초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 조기 바이러스 진입의 특정 단계에 대한 테스트 화합물의 항바이러스 효과를 결정하는 것입니다. 이는 바이러스 감염을 위해 숙주 세포를 먼저 파종함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 서로 다른 시간과 온도에서 바이러스 감염 및 테스트 화합물 처리를 수행하는 것입니다.

다음으로, 약물 처리된 접종물을 씻어내고 세포를 기저 배지로 겹쳐 놓습니다. 마지막 단계는 세포를 배양하는 것입니다. 궁극적으로 바이러스 감염성을 분석하여 바이러스 감염의 초기 바이러스 진입 단계에 대한 테스트 화합물의 영향을 결정합니다.

예를 들어, 광도계는 리포터 바이러스에 의한 감염으로 인한 세포 스내트의 루시페라아제 활성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 항바이러스제, 특히 바이러스 진입을 표적으로 하는 항바이러스제를 식별하는 데 있어 보다 메커니즘 기반 접근 방식을 허용할 수 있다는 것입니다. 먼저 테스트 화합물, 트릴로지 산 또는 CHLA 및 DMSO의 PUNIC 콜라겐 또는 PUG의 원액을 준비하고, 헤파린을 용해시켜 양성 대조군을 위해 멸균 이중 증류수에 담근 후 분석 배양을 위한 숙주 세포를 준비합니다.

인간 간암종, FBS와 항생제가 보충된 신선한 DMAM에서 하룻밤 사이에 HUH 7.5 세포. 테스트 화합물의 세포 독성을 테스트하기 위해 실험 전반에 걸쳐 생물 안전성 레벨 2 절차를 따르는 것을 잊지 마십시오. CHLA 또는 PUG의 농도를 0에서 500마이크로몰까지 증가시키는 기저 배지 또는 1% DMSO를 음성 대조군으로 처리한 다음 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 72시간 동안 세포를 배양합니다.

매체를 제거하고 200 마이크로 리터의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, XT T 분석 시약 100마이크로리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 492나노미터에서 흡광도를, 690나노미터의 기준 파장을 측정합니다.

이 값에서 주어진 공식을 사용하여 생존 가능성의 백분율을 계산합니다. 각 화합물에 대한 50% 세포 독성 농도를 측정합니다. 바이러스 불활성화 분석을 시작합니다.

첫 번째 플레이트, 웰 당 네 번째 셀에 10 곱하기. 96웰 플레이트에서 감염을 위한 부착을 위해 섭씨 37도의 세포에 5%의 이산화탄소를 하룻밤 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 참조된 대로 Gaia luciferase 리포터 태그가 지정된 C형 간염 바이러스 또는 HCV 입자를 준비합니다.

멸균 튜브에서 100 마이크로 리터의 100 마이크로 몰 CHLA 또는 PUG를 100 마이크로 리터의 10에서 4 분의 1과 혼합합니다. 포지티브 컨트롤 믹스를 위한 HCV의 초점 형성 단위 또는 FFU. 헤파린이 함유된 HCV는 최종 농도가 밀리리터당 1000마이크로그램입니다.

섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후 바이러스 화합물 혼합물을 실온에서 9.8ml의 기저 배지로 50배 희석합니다. 그런 다음 새로운 바이러스 화합물 혼합물을 준비하고 즉시 이 혼합물을 0 시간 배양 샘플에 대한 기초 배지에서 희석합니다.

세포에서 배양 배지를 제거한 후 웰당 100마이크로리터의 희석된 바이러스 약물 용액을 3회에 첨가합니다. 이 용액은 이제 웰 당 10에서 두 번째 FFU를 함유하고 있으며, 섭씨 37도와 5 % 이산화탄소를 3 시간 동안 배양하여 세포의 바이러스 감염을 허용합니다. 배양 후 웰에서 바이러스 현탁액을 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 두번.

100마이크로리터의 기저 배지에서 세포를 72시간 동안 배양하여 바이러스 복제 및 루시페라제 리포터를 상층액으로 방출합니다. 다음 배양물 및 마이크로 관 및 분리기에서 supernat를 17, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 G 원심 분리기 모으십시오. 세포 파편을 제거하려면 각 슈퍼nat 20마이크로리터와 가우시 루시페라제 분석 시약 50마이크로리터를 혼합하고 광도계에서 루시퍼라제 리포터 활성의 발광을 측정합니다.

