자 및 수용체 채널 (여기 455-465 nm의 525-535 ㎚)에 사용되는 각 염료의 피크 내에서 10 nm의 대역폭을 결정합니다. 파장 통해 규격화 강도를 플롯 및 수용체 채널 반대 (도 2)에 도너 염료의 크로스 토크 (cross-talk)의 평균 백분율을 계산한다. </li></ol> (Y) 2. 준비 세포 배양 감염 enterocolitica 균주 <ol><li> 다음 균주를 사용 WA-314 PMK-난자가와 (WA-314 17 PMK-즐와 PMK-OVA (17), 각각 플라스미드로 형질 전환) WA-314ΔYopE PMK-즐 (가 물에) 17 314ΔYopE는 플라스미드로 형질 전환 된 PMK-즐 </li><li> 감염 행진 Y. 전에 ​​적어도 이일 enterocolitica 균주 WA-314 PMK-OVA, WA-314 PMK-즐와 WA-314ΔE WA-314 PMK-즐 및 WA-314 PMK-난자에 대한 (카나마이신 필요한 항생제를 포함하는 LB 한천 플레이트에 주식을 알아내는로부터 PMK는-BLA , 카나마이신 및 WA-314ΔE PMK-즐위한 테트라 사이클린), 27 ℃에서 O / N 성장. 이후 일주까지 4 ℃에서 대한 번호판을 유지. </li><li> 감염 전 어느 날 각각의 균주 중 하나를 식민지로 필요한 항생제를 포함하는 LB-매체의 3 ㎖를 접종하고 180 rpm으로 진탕 기에서 27 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 감염 일에 항생제없이 신선한 LB-배지 40 ㎖ 중에 O / N 배양 2 ㎖를 접종 및 유형 III 분비 시스템의 발현을 유도하기 위해 180 rpm의 진탕 기에서 37 ℃에서 90 분 동안 배양한다. </li><li> 적절한 튜브에 문화를 전송하고 C 얼음 또는 4 °에서 문화를 유지지금부터. 5,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 문화를 원심 분리기. </li><li> 얼음의 2-3 ml의 차가운 PBS의 세균 펠렛을 재현 탁. 분광 광도계를 사용하여 8 × 108 CFU / ml의 농도에 세균 현탁액을 희석. 개별적으로 대응하는 광학 밀도를 결정한다. 헬라 세포를 감염 때까지 얼음이 현탁액을 유지합니다. </li></ol> 3. 도금 HeLa 세포 <ol><li> 96 웰 플레이트의 웰에 10 % 열 비활성화 우태 혈청 (FCS)을 함유하고, 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양을 200㎕ DMEM에 하루 감염 종자 전에 1.5 × 104 세포 HeLa 세포. 각 변형 (세 가지 다른 배양 시간) 세 우물을 시드. </li></ol> 4. 헬라 세포의 감염 및 CCF4에 넣기 <ol><li> 배지에 세균 현탁액의 3.5 μl를 첨가하여 HeLa 세포를 감염 부드럽게 매체 회 피펫 팅하여 혼합한다. 박테리아가 침전 허용세포 당 약 100 박테리아의 MOI (감염의 부위)에 세포. 시간 코스 -90 분, -60 분, -30 분에서 감염을 시작하고 공통 종료점을 달성하기 위해 0 분까지 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 배양이 완료되면, 신중 HeLa 세포를 제거하지 않고 매체 대기음 CCF4 수출 감소 이펙터 2.5 밀리미터 베네 시드의 발현을 20 μg의 정지 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 PBS의 50 μL를 추가한다. </li><li> 이 시점에서 현미경 단계로 96 웰 플레이트를 전송하고 잘 각각 나중에 분석을 위해 적합한 장소를 정의합니다. 10 분 이내에이 단계를 완료 (취득 자세한 내용은 5.1 절 참조). </li><li> 당이 아니라, 20을 포함 CCF4 / AM 로딩 용액 (0.24 ㎕의 용액 1.2 μL 용액 B 70 μL, 18.56 μL 용액 C (용액 A, B 및 C는 CCF4 / AM 로딩 키트 내에 제공) 50 μL PBS를 (ADD 다중 페이지를 사용하여 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 2.5 MM의 프로 베네 시드)ipette 실온에서 5 분 동안 품어합니다. 