다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

다음 실험의 전반적인 목표는 소위 meas라고 하는 다중 전극 어레이를 사용하여 유기형 척수 공동 배양에서 척추 내 연결의 기능적 재생을 연구하는 것입니다. 이것은 서로 다른 척수 분절 사이의 척수 내 연결을 모방하기 위해 측정에서 서로 옆에 있는 두 개의 횡방향 척수 절편을 배양함으로써 달성됩니다. 시험관내에서는 슬라이스가 성장하고 며칠 내에 시험관에서 서로 마주보는 면을 따라 융합됩니다.

두 번째 단계로. 병변은 배양에서 다른 시간대 후에 수행되며, 이는 절편의 완전한 분리로 이어집니다. 다음으로, 배양액은 최소 2주 동안 인큐베이터에 남아 있습니다.

척추 네트워크가 재생될 시간을 주기 위해 두 슬라이스 사이의 활동 폭발은 어린 나이에 병변이 발생한 배양은 기능적 재생에 대한 높은 잠재력을 보이는 반면, 나중에 병변이 있는 배양에서는 이 능력이 분명히 감소한다는 것을 보여줍니다. 막에서 배양된 절편, 해리된 배양 또는 BSA와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 Ergon typic 배양과 다중 전극 어레이의 결합을 통해 직접적인 실험적 접근을 통해 척수의 미세환경에서 재생의 기능적 측면을 평가할 수 있다는 것입니다. 여기에 표시된 것과 같은 사전 제작된 다중 전극 어레이를 제작하거나 구매하기 시작합니다. 다중 전극 어레이를 30초 동안 헹구어 100% 에탄올에 두 번, 70% 에탄올에 한 번, 증류수에 두 번 헹궈 살균합니다. 건조되면 유리 페트리 접시에 10-12개의 어레이를 넣고 섭씨 120도에서 20분 동안 어레이를 고압증기멸균한 후 뚜껑을 닫습니다.

각 다중 전극 어레이를 별도의 멸균 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 냉각된 피펫을 냉동실에서 꺼냅니다. 이를 사용하여 전극 위에 150마이크로리터의 냉각된 세포외 매트릭스 코팅 용액을 놓습니다.

페트리 접시의 뚜껑을 닫고 실온에서 1시간 동안 어레이를 배양합니다. 약 10분 후 전극 상단에 기포가 있는지 확인하고 고무로 덮인 주걱으로 부드럽게 제거합니다. 필요한 경우 모든 거품이 사라지는지 확인하십시오.

다음으로, 코팅 용액을 흡입합니다. 산전 및 배아 뉴런에 최적화된 매체로 지우기를 씻은 다음 증류된 멸균수로 두 번 헹굽니다. 헹구면 마를 때까지 실온에 두십시오.

어미에서 적출한 직후, 목이 잘린 E 14 쥐 배아를 멸균 냉각 세척 용액으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 뒷다리 위에 메스로 한 번, 네 팔다리 위에 메스로 한 번 완전히 횡단 절단을 수행하고 몸에서 팔다리를 제거합니다. 다음으로, 척수를 포함하는 뒤쪽 조각에서 내장을 분리하기 위해 정면 평면을 절개합니다.

다음으로, 척수가 들어 있는 뒤쪽 조각을 한 번에 하나씩 장착 디스크로 옮깁니다. 조직 헬기를 사용하여 225-250미크론 두께로 탯줄을 자릅니다. 그런 다음 다진 조직에 세척 용액 한 방울을 떨어뜨리고 조각을 멸균 냉각 세척 용액으로 채워진 35mm x 10mm 페트리 접시로 옮깁니다.

각 조각에 남아 있는 조직에서 척수를 절개합니다. 등뿌리 신경절이 붙어 있도록 주의하십시오. 슬라이스를 멸균 냉각 세척 용액으로 채워진 35mm x 10mm 페트리 접시에 옮깁니다.

그런 다음 조각을 섭씨 4도에서 1시간 동안 그대로 두십시오. 코팅된 마이크로 전극 어레이가 있는 페트리 접시를 실체 현미경 아래에 넣습니다. 어레이를 초점과 가운데로 가져옵니다.

