분석 예 르시 니아의 enterocolitica 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

다음 실험의 전반적인 목표는 vernia type 3 분비 시스템을 통해 숙주 세포로의 effector 단백질 전좌를 측정하는 것입니다. 이는 효과기 TEM one 베타 락타마제 융합체를 발현하는 예르시니아 돌연변이와 함께 힐라 세포를 배양하여 효과기 융합체를 HELOC 세포로 전좌할 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 감염된 HELOC 세포에는 세포 투과성 프렛 리포터 화합물이 적재되며, 이 화합물은 세포 에스트로에 의해 형광 CCF 4에 하전된 화합물로 처리되어 세포 내에 갇힙니다.

다음으로 트랜스 위치 베타-락타마제에 의한 CCF 4의 절단은 fre의 파괴를 초래하며, 이는 공여자 및 수용체 형광 강도를 분석하기 위해 레이저 스캐닝 현미경으로 기록됩니다. 결과는 공여체 형광 상승의 다양한 동역학을 기반으로 trans located effector TEM one beta lactamase fusion의 다양한 양을 보여줍니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점 중 하나는 CCF 4개 화합물의 세포 간 처리가 전좌 측정을 위한 매우 특이적이고 민감한 도구를 제공한다는 것입니다.

이 방법은 감염 하루 전에 박테리아와 숙주 세포의 상호 작용 중에 전좌가 어떻게 미세 조정되는지와 같은 박테리아 발병 기전 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 3ml의 LB 배지 및 필요한 항생제를 함유하는 3개의 개별 바이알에 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이 준비된 Y enterocolitica의 형질전환된 각 균주에서 하나의 콜로니를 접종합니다. 또한 감염 전날 200 마이크로 리터의 배양 배지에 15, 000 개의 세포를 파종하여 96 웰 플레이트의 9 개의 웰에 감염 당일 섭씨 37도의 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하여 발뒤꿈치 세포를 포함하는 플레이트를 준비합니다.

하룻밤 배양 2ml를 항생제 없이 40ml의 신선한 lb 배지에 접종합니다. 박테리아를 섭씨 37도에서 90분 동안 셰이커에서 180RPM으로 배양합니다. 이것은 90 분 후에 유형 3 분비 시스템의 발현을 유도하고, 배양물을 새로운 튜브로 옮기고 배양물을 얼음에 유지합니다.

이 시점부터. 박테리아를 펠릿으로 만들기 위하여 5, 000 G 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 배양물을 원심 분리하십시오. 다음으로, 펠릿을 2-3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS에 다시 현탁시키고, 박테리아 현탁액을 밀리리터당 8억 콜로니 형성 단위의 농도로 희석한 다음, 배양액을 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 각 배양의 해당 광학 밀도를 측정합니다. 각 균주의 박테리아 현탁액 3.5 마이크로 리터를 준비된 96의 다른 웰에 첨가합니다. 배지를 두 번 부드럽게 피펫팅하여 웰 플레이트와 혼합, 박테리아가 세포 당 약 100 박테리아의 감염 모티로 세포에 침전되도록합니다.

30분 간격으로 감염을 시작하고 세포를 섭씨 37도의 5%CO2 챔버에 유지하여 시간 경과를 수행합니다. 각 감염 후 첫 번째 감염 후 90 분 후에 헬라 세포를 제거하지 않고 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 밀리리터당 20마이크로그램의 클로람페니콜과 2.5밀리몰의 프로닉을 포함하는 50마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

이것은 effector의 발현을 멈추고 CCF 4의 수출을 줄일 것입니다. 현미경을 준비하려면 1ml 주사기를 사용하여 침지 매체를 우물 바닥에 펴서 지속적인 침수를 보장합니다. 침지 매체에 기포가 갇히지 않도록 하십시오.

그런 다음 96웰 플레이트를 현미경 스테이지로 옮기고 각각에서 나중에 분석할 수 있는 적절한 지점을 찾습니다. 10분 이내에 이 단계를 완료하십시오. 그런 다음 각각에 70마이크로리터의 CF 4:00 AM 로딩 용액을 추가합니다.

실온에서 5분 동안 접시를 잘 배양합니다. 다음으로, 로딩 용액을 흡인하고 밀리리터당 20마이크로그램의 클로람페니콜과 2.5밀리몰의 프로닉을 포함하는 100마이크로리터의 PBS를 첨가합니다. 그런 다음 신속하게 현미경 검사를 시작하십시오.

20배 배율의 높은 개구수 침지 대물렌즈를 제자리에 놓고 검출기 핀홀을 2.5 통풍 장치로 열고 96웰 플레이트를 컨포칼 레이저 스캐닝 스테이지로 이동합니다. 다음으로, 활성 공여체 및 수용체 채널이 동시에 있는 고감도 갈륨 비소 인산염 검출기를 선택합니다. 8 비트 깊이 3 배 프레임 평균 및 405 나노 미터 다이오드 레이저의 10 %로 여기합니다.

