이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

이 현미경 검사 기술의 전반적인 목표는 단백질, 단백질 상호 작용을 단일 분자 및 나노미터 규모로 시각화하는 것입니다. 따라서 이 방법은 발암성 신호 전달 과정에서의 분자 상호 작용과 같은 생물학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 민감하고 특이적이며 단일 분자 및 나노미터 분해능을 제공한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 선임 연구원인 Dr.Tahan이 맡을 것입니다: RA와 RAF R-B-D-P-A-M Cherry를 복제한 후 Cherry one fragments는 바이러스 입자로 포장되어 텍스트 프로토콜에 따라 U2 OS 세포를 감염시킵니다. 이미징 플레이트를 위한 샘플을 준비하기 위해, 8웰 유리 바닥 챔버의 웰당 약 5.5배 10 내지 4번째 안정 발현 세포를 350마이크로리터의 페놀 레드 프리 DMEM으로 밀어 넣는다. 글루타르알데히드와 함께 새로운 파알데히드를 사용하여 세포를 고정하고 고정제를 PBS 또는 이미징 버퍼로 교체한 후 100나노미터 금 입자를 소용돌이치고 이미징 중 단계 드리프트를 추적하기 위해 웰당 35마이크로리터를 추가합니다.

현미경에 접근하여 405 및 561 나노미터 레이저의 전원을 켜고 이 시점에서 셔터를 닫은 상태로 유지하고 561 나노미터 이색성 거울과 노치 필터가 제자리에 있는지 확인합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다. E-M-C-C-D 카메라를 켜고 식힌 다음 노출 시간을 100밀리초로 설정하고 E-M-C-C-D 게인을 적절한 값으로 설정합니다.

대물렌즈에 이멀젼 오일을 추가하고 현미경 스테이지 에이지에서 샘플을 고정합니다. 그런 다음 명시야 또는 561 나노미터 레이저를 사용하여 RA 및 기타 멤브레인 단백질을 이미징하기 위해 샘플에 초점을 맞춥니다. 1.49 개구수를 가진 60 x APO 크로맷 잔디 대물렌즈를 사용하고 현미경을 잔디 구성으로 가져옵니다.

여기 레이저를 조정하여 잔디 대물렌즈의 뒤쪽 조리개에 부딪힐 때 중심에서 벗어나도록 하면 커버 슬립 버퍼가 얼굴에 닿을 때 레이저가 편향됩니다. 임계각에 도달하고 레이저가 다시 반사될 때까지 레이저 입사 위치를 계속 조정하십시오. 여러 금 입자가 보이는 이미지를 만들 셀을 검색합니다.

그런 다음 세포 또는 세포 영역과 금 입자를 둘러싸는 관심 영역을 설정하여 높은 발현 수준으로 인해 충분한 활성화가 이미 이루어지고 있는 경우 설정합니다. 405 나노미터 레이저를 끄고 561 레이저를 켠 상태에서 획득을 시작합니다. 그렇지 않으면 가장 낮은 공장 출력 설정에서 405 나노미터 레이저를 켜고 프레임당 수십 개의 분자가 있거나 단일 분자가 잘 분리될 때까지 점차적으로 증가시킵니다.

데이터 수집이 계속됨에 따라 405 나노미터 레이저 출력을 점진적으로 증가시켜 스폿 밀도를 거의 일정하게 유지합니다. 높은 4 0 5까지 이미지 획득을 계속합니다. 힘은 더 이상 시작되지 않습니다.

활성화 이벤트는 이미지 처리를 위해 끝납니다. 이미지 처리 소프트웨어를 다운로드합니다. MATLAB을 열고 WFI 읽기 소프트웨어를 불러옵니다.

원시 이미지 시퀀스를 보고 관심 영역 또는 ROI를 결정하고, 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 원하는 영역 주위의 상자를 드래그하여 처리할 스택 영역을 선택합니다. 획득 중에 관심 영역이 감소하지 않은 경우, 더 작은 영역을 선택하여 계산 시간을 줄이고 영역을 선택 해제하고 전체 프레임을 마우스 오른쪽 버튼으로 처리합니다. 옆의 이미지의 아무 곳이나 클릭하여 커버 슬립에 흡수된 금 나노 입자와 같은 신탁 마커 세트를 정의합니다. 이 마커는 잘 격리되고 균일하며 모양이 좋으며 이미지 스택 전체의 시야에 존재합니다. 먼저 후보 금 입자를 선택하여 해당 이미지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 그 주위의 작은 상자를 드래그합니다.

파티클 추적에서 추적 버튼을 클릭합니다. 드리프트의 정도를 나타내는 이미지 스택에서 선택한 금 입자의 위치를 보여주는 그래프가 나타납니다. 이 프로세스를 반복하여 가능한 한 많은 금 입자를 추적하고 함께 추적되는 입자를 확인합니다. 이상적인.

전체 드리프트는 한 번에 하나씩 최대 0.1 픽셀의 크기입니다. 함께 추적한 금 입자와 입자 추적 아래에서 선택합니다. 마커 추가 버튼을 클릭합니다.

녹색 십자가가 나타나 입자가 마커로 추가되었으며 드리프트를 수정하는 데 사용됨을 나타냅니다. 값을 약간 변경하여 필요에 따라 시그마 범위, 평활 범위 및 임계값을 조정합니다. 입자 찾기 버튼을 클릭하여 설정을 테스트하고 PAM cherry one과 같은 공정 입자를 육안으로 검사합니다. 상대적으로 둥글고 밝은 분자는 박스에 담겨 있고 그렇지 않은 분자는 제외됩니다.