지금 일에 중단없이부터. </li><li> 로딩 솔루션을 기음과 멀티 피펫을 사용하여 20 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 2.5 MM의 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 100 μL를 추가합니다. 그리고 빠르게 현미경 단계로 96 웰 플레이트를 전송 및 로딩 솔루션의 열망에서 10 분 이내에 수집을 시작합니다. </li></ol> 5. 레이저 스캐닝 현미경 및 데이터 분석 <ol><li> 이미지 획득 <ol><li> 광독성, photobleaching에 크로스 여진을 전체 광자 수를 최대화하고 최소화하기위한 방법으로 촬상 조건을 설정한다. <ol><li> 현대 공 초점 레이저 주사 현미경에서 동시에 활성화 기증자 및 수용체 채널, 8 비트 깊이와 높은 감도 하나로 이루어질 수 탐지기를 선택, 2.5 에어리 단위 (즉, 넓은 광학 절편)에 검출기 핀홀을 열고, 20 배 높은 개구 침지 목표를 사용 ~ 750 나노 미터 픽셀 크기, 3 배의 프레임 평균과 excit405 nm의 레이저 다이오드의 10 % E. </li><li> 정확한 정량화는 동일한 값으로 두 채널의 검출기 이득 설정을 보장하고, 모든 픽셀의 포화를 방지하기 위해. 참고 : 여기에, 이익은 150 %로 설정했다. </li></ol></li><li> 1 mL의 시린지로, 예를 들어, 웰의 바닥에 침적 매개물을 확산하여 담궜을 보장하고, 기포의 포착을 방지. </li><li> 투과광을 활성화하고 모든 웰에보기의 대표 필드를 찾을 수 있습니다. 제대로 보정 자동 단계를 사용하여 소프트웨어의 위치를​​ 표시합니다. </li><li> 염색에 대한 판의 제거 후, ​​(4.3 절 참조) 판을 다시 삽입 초점 드리프트를 방지하기 위해 상단에 무게를 추가 할 수 있습니다. 레이저 스캐닝 모드와 저장 위치를​​ 검토하고 적절하게 초점과 수평 위치를 조정합니다. </li><li> 2 시간에 2 분에 시간을 시간 경과를 설정하고 획득을 시작합니다. </li></ol></li><li> 이미지 정량 (예를 들면 비트 평면 소프트웨어에 대해 설명한다) 같은 Imaris과 같습니다 <ol><li> 픽셀 매트릭스의 산술 계산을 수있는 소프트웨어로 데이터 세트를 가져옵니다. 드래그 기증자 및 소프트웨어 아이콘 수용체 채널 모두를 포함하는 소스 파일을 드롭하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 같은 오프셋을 사용하여 두 채널에서 배경을 뺍니다. 이렇게하려면 메뉴를 클릭 한 다음 이미지를 클릭&gt; 가공&gt; 기준 빼기. 각 채널을 선택하고 기본 값을 입력합니다. </li><li> 새로운 채널을 생성, 사전 결정된 보정 계수 F (1.1 참조) 셉터 채널 (CH2) 내로 도너 채널 (채널 1)의 블리드 - 스루를 정정 : 채널 2 &#39;= 채널 2 - 채널 1 * F 참고 : 기증자 채널에 수용체의 블리드를 통해 소음의 수준 이상 검출되지 않았습니다. <ol><li> 메뉴&gt; 영상 처리&gt; 채널를 arithmetics을 클릭하고 입력 복근 (CH2- (CH1 * 0.33)). 그 후 메뉴&gt; 편집&gt; 채널 삭제를 클릭하여 채널 2를 삭제합니다. 있는지 확인블리드를 통해 수정 수용체​​ 채널로 남아있는 새로운 채널 2. 선택 : 메뉴&gt; 편집&gt; 이미지 속성으로 이동하여 원래 색상에 회색의 채널 색상을 변경합니다. 