Name: 이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 배우세요 BiFC-PALM 현미경법으로 U2OS 세포에서 Ras-Raf 단백질 상호작용을 단일 분자 및 나노미터 해상도로 시각화하는 방법. 이 기술은 암 신호전달 경로 연구에 활용됩니다.

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저자는 도움이 되는 토론을 해준 Steven Chu 박사와 Joe W. Gray 박사, BiFC-PALM 프로젝트의 초기 작업에 대해 Henry Marr, 기술적 도움을 준 Alexis Shoemaker에게 감사를 표합니다. 이 작업은 OHSU에서 X.N.으로 시작하는 창업 자금으로 지원됩니다. Nan 실험실의 연구는 NIH 5U54CA143836-05, Damon Runyon 암 연구 재단, MJ Murdock 자선 신탁 및 FEI 회사의 지원도 받았습니다.

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PALM 그대로 생체 시료의 나노 이미징을 가능하게하는 최근 단일 분자 수퍼 해상도 현미경 기법 동안 BiFC는 검출 셀에서 프로톤 펌프 억제제를 시각화 기술에 일반적으로 사용되어왔다. 손바닥 BiFC의 조합은 나노 미터 공간 해상도와 단일 분자 감도 세포 내에서 프로톤 펌프 억제제의 선택 영상을 달성했다. BiFC-PALM은 두 가지 기술의 유틸리티를 확장하고,이 연구에서 입증 된 바와 같이, 그 나라의 셀룰러 맥락에서 프로톤 펌프 억제제의 분자 세부 사항을 공개 큰 약속을 보여줍니다. 특히, 나노 미터 해상도는 생물 의학 연구에 도전하고있다 분자 규모에서 특정 프로톤 펌프 억제제의 공간 및 시간 규제, 자세한 조사를 할 수 있습니다. 앞서 언급 그러나, BiFC-PALM은 보완 느린 발색단 성숙의 비가역성에 의해 제한된다. 스플릿 PAmCherry1은 원칙을 증명하기 위해 사용 된 UBiFC-PALM의 tility. PAmCherry1 널리 우수한 광 물리 특성에 대한 P...