정확한 정량화를 보장하려면 두 채널의 검출기 게인을 동일한 값으로 설정하고 포화 픽셀을 피하십시오. 다음으로, 투과광을 활성화하고 모든 곳에서 대표 시야를 다시 확인하고 보정된 자동 스테이지를 사용하여 필요에 따라 위치를 잘 조정하고 다시 저장합니다. 마지막으로 타임랩스를 2분으로, 지속시간을 2시간으로 설정하고 이미지 획득을 시작합니다.

이미지 획득 후 픽셀 행렬의 산술 계산을 허용하는 소프트웨어로 데이터 세트를 가져옵니다. 먼저 메뉴를 클릭하여 동일한 오프셋을 사용하여 두 채널의 배경을 뺀 다음 이미지 처리로 이동하여 기준선 빼기를 선택합니다. 그런 다음 각 채널을 선택하고 기준선 값을 입력합니다.

공여체 채널의 블리드를 정정하고, 미리 결정된 보정 인자를 사용하여 1을 수용체 채널 채널 2로 채널하고, 이를 위한 새로운 채널 채널 2 프라임을 생성합니다. 메뉴를 클릭한 다음 이미지 처리와 채널 산술을 선택하고 채널 2의 절대값을 33번 뺀 값으로 입력합니다. 채널 1 그런 다음 채널 2를 삭제하고 수정된 수락자 채널을 통한 블리드가 새 채널 2로 유지되도록 합니다.

그런 다음 여기에 표시된 작업으로 새 채널을 만들어 상대 프렛 계수를 결정합니다. 그런 다음 채널 산술 메뉴로 돌아가서 프렛 채널의 적절한 시각화를 위해 채널 1과 채널 2로 나뉜 채널 2를 입력합니다. 8비트 이미지에서 255 곱하기 채널 3과 같은 네 번째 채널 채널 4를 만듭니다.

이미지 속성 메뉴로 이동하여 채널 색상을 변경하고 채널 4, 매핑된 색상, 색상 테이블 파일을 차례로 선택하고 jet을 선택합니다. 그런 다음 채널 3과 4에 3x3 중앙값 필터를 적용합니다. 그러면 이미지 처리 메뉴에 들어가 스무딩을 선택하여 이미지의 노이즈를 줄일 수 있습니다.

그 다음에 중앙값 필터를 선택하고 두 채널을 모두 선택하고 세포 신호의 정량화를 위해 3x3x1 크기의 필터를 적용합니다. 채널 4의 셀을 감지하려면 surpass view를 선택하고 아이콘을 클릭합니다. 새 지표면을 추가합니다.

surface window에서 감지 알고리즘 매개변수를 정의하고 두 개의 확인란을 활성화합니다. 관심 영역만 분할하고 전체 이미지를 처리합니다. 마지막으로, 다음으로, 차원을 편집하여 관심 영역을 정의합니다.

채널 4를 소스 채널로 선택하고 임계값 설정 메뉴로 이동하여 배경 빼기를 선택하여 임계값을 설정합니다. 직경을 10마이크로미터로, 최소 강도 임계값을 수동으로 0으로, 최대 임계값을 최대 강도로 설정합니다. 영역별로 구조를 필터링하고 최소값을 187제곱마이크로미터로 설정합니다.

그런 다음 표면 감지를 마칩니다. 마지막으로, 채널 1의 donor fluorescence intensity 및 channel 3의 relative fret coefficient에 대한 평균값을 세포 개체의 표준 편차와 함께 추출합니다. 표적 세포로의 effector 전좌를 정량적으로 분석하는 이 방법의 기능을 보여주기 위해 donor 형광과 상대 fret 계수를 모두 사용하여 전좌 역학이 다른 두 개의 yersinia 균주를 연구했습니다.

야생형 감염 세포는 시간이 지남에 따라 형광 강도가 증가합니다. 예상한 바와 같이, 형광 강도의 최대 기울기는 감염 기간과 양의 상관관계가 있으며, 이는 이전 연구에 따라 번역된 베타 락타마제의 다양한 농도를 구별할 수 있음을 나타냅니다. yersinia YOPE deletion mutant에 감염된 세포는 야생형 균주에 비해 형광 강도가 더 빠르게 증가합니다.

흥미롭게도, 감염을 90분으로 확대하는 것은 감염 60분에 비해 공여체 형광의 상승을 더 가속화하지 않았습니다.이 절차를 시도하는 동안, CCR 4 화합물의 처리는 추가 직후에 시작된다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 적시에 이미지 획득을 시작하는 것이 중요합니다.