채널 4&gt; 매핑 된 색상&gt; 기본 색상을 선택하고 녹색, 예를 들면로 변경. </li></ol></li><li> 상대 FRET 계수를 결정하기 위해 다음 조작으로 새 채널을 만듭니다 CH3 = 채널 2 &#39;/ (채널 1 + 채널 2&#39;) <ol><li> 메뉴&gt; 영상 처리&gt; 채널를 arithmetics로 이동 ./ (CH1 + CH2)을 CH2를 입력 </li></ol></li><li> 8 비트 이미지 FRET 채널의 적절한 시각화, 네 번째 채널을 생성 : 4 장 = 255 * CH3 <ol><li> 메뉴&gt; 영상 처리&gt; 채널를 arithmetics로 이동 255 *의 CH3를 입력합니다. 메뉴&gt; 편집&gt; 이미지 속성으로 이동하여 채널의 색상을 변경합니다. 채널 4&gt; 매핑 된 색상&gt; 색상 표 파일&gt; 제트을 선택합니다. </li></ol></li><li> 채널 CH3 및 메탄 그쪽에 3 × 3 중간 필터를 적용T는 이미지의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 이렇게하려면 메뉴&gt; 이미지 처리&gt; 스무딩&gt; 중간 필터를 클릭합니다. 두 채널을 선택하고 필터 크기 &quot;3x3x1&quot;을 적용한다. </li><li> 세포 신호 정량, 제대로 오프셋 설정하여 4 장에서 세포를 감지하고 너무 작은 구조를 제외 크기 구조를 필터링 할 수 있습니다. <ol><li> 선택보기를 능가하고 아이콘 &quot;새로운 표면 추가&quot;를 클릭합니다. 표면 창 검출 알고리즘 파라미터를 정의한다. 빠른 처리를 들어, 두 개의 체크 박스 &quot;세그먼트 관심의 영역&quot;과 &quot;마지막으로 프로세스 전체 이미지&quot;를 활성화합니다. 그 치수를 편집하여 관심 영역을 정의합니다. </li><li> 소스 채널로 채널 4를 선택하고 임계 화&gt; 배경 빼기 (로컬 대비)에 의해 임계 값을 설정하고 10 μm의 직경을 설정합니다. 최대 intensi 수동으로 0으로 최소 강도 임계 값과 최대 임계 값을 설정타이. 면적으로 구조를 필터와 예를 들어, 187 μm²에 최소 값을 설정합니다. 표면 감지를 마칩니다. </li></ol></li><li> 기증자 형광 강도 (채널 1) 및 상대 FRET 계수 (CH3) 셀룰러 기업에서의 표준 편차에 대한 평균 값을 추출합니다. 이렇게하려면 표면 특성으로 이동합니다. 표면 스타일 / 품질&gt; 표면을 선택하여 구조의 모양을 변경합니다. 필터 탭을 클릭하여 모든 구조를 선택합니다. 선택&gt; 통일을 처리하기 위해 이동하여 검출 된 구조를 통일한다. 통계 탭을 클릭하여 MS Excel로 표면 통계를 내보내기&gt; 내보내기 모든 통계는 파일입니다. </li><li> 시간이 지남에 따라이 값을 플롯. 전좌 이펙터의 양을 나타내는 적절한 매개 변수로 각 조건에 대한 기증자 채널 형광 증가의 최대 기울기의 10 분의 간격을 확인합니다. M = Δ 기증자 형광 강도 / Δ 시간 (분)으로 기울기를 계산합니다. </li></ol></lI&gt; </ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 여기에 성공적으로 Y로 이펙터 전위의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제 기자 기반 분석을 적용 enterocolitica. 이 민감한 특정하고 비교적 간단한 기술의 많은 다른 변형이 문헌에 기재되어있다. 본 연구에서는 레이저 주사 현미경은 형광 신호의 가장 민감하고 정확한 검출을 수행 하였다. 특히 도너와 억 셉터 염료 및 개별적 조절 검출 대역폭 사이의 크로스 토크에 대한 보정 방법의 다른 변형에 비해 우수한 측정 정확도를 위해 허용한다. 결과는 분명히 방법은 정량적으로 전좌를 분석 할 수 있음을 보여준다. 세포 내 베타 - 락타 마제의 상이한 농도를 나타내는 다른 배양 시간은 긍정적 도너 형광 세기의 기울기와 상관 관계가 있었다. 또한 WA-314ΔYopE의 상당히 높은 전위 속도 비교야생형 균주 WA-314 입증 될 수있다. 데이터 분석을위한 두 가지 대안이 적용되었다 : 기증자 채널 강도와​​ 상대 무서워 계수를. 도...