바이러스 부착 분석 플레이트에 대한 제조업체의 지침에 따르면 웰당 10에서 4번째 세포를 1배로 사용합니다. 96웰 플레이트에 넣고 다음날 아침 세포 부착을 위해 밤새 배양합니다. 첫 번째 냉각, 1시간 동안 섭씨 4도에서 세포 단층을 포함하는 96웰 플레이트.

얼음에 테스트 화합물과 바이러스 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO 또는 양성 대조군 HCV 헤파린 용액은 10에서 두 번째 FFU 바이러스입니다. 각 처리에 대해 세포 배양 웰에서 배지를 부드럽게 흡인합니다.

그런 다음 즉시 100 마이크로 리터의 바이러스 테스트 화합물 혼합물을 3 중 우물에 넣고 온도를 높이지 않도록주의하십시오. 섭씨 4도로 유지되는 냉장고에서 3시간 동안 접시를 배양합니다. 바이러스 입자는 섭씨 4도의 셀 서비스에 부착되지만 내재화되지는 않습니다.

다음으로 상층액을 흡인합니다. 200마이크로리터의 얼음처럼 차갑게 세포를 두 번 부드럽게 씻습니다. PBS는 각 웰에 100마이크로리터의 기초 배지를 첨가한 다음 섭씨 37도에서 72시간 동안 배양합니다.

마지막으로, 감염된 세포에서 방출된 루시페라제 리포터를 정량화합니다. 각 샘플 웰에서 supernat를 수집하고 바이러스 융합 및 진입 분석을 위해 Gaussian Luciferase 분석을 수행합니다. 세포 배양 플레이트를 섭씨 4도에서 1시간 동안 미리 냉각합니다.

세포 부착을 위한 하룻밤 배양 후, 웰에서 기존 배지를 제거하고 얼음 위에서 10에서 두 번째 F-F-U-H-C-V로 세포를 감염시킵니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다. 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척하여 광고가 부착되지 않은 바이러스를 제거합니다.

그런 다음 얼음 위에서 기저 배지 또는 기저 배지에 용해된 테스트 화합물로 세포를 1% DMSO를 대조군으로 처리하고 플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 이를 통해 섭씨 37도에서 발생하는 바이러스 진입에 대한 테스트 화합물을 평가할 수 있습니다. 배지를 흡인하고 내재화되지 않은 바이러스를 200마이크로리터의 시트레이트 완충액 또는 PBS로 두 번 세척합니다.

웰당 100마이크로리터의 기초 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 72시간 동안 더 배양합니다. supernat를 수집하고 방출된 luciferase reporter를 검출하기 위해 이전에 입증된 바와 같이 Gaussian Luciferase assay를 수행합니다. 다음은 HCV에 대한 테스트 화합물의 효과입니다. 활성화 시, 바이러스는 감염 전 0시간 또는 3시간 동안 테스트 화합물과 함께 배양되었습니다.

바이러스 감염 억제 비율은 각 치료에 대해 표시됩니다. 음성 대조 DMSO는 억제를 나타내지 않습니다. CHLA는 0시간 배양 후, 그리고 3시간 동안 더 긴 배양 후에도 접촉 시 높은 억제력을 나타냅니다.

다른 테스트를 통한 추가 결과. 화합물 PUG는 이 일반적인 실험 설계를 적용하여 여기에 나와 있으며, CHLA 및 PUG는 배아 폐 섬유아세포에서 인간 거대세포바이러스 또는 HCMV의 감염성을 추가로 억제하는 것으로 나타났습니다. HCV 부착에 대한 CHLA 및 PUG의 효과는 다음과 같습니다.

테스트 화합물의 유무에 관계없이 세포를 섭씨 4도에서 바이러스와 함께 배양한 다음 결합되지 않은 바이러스 세포를 제거하여 바이러스에 의한 감염을 위해 섭씨 37도에서 배양했습니다. 음영 처리된 막대는 C-H-L-A-P-U-G 또는 헤파린이 HCV의 세포 진입에 미치는 영향을 보여줍니다. 이 경우 바이러스 부착은 먼저 섭씨 4도에서 수행되었습니다.

그런 다음 결합되지 않은 바이러스를 제거한 후 세포 진입을 위해 섭씨 37도에서 테스트 화합물로 배양했습니다. 마찬가지로, HCMV의 경우, CHLA 또는 PUG를 사용한 배아 폐 섬유아세포 감염 치료는 바이러스 부착 및 바이러스 진입을 강력하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 결과의 정확도에 영향을 미치는 표시된 온도에서 단계를 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.