초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

본 절차의 전반적인 목표는 초기 바이러스 진입의 특정 단계에 대한 시험 화합물의 항바이러스 효과를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 바이러스 감염을 위한 숙주 세포를 분주함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 서로 다른 시간과 온도에서 바이러스 감염 및 시험 화합물 처리를 수행하는 것입니다.

다음으로, 약물 처리된 접종물을 세척하여 제거하고 세포 위에 기초 배지를 덮어줍니다. 마지막 단계는 세포를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 바이러스 감염의 초기 진입 단계에 테스트 화합물이 미치는 영향을 결정하기 위해 바이러스 감염력을 분석합니다.

예를 들어, 루미노미터를 사용하여 리포터 바이러스 감염으로 인한 세포 내 루시페라아제 활성을 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 항바이러스제, 특히 바이러스 진입을 표적으로 하는 약물을 식별하는 데 있어 보다 메커니즘 기반의 접근 방식을 가능하게 한다는 점입니다. 우선, 테스트 화합물인 trilogy acid 또는 CHLA 및 PUNIC collagen 또는 PUG의 스톡 용액을 DMSO로 준비하고, 양성 대조군으로 사용할 heparin을 멸균 2중 증류수에 녹여 준비한 후, 분석을 위한 숙주 세포를 배양합니다.

인간 간암 HUH 7.5 세포를 FBS와 항생제가 첨가된 신선한 DMAM에서 하룻밤 동안 배양합니다. 시험 화합물의 세포독성을 테스트하는 실험 전 과정에서 생물안전 2등급(biosafety level two) 절차를 준수하십시오. 기본 배지에 희석하여 0에서 500 micromolar까지 농도를 높인 CHLA 또는 PUG를 세포에 처리하거나, 음성 대조군으로 1% DMSO를 처리한 후, 세포 배양 인큐베이터에서 37 °C로 72시간 동안 배양합니다.

배지를 제거하고 200 µL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, XT T assay 시약 100 µL를 첨가하고 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 그 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 690 nm의 기준 파장에서 492 nm의 흡광도를 측정합니다.

이 값들을 주어진 공식에 대입하여 생존율 백분율을 계산하십시오. 각 화합물에 대한 50% 세포 독성 농도를 결정하십시오. 바이러스 불활성화 분석을 시작합니다.

첫 번째 플레이트의 웰당 1×10⁴개의 세포를 분주합니다. 96-웰 플레이트에서 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건으로 하룻밤 동안 배양하여 감염을 위한 부착을 유도합니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 Gaussia luciferase 리포터가 태깅된 C형 간염 바이러스(HCV) 입자를 준비합니다.

멸균 튜브에 100 µM CHLA 또는 PUG 100 µL와 10⁴ FFU의 HCV 100 µL를 혼합하여 양성 대조군 혼합물을 준비합니다. HCV를 최종 농도가 1000 µg/mL가 되도록 heparin과 함께 혼합합니다.

37 °C에서 3시간 동안 배양하십시오. 3시간 후, 바이러스 화합물 혼합물을 실온에서 9.8 mL의 기초 배지로 50배 희석하십시오. 그런 다음 새로운 바이러스 화합물 혼합물을 준비하고, 0시간 배양 샘플을 위해 이 혼합물을 즉시 기초 배지로 희석하십시오.

세포에서 배양액을 제거한 후, 희석된 바이러스 약물 용액 100 µL를 웰당 3반복으로 첨가합니다. 이제 용액은 웰당 10² FFU를 포함하고 있습니다. 세포가 바이러스에 감염될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, 웰에서 바이러스 현탁액을 제거하고 200 µL의 PBS로 세포를 가볍게 2회 세척합니다.

바이러스 복제와 상층액으로의 루시퍼레이스 리포터 방출을 위해 세포를 100 µL의 기초 배지에서 72시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양액과 마이크로 튜브에서 상층액을 수집하고 4 °C에서 17,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세포 파편을 제거하기 위해, 각 상층액 20 µL를 Gaussia luciferase assay 시약 50 µL와 혼합하고, 루미노미터로 루시퍼레이스 리포터 활성에 의한 발광을 측정합니다.

바이러스 부착 분석 플레이트 제조사의 지침에 따라, 96-well 플레이트의 well당 1 × 10⁴개의 세포를 분주하고 세포 부착을 위해 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 세포 단층이 포함된 96-well 플레이트를 4 °C에서 1시간 동안 냉각합니다.