타입 III 분비 시스템은 직접 진핵 표적 세포 내로 세균 부호화 이펙터 단백질을 제공하는 그람 음성 박테리아에 의해 이용되는 다른 장군 특수한 단백질 수출 기계이다. 분비 기계 자체가 고도로 보존되는 동안 효과기 단백질의 특별한 세트는 셀룰러 신호 경로를 조작하고 특정 박테리아 병원성 1 전략을 용이하게하기 위해 다양한 세균 종에 진화 해왔다. 르시 니아 경우, 일곱 이펙터 단백질, 소위 Yops (르시 니아 외 단백질)까지, 숙주 세포 접촉에 전좌 및 즉 식세포 및 사이토 카인 생산과 같은 면역 세포 반응을 파괴하기 위해 함께 작동되어, 세균의 세포 생존을 허용 2-4. 전위의 프로세스 밀접 다른 단계 5에서 제어된다. 그것은 T3SS의 기본 활성화가 목표 CE에의 접촉에 의해 유발되는 것을 설립LL 6. 그러나,이 개시의 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지된다. 예 르시 니아에서 전위의 소위 미세 조정의 두 번째 수준은 상향 또는 하향 조절 세포의 Rho GTP 결합 단백질 RAC1 또는에서 RhoA의 활성을 얻을 수있다. invasin 또는 세포 독성 괴사 인자 Y (CNF-Y)에 의해 예를 들면 RAC1의 활성화는 차이가 전좌 YopE의 기능을 (는 GTPase 단백질을 활성화) 동안 RAC1 활동을 하향 조절하고 그에 따라 음의 피드백 유형에 따라 전위를 감소, 증가 전위 7-9 리드 기구 10, 11의. 유효하고 정확한 방법 르시 니아 전좌가 숙주 세포의 상호 작용 동안에 어떻게 조절되는지를 조사하기위한 전제 조건이다. 다양한 시스템들은 특정한 장점과 단점이 각각, 이러한 목적을 위해 사용되어왔다. 일부 방법은 웨스턴 블롯 분석 한 다음 다른 세제에 의해 감염된 세포의 용해가 아닌 박테리아에 의존하고있다. 목이러한 방법의 전자 일반적인 단점은 사소한하지만 피할 수없는 박테리아 용해 잠재적 박테리아 관련 이펙터 단백질과 세포 용 해물을 오염이다. 그러나, 세포 외 이펙터 단백질과 진핵 세포의 선택적 용해에 대한 디기 토닌의 후속 사용을 분해하는 단백질 분해 효소의 K와 세포의 치료는이 문제 (12)을 최소화하기 위해 제안되었다. 중요한 것은, 이러한 분석은 결정적으로 대부분 상업적으로 사용할 수없는 높은 품질의 안티 이펙터 항체에 따라 달라집니다. 시도 형광 단백질의 구형 차 구조 및 분비 13 전에 펼치는 분비 장치의 무능력으로 인해 아마 성공하지 않았다 전좌를 모니터링 GFP 같은 효과기 단백질의 번역 융합체 및 형광 단백질을 사용한다. (14) 또는 플래시 cyclolysin 보르 데 텔라 백일해 독소 그러나 CYA 등 여러 가지 리포터 태그 (칼 모듈 린 - 의존적 아데 닐 레이트 사이 클라) 도메인태그가 성공적으로 전좌를 분석하는데 사용 하였다. 플래시 태그, 매우 짧은 tetracysteine​​ (4Cys) 모티브 태그, 분비 과정을 방해하지 않고 biarsenical 염료 플래시와 라벨을 허용하면서 전 분석에서 CYA의 효소 활성은 세포 융합 단백질의 신호를 증폭하는 데 사용 15. 여기인가 접근하여 CHARPENTIER 외. 처음보고되었고 전좌 이펙터 TEM-1 베타 - 락타 마제 융합체 (16) (도 1a)에 의해 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 염료 CCF4의 세포 변환에 기초한다. CCF4 / AM는 쿠마린 유도체 (도너) 및 형광 부분 (수용체)은 세 팔로 스포린 코어에 의해 연결되는 셀 투과 화합물이다. 진핵 세포로의 수동 입력에 따라, CCF4 / AM 에스테르 화합물은 비 형광 형광 충 CCF4 셀룰러 에스 테라 제에 의해 처리함으로써 갇혀세포 내에서. 530 nm에서 녹색 형광 신호를 방출 형광 잔기에 FRET에서 405 nm의 결과에서 쿠마린 잔기의 여기. 베타 - 락타 마제에 의해 FRET 스포린 코어의 분열 후 중단되고, 쿠마린 잔기의 여진은 at460 nm의 청색 형광 방출에 이르게. 이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 상기 방법은 시험관 내에서 전위의 분석을 가능하게하고 또한 생체 예에서, 기술은 생체 내에서 17-19 전좌 대상 백혈구 집단을 식별하는 마우스 감염 모델을 사용 하였다. 