대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조

다음 실험의 전반적인 목표는 drosophila melanogaster를 이용하여 대사체 연구에 충분한 양의 미토콘드리아 대사체를 제공하는 농축된 미토콘드리아 분획을 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 미토콘드리아 농축 분획에 필요한 충분한 양의 대사체를 생성할 수 있도록 충분한 수의 초파리를 배양합니다. 두 번째 단계로, 초파리를 유리 테플론 다운스 균질기(glass Teflon downs homogenizer)로 균질화하며, 이 과정에서 미토콘드리아의 무결성을 손상시키지 않고 세포막을 분쇄합니다.

다음으로 균질물을 차등 원심분리하여 농축된 미토콘드리아 시료를 생성합니다. 결과에 따르면 본 프로토콜을 통해 뚜렷한 미토콘드리아 대사 변화가 검출되었으며, 이는 미토콘드리아 농축 분획물 및 전신 추출물만을 기반으로 한 대사체 분석으로는 검출되지 않았던 것입니다. 초파리 전체 대사체 분석과 비교했을 때 이 절차의 주요 장점은 대사체 분석 전 미토콘드리아를 분리함으로써 민감도를 높이고 미토콘드리아 대사체 변화를 더 잘 검출할 수 있다는 점입니다.

실험을 시작하려면, 핫플레이트에서 초파리 먹이 성분을 90°C로 가열하십시오. 혼합물이 균질해지고 약간 걸쭉해질 때까지 주기적으로 저어줍니다. 먹이를 가열원에서 제거하고, 먹이가 80°C로 식으면 95% Ethanol에 용해된 0.2% TE decept methyl four hydroxy benzoate를 넣고 가끔씩 저어줍니다. 그다음, 먹이를 동일한 부피로 두 등분하십시오.

먹이의 온도가 50 °C까지 낮아졌는지 확인하고, 에탄올에 녹인 50 mM rapamycin 1.1 mL를 첫 번째 분량에, 처리되지 않은 에탄올 1.1 mL를 두 번째 분량에 넣고 섞습니다. 성충을 수집하려면 단단 regulators를 사용하여 고압 탱크의 순수 carbon dioxide를 공급합니다. 5 psi의 연속 흐름에서, 플라스틱 튜브를 사용하여 carbon dioxide를 water가 담긴 500 mL 여과 플라스크로 연결하고 튜빙을 통해 carbon dioxide를 버블링함으로써 정전기를 방지합니다.

이를 위해 구멍이 하나 있는 고무 마개를 사용하여 플라스크를 밀봉합니다. 플라스크의 측면 개구부에 플라스틱 튜브를 연결하고 이를 이산화탄소 패드에 연결하여 발달 과정 중 유충 밀도를 조절합니다. 배양 병에 부모 25쌍을 넣고 48시간 동안 알을 낳도록 합니다.

그 후, 알의 밀도를 조절하기 위해 부모 개체를 제거하고, 부화하는 F1 자손을 사용하여 이 단계들을 반복함으로써 두 세대에 걸쳐 이러한 밀도 제어를 수행합니다. 밀도가 제어된 조건에서 두 세대를 거친 후, 초파리를 패드 위에 10분에서 15분 이내로 두어 성별에 따라 분류합니다. 초파리를 실험 조건에 배치하기 전, 마취 상태에서 회복될 수 있도록 24시간 동안 둡니다.

미토콘드리아 농축 분획을 위한 충분한 대사물을 생성하기 위해 샘플당 300마리의 파리를 지정합니다. 150마리의 파리를 직접 제작한 1리터 케이지로 옮깁니다. 그다음 나머지 150마리의 파리를 별도의 1리터 케이지로 옮기며, 케이지 하나에 150마리 이상의 파리가 들어가 과밀해지지 않도록 합니다.

실험 조건당 6개의 반복 시료를 사용하고, 초파리 사육을 완료하기 위해 케이지를 25 °C, 12시간 명암 주기 조건에 둡니다. 먹이의 품질을 유지하기 위해 10일 동안 2~3일마다 5 mL의 먹이가 담긴 바이알에 신선한 먹이를 제공합니다. 초파리를 1 mL의 냉각된 분리 버퍼가 채워진 유리 테플론 호모게나이저에 쏟아부어 분리를 시작합니다.

다음으로, 미토콘드리아의 온전한 상태를 유지하기 위해 막자사발을 얼음 위에 놓고 초파리를 15회 스트로크 하여 균질화합니다. 유발을 비틀지 않도록 주의하며 균질물을 1.5 milliliter 튜브로 옮긴 후, 4 °C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 다른 튜브로 옮기고, 4 °C에서 6,000 ×g로 10분 동안 다시 원심분리하여 미토콘드리아를 농축합니다.

원심분리 후, 세포질 분획이 포함된 상층액을 제거합니다. 피펫팅을 통해 펠렛을 300 µL의 세척 완충액으로 재현탁합니다. 두 번째 세척 과정에 대해 이전 단계들을 조심스럽게 반복합니다.

그런 다음 두 케이지에서 얻은 재부유된 펠릿을 냉동 마이크로 원심분리관에 합치고, 이를 4°C에서 6,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 액체 질소로 급속 냉동합니다. 마지막으로 미토콘드리아 농축 분획을 -80°C에서 보관합니다.

이 웨스턴 블롯은 미토콘드리아 분획물에서 미토콘드리아의 효과적인 분리를 나타내는 지표인 미토콘드리아 막 수송 단백질 poin의 농축을 보여줍니다. Poin 단백질은 세포질 분획물에서는 검출되지 않는 반면, 세포질 미세소관 단백질인 tubulin 단백질은 미토콘드리아 분획물에서 검출되지 않아 세포질 단백질의 오염이 최소화되었음을 입증합니다. 주성분 분석(PCA)은 질량 분석으로 생성된 값을 Bradford 단백질 농도로 정규화하고 로그 변환한 후, 각 화합물에 대해 관찰된 최소값으로 보정한 값을 사용하여 생성되었습니다.

전체 대사체를 사용하여 PCA 도표를 생성하였습니다. 표준 초파리 전체 추출물로 얻은 야생형 및 돌연변이 초파리 균주의 미토콘드리아 DNA 대사체 프로파일은 PCA 도표를 통해 비교할 수 있습니다. 미토콘드리아 농축 추출물의 대사체 프로파일은 PC축 2를 따라 완전히 분리되며, 이는 라파마이신(rapamycin) 처리의 주요 효과를 반영합니다. 서로 다른 mtDNA 유전자형 간에는 미세한 차이만 존재합니다.

이와 대조적으로, 미토콘드리아 농축 추출물의 대사체 프로파일에서는 일반 먹이를 섭취한 야생형 M mt DNA 유전자형과 나머지 세 가지 샘플, 즉 라파마이신을 투여한 야생형 MTD NA 및 일반 먹이 또는 라파마이신 먹이를 섭취한 대안적 MTD NA 간의 분리가 나타납니다. 이는 대안적 MTD NA의 효과가 라파마이신 처리의 효과와 유사한 방식으로 대사체 프로파일을 변화시킨다는 것을 의미합니다. 이 프로토콜을 수행할 때, 반복 실험 간의 변동성을 줄이기 위해 실제로 모든 분획 과정을 같은 날에 수행할 것을 권장합니다.

시료 준비의 품질을 높이기 위해 사전에 계획을 수립하고 바이알에 라벨을 부착하며, 반복 실험 간의 대기 기록을 관리할 것을 권장합니다.