이미지 처리를 시작하려면 코드 파일 만들기 버튼을 클릭하고 원하는 이름으로 파일을 저장하여 이미지를 후처리하고 손바닥 이미지를 렌더링합니다. MATLAB에서 palm 패키지를 실행하고 방금 만든 도트 코어 파일을 로드합니다. 물론 렌더링된 이미지가 제어 버튼 옆의 이미지 상자에 나타납니다.

다음과 같은 일반적인 값을 사용하여 개별 좌표를 정렬합니다. PAM Cherry one의 경우 프레임을 결합하면 8이 됩니다. 나노미터 단위의 거리를 결합하면 100, 최소 RMS는 4입니다.

최소 맞춤 적합도는 0.25이고 최대 편심은 1.4입니다. 정렬 버튼을 클릭하여 고해상도 이미지를 렌더링할 준비가 된 새로운 선별된 좌표 세트를 생성합니다. 최종 이미지의 적절한 렌더링을 위한 값(예: 이전에 결정된 원시 픽셀 크기, 렌더링된 이미지에서 원하는 피처 크기)을 입력합니다. 일반적으로 평균 현지화 및 픽셀 크기(예: 10나노미터)보다 약간 높은 값으로 설정됩니다.

렌더링된 이미지의 경우 렌더 버튼을 클릭하여 손바닥 이미지를 생성합니다. 그런 다음 Figure 창의 도구 모음에 있는 더하기 및 빼기 확대 아이콘을 사용하여 확대 및 축소하여 살아 있는 세포의 단일 분자를 추적할 수 있습니다. 조직 배양 표면을 처리하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 세포를 플레이트링합니다.

커버 유리가 현미경 설정에 적합한 두께인지 확인하십시오.세포를 transection하고 실험에 필요한 모든 처리 및 배양을 수행한 후 배양 접시를 무대 위의 인큐베이터에 놓습니다. 이 단계에서 온도와 CO2 농도가 안정화될 때까지 몇 분 동안 접시가 스테이지에 가라앉도록 합니다. 레이저를 차단하십시오.

CO2 제어를 사용할 수 없는 경우, 배경 형광을 억제하기 위해 leibovitz의 L 15와 같은 이미징 직전에 CO2 독립 매체로 변경하여 앞에서 설명한 대로 최종적으로 이미지를 획득하고, 시간 해상도를 잃지 않고 우수한 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 적절한 노출 시간을 설정합니다. 이 그림에서 BFC 손바닥은 RA 결합 도메인 또는 CRAF의 RBD와 상호 작용하는 KRAS G 12 D 돌연변이체입니다. 여기에 표시된 4가지 조합 각각은 렌티바이러스 감염 세포를 사용하여 U2 OS 세포에 도입되었으며, 그 중 2개는 상위 PAM Cherry one과 동일한 실험 설정을 사용하여 여기에서 입증된 바와 같이 BFC 재구성 PAM Cherry one의 광 활성화로 인해 405 나노미터 레이저가 켜졌을 때 형광의 급격한 증가로 식별된 강력한 양성 BFC 신호를 가졌습니다.

RN R 및 RAF RBD RC에 감염된 후 강력한 BFC 신호가 생성되었습니다. 여기서, RN과 RC는 개별 분자를 확대할 때 각각 PAM Cherry one의 n 및 C 말단 단편을 나타내며, 개별 분자의 확산 궤적을 획득하기 위해 손바닥을 추적하기 위해 단일 분자 추적 손바닥을 수행한 이 실험에서 나노 크기의 공간 분포를 명확하게 볼 수 있습니다. RAF RBD는 561 나노미터 및 405 나노미터 레이저로 연속 조명됩니다. 개별 PA m 체리 1 분자 st.

스위치를 켜고 몇 프레임 동안 지속한 후 움직이지 않거나 움직일 수 없는 어두운 상태로 진입합니다. 여러 분자에 대한 이 기록 플롯은 두 가지 유형의 궤적을 명확하게 보여줍니다. 확산 상태의 동일한 이질적인 분포는 Mass Mastered의 연속적인 프레임 사이의 분자 변위의 히스토그램에서 추론할 수 있습니다.

이 기법은 1주에서 3주 안에 완료할 수 있는데, 이는 구조물이 초월적인지, 형질주입되는지, 아니면 제대로 수행된다면 안정적으로 억압되는지에 따라 달라질 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 상호 작용이 없는 돌연변이 푸틴과 같은 컨트롤을 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 클러스터 분석과 같은 다른 방법은 세포 내에서 단백질 상호 작용이 공간적으로 어떻게 구성되어 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.

실험실 세포 추적의 경우, 평가 기반, 단일 입자 추적을 수행하여 확산 상태와 개발 후의 전이 확률을 결정할 수 있습니다. 이 기술은 암 생물학 분야의 우리 연구실에서 인간 종양 세포에서 RA 구동 상호 작용뿐만 아니라 호모 및 가족 수용체의 화를 탐구하는 데 사용되고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 생검 팜스를 설계하고 구현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

바이러스 백신 및 종양 세포를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 경우 항상 표준 생물 안전 프로토콜과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.