신호의 판독은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 이용하여 수행 될 수있다. 참고로,이 방법은 또한 감염 프로세스 (20, 21) 중 살아있는 세포 현미경으로 실시간 전좌를 모니터링 할 수있는 가능성을 제공한다. 여기 레이저 스캐닝 형광 현미경 readou 도포 했더니형광 신호 t 그것은 높은 감도와 정확성을 제공하기 때문에. 특히, 성능은 고감도의 검출기와 함께 나노 미터 정밀도로 발광 창 형광 검출을 최적화 및 크로스 토크를 최소화하는 것을 용이를 조정한다. 또한이 현미경 설치 전좌 실시간으로 모니터링하도록 구성 될 수 있고, 잠재적으로 세포 수준에서 호스트 병원체 상호 작용의 동시 분석을 허용한다. (Y)의 연구 전위 요금에 enterocolitica 야생형 균주와 hypertranslocator 표현형을 나타내는 10,11 YopE 결실 변이체는 예시 적으로 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>LB-한천</td><td></td><td>로스 X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-미디엄</td><td>로스</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트(검은색, 투명 바닥)</td><td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루베이트</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G 로딩 키트(CCF4-AM</td><td>Life Technologies 포함)</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lectin은 Triticum vulgaris (밀) FITC 접합체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td>에서 <td>사용됩니다. 피크 방출 및 크로스토크 결정에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>V450 Rat 안티-마우스 CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>피크 방출 및 크로스토크 결정에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Immersol W 이멀젼 오일&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>굴절률 = 1.3339 @ 23 &deg; C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x GaAsP-Hybrid 검출기, 4채널 분광계, acusto 광학 빔 스플리터, 전동 XY 스테이지, 조정 가능한 핀홀, 대물렌즈 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&#160; NM 다이오드 레이저 50&#160; mW</td></tr><tr><td>, Imaris 7.6 소프트웨어</td>, <td>Bitplane</td><td></td><td>플러그인 포함, ImarisXT 및 MeasurementPro</td></tr>, <tr><td>MatLab, 컴파일러 런타임</td>, <td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td>, <td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