시험 화합물과 바이러스 혼합물을 얼음 위에서 준비합니다. 예를 들어, 1% DMSO가 포함된 H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 또는 10² FFU 바이러스가 포함된 HCV Heparin 양성 대조군 용액을 준비합니다. 각 처리군에 대해, 세포 배양 웰의 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

그 후 온도가 올라가지 않도록 주의하며, 바이러스 테스트 화합물 혼합액 100 µL를 세 개의 웰에 각각 추가합니다. 플레이트를 4 °C로 유지되는 냉장고에서 3시간 동안 배양합니다. 바이러스 입자는 4 °C에서 세포 표면에 부착되지만, 내부로 유입되지는 않습니다.

다음으로, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 200 µL로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다. 각 웰에 basal medium 100 µL를 추가한 후, 37 °C에서 72시간 동안 배양합니다.

마지막으로, 감염된 세포에서 방출된 루시페라아제 리포터를 정량합니다. 각 샘플 웰에서 상층액을 수집하고, 바이러스 융합 및 진입을 분석하기 위해 Gaussian Luciferase assay를 수행합니다. 세포 배양 플레이트를 4 °C에서 1시간 동안 미리 냉각합니다.

세포 부착을 위해 하룻밤 동안 배양한 후, 웰에서 기존 배지를 제거하고 10² FFU/mL의 HCoV로 얼음 위에서 세포를 감염시킵니다. 플레이트를 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 부착되지 않은 바이러스를 제거하기 위해 200 µL의 차가운 PBS로 세포를 부드럽게 두 번 세척합니다.

그 후 얼음 위에서, basal medium에 용해된 시험 화합물 또는 대조군으로 1% DMSO가 포함된 basal medium을 세포에 처리하고, 플레이트를 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 이를 통해 37 °C에서 일어나는 바이러스 진입에 대한 시험 화합물의 영향을 평가할 수 있습니다. 배지를 흡입하여 제거하고, 내부로 진입하지 않은 바이러스를 200 µL의 citrate buffer 또는 PBS로 2회 세척합니다.

웰당 100 µL의 basal medium을 첨가하고 37 °C에서 72시간 동안 추가로 배양합니다. 상층액을 수집하고, 이전에 시연된 방식대로 Gaussian Luciferase assay를 수행하여 방출된 luciferase 리포터를 검출합니다. 다음은 테스트 화합물이 HCV에 미치는 영향입니다. 활성화 단계에서, 바이러스는 감염 전 0시간 또는 3시간 동안 테스트 화합물과 함께 배양되었습니다.

각 처리군에 따른 바이러스 감염 억제율을 그래프로 나타내었습니다. 음성 대조군인 DMSO는 억제 효과를 보이지 않습니다. CHLA는 0시간 배양 후 접촉 즉시 높은 억제 효과를 보였으며, 3시간의 장기 배양 후에도 마찬가지로 높은 억제 효과를 나타냅니다.

다른 테스트를 통한 추가 결과입니다. 본 일반 실험 설계를 적용한 화합물 PUG의 결과가 여기에 제시되었으며, CHLA와 PUG가 배아 폐 섬유아세포에서 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 감염력을 추가적으로 억제함이 나타났습니다. HCV 부착에 대한 CHLA와 PUG의 효과가 여기에 제시되어 있습니다.

세포를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 바이러스와 함께 4 °C에서 배양한 후, 결합하지 않은 바이러스를 제거하고 37 °C에서 배양하여 바이러스 감염을 유도했음을 상기하십시오. 음영 처리된 막대는 C-H-L-A-P-U-G 또는 헤파린이 HCV의 세포 진입에 미치는 영향을 보여줍니다. 이 경우 바이러스 부착이 먼저 4 °C에서 수행되었음에 유의하십시오.

그 후 결합하지 않은 바이러스를 제거하고, 바이러스 침투를 위해 세포를 테스트 화합물과 함께 37 °C에서 배양했습니다. 마찬가지로 HCMV의 경우, 배아 폐 섬유아세포 감염 시 CHLA 또는 PUG 처리 결과 바이러스 부착 및 바이러스 침투의 강력한 억제가 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때는 결과의 정확도에 영향을 미치므로 명시된 온도에서 각 단계를 수행하는 것이 중요합니다.