전극 어레이에 있는 6마이크로리터의 치킨 플라즈마 방울. 작은 주걱을 사용하여 복부 크기가 서로 마주 보는 두 개의 척수 부분을 혈장 방울에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 다음은 닭 혈장 방울 주위에 8마이크로리터의 트롬빈을 주입합니다.

그런 다음 피펫 팁을 사용하여 닭고기, 혈장 및 트롬빈 혼합물을 조심스럽게 섞고 펴 바릅니다. 닭 혈장과 트롬빈 혼합물이 너무 끈적거리고 응고되기 시작하기 직전에 과도한 액체를 흡인하고 페트리 접시를 덮고 가습실에 넣습니다. 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터 내부에 약 한 시간 동안 놓습니다.배양 후 10마이크로리터의 영양 배지를 샘플에 조심스럽게 추가합니다.

페트리 접시의 뚜껑을 닫고 다시 인큐베이터에 45분 동안 넣습니다. 다음으로, 각 다중 전극 어레이 배양 어셈블리를 롤러 튜브에 넣고 3ml의 영양 배지를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 롤러 튜브를 롤러 드럼에 넣습니다.

멸균 고무 팁 집게를 사용하여 섭씨 37도의 인큐베이터에서 드럼을 1-2개의 RRP M으로 회전합니다. 롤러 튜브에서 다중 전극 어레이 배양 어셈블리를 제거하고 실체 현미경으로 페트리 접시에 넣습니다. 조직에 초점을 맞추고 두 조각이 융합되었는지 확인합니다.

그런 다음 어셈블리를 단단히 잡고 메스 날을 다중 전극 어레이의 홈에 놓습니다. 조직 절편에 가깝습니다. 메스를 약간 수평으로 잡고 메스 손잡이를 들어 올립니다.

그러나 메스 날이 바닥에서 끝까지 굴러서 조직을 절단하여 홈을 덮는 방식으로 메스 날을 어레이의 홈에 유지하도록 하십시오. 필요한 경우 25게이지 바늘 끝으로 잔여 조직 연결을 끊고 홈 내부 영역에서만 작업하고 부드러운 가장자리를 만지지 마십시오. 다중 전극 어레이 배양 어셈블리를 롤러 튜브에 다시 넣고 3ml의 신선한 영양 배지를 배양물에 추가합니다.

그런 다음 롤러 튜브를 섭씨 37도의 인큐베이터의 롤러 드럼에 다시 놓습니다. 다중 전극 어레이 배양 어셈블리를 기록 챔버에 장착하고 약 500마이크로리터의 세포외 용액을 어레이에 적용합니다. 그런 다음 현미경에 어셈블리를 장착합니다.

시스템이 안정화될 때까지 10분 동안 기다린 다음 10분 동안 각 활동 감지 전극의 기본 자발적 활동을 기록합니다. 안정적인 세포 외 상태를 보장하기 위해 총 2회 녹음을 반복합니다. 원하는 경우 모든 녹음 세션 후에 세포외 용액을 교환합니다.

1마이크로몰의 엄격한 9 및 10 마이크로몰의 가진을 함유하는 세포외 용액을 적용하여 네트워크를 억제하지 않고, E 14 랫트 배아의 척수에서 유래한 공동 배양의 기능적 회복 가능성을 조사하기 위해 전기적 활동을 기록하기 전에 최소 2분 동안 기다립니다. 병변은 시험관에서 8일에서 28일의 기간 동안 수행되었습니다. 2-3주 후, 자발적인 신경 활동이 기록되었습니다.

그런 다음 다중 전극 어레이를 사용하여 원시 데이터를 래스터 플롯으로 변환한 다음 네트워크 활동 플롯으로 변환하여 각 슬라이스의 각 측면별로 총 활동을 개별적으로 시각화합니다. 자발적인 활동은 일반적으로 여기에 표시된 폭발로 조직되며, 어린 나이에 분리 된 분리 된 조각은 기능적으로 연결된 것으로 나타납니다. 그러나 더 나이가 들면서 분리된 사람들은 비동기적으로 보입니다.

이 정보를 사용하여 다양한 연령에서 슬라이스 간의 동기화된 버스트의 양을 다음과 같이 결정하고 시각화할 수 있습니다. 이 절차에 따라 면역조직화학적 염색과 같은 다른 방법은 두 척추 쿼트 절편 사이의 기능적 연결에 기여하는 세포 유형과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.