병원성 르시 니아 종을 포함한 많은 그람 음성균이. 진핵 표적 세포에 효과기 단백질을 이동시키다하기에게 유형 III 분비 시스템을 사용한다. 숙주 세포 내부에 효과기 단백질은 박테리아의 수혜 세포 기능을 조작. 더 나은 전위를 측정하는 숙주 세포의 상호 작용, 민감하고 정확한 분석하는 동안 유형 III 분비의 조절을 이해하기 위해 필요합니다. 우리는 여기 르시 니아 enterocolitica 효과기 단백질 단편의 융합에 기초한 어 세이 (예 르시 니아 외 단백질; YopE)의 응용 기술한다. 전좌의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제와이 분석은 세포의 분열에 의존 투과 FRET 염료 전좌 베타 - 락타 마제 융합에 의해 (CCF4 / AM). 형광이 중단 및 쿠마린 부분의 여기 파란색 형광 방출로 연결되어있는 베타 - 락타 마제에 의해 CCF4의 세 팔로 스포린 코어의 절단 후, 쿠마린에서 FRET.이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 방법은 마우스 모델에서 생체 외 분석을위한 전위도 생체 예에서 허용한다. 형광 신호의 검출은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 다른 예 르시 니아 돌연변이가 HeLa 세포에 이펙터 융합체의 생체 전위에서, 여기에 설명 된 설정에서 레이저 스캐닝 현미경에 의해 모니터링된다. 실시간으로 베타 - 락타 마제 이펙터 융합하여 FRET 기자의 세포 내 변환을 기록하는 강력한 정량적 인 결과를 제공합니다. 우리는 여기서 Y로 증가 전위를 보여주는 대표적인 데이터를 표시 야생형 균주에 비해 enterocolitica YopE 변이체.

정량적 표적 세포 내로 이펙터 전위를 분석 한 방법의 성능을 입증하기 위해, 서로 다른 전위 속도론 두 르시 니아 균주가 연구되었다 : Y. 및 그 유도체 WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 숨겨 WA-314) (독성 플라스미드 pYVO8 (22)을 품고 혈청군 O8) enterocolitica 야생형 균주 WA-314. 이전 연구는 것을 보여 주었다 (Y) 기능 YopE 전시에게 상당히 높은 YOP 전위 율 (10)이 부족 enterocolitica 돌연변이. 두 균주 YopE 및 TEM-1 베타 - 락타 마제 (PMK-즐) (17)의 N 말단 분비 신호의 융합체를위한 벡터로 형질 전환 부호화 하였다. WA-314은 추가로 음성 대조군 역할을 각각 YopE의 난백 알부민 융합 (PMK-난자 17)에 대한 벡터 인코딩으로 변형되었다. 30...

III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

다음 실험의 전반적인 목표는 Yersinia 3형 분비 시스템을 통해 숙주 세포 내로 유입되는 이펙터 단백질의 전위(translocation)를 측정하는 것입니다. 이는 HeLa 세포를 이펙터 TEM-1 베타-락타마제 융합 단백질을 발현하는 Yersinia 변이균과 함께 배양하여, 이펙터 융합 단백질이 HeLa 세포 내로 전위되도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 감염된 HeLa 세포에 세포 투과성 FRET 리포터 화합물을 투입하며, 이 화합물은 세포 내 에스테라아제(esterase)에 의해 형광성 CCF4로 처리되어 세포 내에 포집됩니다.전위된 beta-lactamase에 의해 CCF4가 다시 절단되면 fre가 파괴되며, 이는 공여체와 수용체의 형광 강도를 분석하기 위해 레이저 주사 현미경으로 기록됩니다. 결과는 공여체 형광의 상승 속도에 따른 서로 다른 양의 전위된 effector TEM1 beta-lactamase 융합 단백질의 양을 보여줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점 중 하나는 CCF4 화합물의 세포 내 처리가 전위를 측정하기 위한 매우 특이적이고 민감한 도구를 제공한다는 점입니다.이 방법은 박테리아와 호스트 세포의 상호작용 과정에서 translocation이 어떻게 정교하게 조절되는지와 같이 박테리아 병원성 분야의 주요 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 감염 하루 전, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비한 Y enterocolitica 형질전환 균주 각각의 콜로니 하나를 3 mL의 LB 배지와 필요한 항생제가 포함된 세 개의 별도 바이알에 접종하십시오. 또한, 감염 하루 전 96-well 플레이트의 9 wells에 200 µL의 배양 배지로 15,000개의 세포를 파종하여 HeLa 세포가 포함된 플레이트를 준비하십시오. 감염 당일에 세포를 5% CO₂ 인큐베이터, 37 °C에서 배양하십시오.2 mL의 하룻밤 배양액을 항생제가 없는 40 mL의 신선한 lb 배지에 접종합니다. 37°C의 진탕 배양기에서 180 RPM으로 90분 동안 박테리아를 배양합니다. 이는 3형 분비 시스템의 발현을 유도하며, 90분 후 배양액을 새 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관합니다.이 시점부터, 박테리아를 펠릿화하기 위해 배양액을 5,000 G, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 펠릿을 2~3 mL의 차가운 PBS에 재현탁하여 박테리아 현탁액의 농도를 1 mL당 8억 CFU(colony forming units)로 희석한 후, 배양액을 얼음 위에 둡니다.그 다음 각 배양액의 해당 광학 밀도를 측정합니다. 각 균주로부터 얻은 박테리아 현탁액 3.5 µL를 준비된 96-웰 플레이트의 서로 다른 웰에 첨가하고, 배지를 두 번 가볍게 피펫팅하여 혼합한 후, 세포당 약 100마리의 박테리아가 감염될 수 있는 감염 다중도로 박테리아가 세포 위로 침강하도록 둡니다.30분 간격으로 감염을 시작하고, 5%CO2 챔버 내 37°C에서 세포를 유지하여 타임 코스를 수행합니다. 각 감염 후, 첫 번째 감염으로부터 90분이 지났을 때 hela 세포가 제거되지 않도록 주의하며 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 20 µg/mL chloramphenicol과 2.5 mM pronic이 포함된 PBS 50 µL를 첨가합니다.이렇게 하면 이펙터의 발현이 중단되고 CCF4의 수출이 감소합니다. 현미경 관찰을 준비하려면 1mL 시린지를 사용하여 침지 배지를 웰 바닥까지 도포함으로써 지속적인 침지 상태를 유지하십시오. 침지 배지에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오.그 다음 96-웰 플레이트를 현미경 스테이지로 옮기고, 각 웰에서 추후 분석에 적합한 지점을 찾습니다. 이 단계는 10분 이내에 완료하십시오. 그런 다음 각 웰에 70 µL의 CF 4:00 AM 로딩 용액을 첨가합니다.플레이트를 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 로딩 용액을 흡입하여 제거하고 20 µg/mL의 chloramphenicol과 2.5 mM의 pronic이 포함된 PBS 100 µL를 첨가합니다. 그 후 즉시 현미경 관찰을 시작합니다.20배 배율의 고개구수 침수 대물렌즈를 장착하고 검출기 핀홀을 2.5 airy unit으로 개방한 후, 9thought 96-well 플레이트를 공초점 레이저 주사 스테이지로 옮깁니다. 다음으로, 공여체 및 수용체 채널이 동시에 활성화된 고감도 갈륨 비소 인화물 검출기를 선택합니다. 8비트 비트 깊이의 3배 프레임 평균화를 설정하고 405 nm 다이오드 레이저의 10% 강도로 여기시킵니다.정확한 정량을 위해 두 채널의 검출기 게인(detector gain)을 동일한 값으로 설정하고 포화 픽셀이 발생하지 않도록 합니다. 다음으로 투과광을 활성화하여 모든 대표 시야를 다시 확인하고, 보정된 자동 스테이지를 사용하여 필요에 따라 위치를 적절히 조정한 후 다시 저장합니다. 마지막으로 타임랩스 간격을 2분, 총 지속 시간을 2시간으로 설정하고 이미지 획득을 시작합니다.이미지 획득 후, 픽셀 행렬의 산술 계산이 가능한 소프트웨어로 데이터 세트를 가져옵니다. 먼저 메뉴를 클릭한 다음, 이미지 프로세싱으로 이동하여 baseline subtraction을 선택하여 두 채널의 배경을 동일한 오프셋으로 제거합니다. 그런 다음 각 채널을 선택하고 베이스라인 값을 입력합니다.미리 결정된 보정 계수를 사용하여 공여 채널(채널 1)에서 수용 채널(채널 2)로 발생하는 bleed-through를 보정하며, 이를 위해 새로운 채널인 채널 2 프라임을 생성합니다. 메뉴를 클릭한 다음 이미지 프로세싱(image processing)을 선택하고 채널 산술 연산(channel Arithmetics)을 선택한 후, 채널 2의 절대 값에서 채널 1의 0.33배를 뺀 값을 입력합니다. 이후 채널 2를 삭제하여 bleed-through가 보정된 수용 채널이 새로운 채널 2로 남도록 합니다.그런 다음, 여기에 표시된 연산을 통해 상대적 프렛 계수(fret coefficient)를 결정하는 새로운 채널을 생성하십시오. 다음으로, 채널 산술 메뉴로 돌아가 프렛 채널을 적절하게 시각화하기 위해 채널 2를 채널 1 더하기 채널 2로 나눈 식을 입력하십시오. 8비트 이미지의 경우, 채널 3에 255를 곱한 값과 동일한 네 번째 채널인 채널 4를 생성하십시오.이미지 속성 메뉴로 이동하여 채널 색상을 변경하십시오. 채널 4를 선택한 다음, 매핑된 색상(mapped color), 이어서 색상 표 파일(color table file)을 선택하고 jet을 선택하십시오. 다음으로, 채널 3과 4에 3x3 중앙값 필터(median filter)를 적용하십시오. 이미지 처리 메뉴로 들어가 평활화(smoothing)를 선택하면 이미지의 노이즈를 줄일 수 있습니다.미디언 필터(median filter)를 적용한 후, 두 채널을 모두 선택하고 세포 신호 정량을 위해 3x3x1 크기의 필터를 적용합니다. 'Surpass View'를 선택하고 아이콘을 클릭하여 채널 4에서 세포를 검출합니다. 새로운 표면(surfaces)을 추가합니다.표면 창에서 검출 알고리즘 매개변수를 정의하고 두 개의 체크 박스를 활성화하십시오. 관심 영역만 세분화하고 전체 이미지를 처리하십시오. 마지막으로, 크기를 편집하여 관심 영역을 정의하십시오.채널 4를 소스 채널로 선택하고, 임계값 설정 메뉴에서 배경 제거(background subtraction)를 선택하여 임계값을 설정하십시오. 직경은 10 µm로 설정하고, 최소 강도 임계값은 수동으로 0으로, 최대 임계값은 최대 강도로 설정하십시오. 면적별로 구조물을 필터링하고 최소값을 187 µm²로 설정하십시오.그 다음 표면 검출을 완료합니다. 마지막으로, 세포 엔티티 내의 채널 1에서의 공여체 형광 강도 평균값과 채널 3에서의 상대적 FRET 계수 평균값 및 각각의 표준 편차를 추출합니다. 표적 세포로의 이펙터 전위를 정량적으로 분석하는 이 방법의 역량을 보여주기 위해, 서로 다른 전위 역학을 가진 두 가지 Yersinia 균주를 공여체 형광과 상대적 FRET 계수 모두를 사용하여 연구하였습니다.야생형 감염 세포는 시간이 경과함에 따라 형광 강도가 증가하는 양상을 보입니다. 예상대로, 형광 강도의 최대 기울기는 감염 기간과 양의 상관관계를 나타내며, 이는 이전 연구들과 일치하게 번역된 베타 락타마제(beta lactamase)의 서로 다른 농도를 구분할 수 있음을 시사합니다. Yersinia YOPE 결손 돌연변이체에 감염된 세포는 야생형 균주에 비해 형광 강도가 더 빠르게 증가합니다.흥미롭게도, 감염 시간을 90분으로 늘려도 60분 감염 때와 비교하여 공여체 형광의 상승이 더 가속화되지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때, CCR four 화합물의 처리는 첨가 직후부터 시작된다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 따라서 제때에 이미지 획득을 시작하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

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여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

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유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

배우세요 Yersinia enterocolitica의 이펙터 단백질 전좌 측정 방법을 베타-락타마제 융합 분석과 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여. 이 기술은 세균 병원성 메커니즘 연구에 민감하고 특이적인 도구를 제공합니다.

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