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 생물학 1 기본적인 단단히 많은 시간과 길이 스케일에서 시공간 메커니즘을 통해 조절된다. 세포막 시그널링 세포에 관한 연구는 예를 들어, 특정 프로톤 펌프 억제제 및 세포 과정 (2)을 용이하게 동적 나노 스케일 공간 구획을 밝혀냈다. 따라서, 충분한 공간 및 시간 해상도, 높은 특이성 및 고감도 생물학적 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 검사 할 수있는 능력은 생물의 기계적 이해를 달성하기위한 키이다. 5 - 이분자 형광 보완 (BiFC)는 세포 내 해상도와 라이브 셀 호환성 3 셀에 프로톤 펌프 억제제를 시각화에 대한 몇 가지 기존 도구 중 하나입니다. 이 기술은 비교적 간단하고 두 비 형광 조각으로 형광 단백질의 분리를 포함한다; 유전자 두 개의 상호 작용하는 단백질에 태그 때근접하게, 단편은 형광 신호를 산출 완전한 형광 단백질을 형성하도록 재구성 할 수있다. 적절하게 설계하면 BiFC 프로브 자발적 프로톤 펌프 억제제의 부재하에 재구성 안된다. 이와 같이, BiFC 분석에서의 형광 신호 만 높은 특이성 프로톤 펌프 억제제의 직접적인 시각화를 가능하게 프로톤 펌프 억제제의 존재하에 일어난다. 판독으로 형광을 사용하는 추가 혜택은 다른 사람의 사이에서 높은 처리량과 높은 콘텐츠 심사 분석, 높은 감도, 세포 내 해상도 및 호환성이다. 이러한 장점에 대해, 다른 상위 형광 단백질에 기초 BiFC 프로브의 수는 개발되었다. 통상적 인 광 현미경 검사에 기초하여 모든 다른 검출 기술에서와 같이, 그러나 BiFC의 공간 분해능은 빛의 회절에 의해 ~ 250 나노 미터로 제한된다. 이 지질 뗏목 (6)을하여 이전 언급과 예시 된 바와 같이, 나노 스케일에서 프로톤 펌프 억제제의 조절을 연구하기 위해 그것에게 도전한다ND 라스 나노 클러스터 (7)는 이러한 시그널링 많은 세포 과정을 이해하는데 중요한 길이 스케일이다. BiFC는 프로톤 펌프 억제제 (10) 이미징을위한 공간 해상도에서이 한계를 극복하기 위해 광 활성화 현지화 현미경 (PALM) 8,9과 결합되었다. 손바닥 확률 활성화 및 단일 형광 분자의 subdiffractive 현지화를 통해 형광 이미징의 회절 한계를 우회 최근 수퍼 해상력 현미경 기술이다. 각 사이클에서 활성화, 형광 분자는 몇천 광자 몇백을 방출하고 검출기상의 단일 분자 영상을 발생시킨다. 화상 회절 한정 동안 (~ 250 nm의 폭)은, 그 중심은 일반적으로 검출 된 광자의 수에 따라 10 ~ 50 nm 인 주문에, 훨씬 더 높은 정밀도로 측정 할 수있다. 활성화하고 샘플의 각 형광 분자를 로컬 화하여, 고해상도 화상이 재구성 될 수있다. Performe살아있는 세포에 D, 하나의 셀 (11)에서 단백질 확산 궤적 수천의 단일 분자 추적 (SMT를 구분) 종려 추가 허가 취득. 중요한 것은, 손바닥 확률 활성화를 달성하기 위해 이러한 광활성 형광 단백질 (PA-FPS)와 같은 특수 형광 프로브를 사용합니다. BiFC 및 PALM 이용 형광 단백질 양 때문에,이 아미노산 159과 160 사이의 두 단편으로, PALM PAmCherry1 위해, 일반적으로 사용되는 PA-FP를 분할하여 혼합 하였다. 스플릿 PAmCherry1에 기초 BiFC 시스템은 두 조각의 자발적인 재구성에서 낮은 배경 신호를 나타낸다. 상호 작용하는 단백질의 유전자 쌍 태그 때, 두 조각 (RN = 159은 잔기 RC = + 잔기 1백60부터 2백36까지 메트)에도 37 ℃ 낮은 온도에서 배양없이 완전한 PAmCherry1 단백질을 형성하도록 효율적으로 재구성 어느 이러한 부모 mCherry (13)와 같은 다른 BiFC 쌍 (12)의 경우에는 해당되지 않습니다. Furthermo다시 재구성 PAmCherry1 단백질은 정확한 단일 분자 현지화 및 고해상도 PALM 영상에 중요한 다른 사람 사이의 높은 명암비, 매체 광자 수율, 빠른 photoactivati​​on, 같은 부모 PAmCherry1의 광 물리 특성을 유지했다. 이 프로토콜에서, 스플릿 PAmCherry1 (도 1A)를 사용하여 U2OS 세포에서 라스 - 미친 상호 작용을 이미징 BiFC-PALM의 사용을 설명한다. 첫 번째 단계는 PAmCherry1 단편 (즉, RN과 RC) 및 관심 단백질 사이의 융합 단백질을 표현하기위한 구조를 설계하는 것이다. 이론적으로, 후보 단백질 (A 및 B)의 각 쌍에 대해, 융합 단백질 여덟 쌍 테스트 될있다 : RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; -RC / RN-B; 및-RC는 / B-RN. 이 프로세스는 종종 계정에 후보 단백질의 구조적 또는 생화학 적 특성을 고려함으로써 단순화 될 수있다. 라스의 경우, 상기 단백질은번역 후 C- 말단 CAAX 상자에서 수정 (C = Cys이고; = 지방족, X = 모든), 그 후 AAX 모티브 전원이 절단된다. 따라서, RN 또는 RC은 라스의 N 말단에 융합 될 수있다; 이 4 개의 (도 1b)에 대한 융합 단백질의 쌍의 수를 감소시킨다. Raf를 들어, 도메인은 라스 - 결합 (RBD를 잔기 51에서 1백31까지)가 사용되며, 양단에 태그 될 수있다. 이러한 네 융합 구성이 생성되었다 : RN-KRAS / RC-Raf를 RBD; RN-KRAS / Raf를 RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf를 RBD; 와 RC-KRAS / Raf를 RBD-RN. 또한, 단편 및 관심 단백질 사이의 링커는 고려 될 필요가있을 것이다. 약 10 아미노산 링커는 유연 종종 보완이 발생하기에 충분한 자유도를 제공로서 사용된다. 여러 복제 사이트 (MCS) (14)에서 생성 된 임의의 시퀀스를 포함하여 성공적으로 적용되어 많은 사람들이 있기는하지만 그 중 하나 링커, (GGGGS) X2입니다. 링커의 길이는 dependin 최적화 될 필요가있다관심의 단백질과 방향 상호 작용의 크기에 들어. PAmCherry1 단편의 MCS의 측면에있는 작은 복제 백본에 포함되어 있습니다 (자료 목록 참조). 관심있는 유전자는 제한 부위로 결찰 또는 독립적 인 방식으로 삽입 될 수있다. 클로닝 및 서열 확인 후, 발현 카세트가 재조합 효소 반응, 높은 정확도 및 높은 효율로 복제 프로세스를 사용하여 발현 벡터로 전달된다. 이어서, 생성 된 작 제물은 발현 표적 세포주를 감염위한 안정된 세포주 원하면, 렌티 바이러스로 패키지, 표적 세포주로 형질 감염 또는된다. 과도 형질은 BiFC 구성의 빠른 확인이 가능하지만, 잠재적 인 문제는 주목해야합니다. 종종 화학 물질을 사용하는 형질 감염이 높은 형광도의 결과, 세포를 강조; 반면 전반사 형광 (TIRF) microsco 사용PY는 프로톤 펌프 억제제는 세포막에 일어날 때 조명 볼륨 TIRF 이상적 제한함으로써 이러한 배경 신호를 완화 할 수있다. 또한, 일시적인 형질은 종종까지 프로톤 펌프 억제제를 검출하는 아티팩트가 발생할 수 있습니다 내인성 단백질의 사람들을 초과, 단백질 발현의 높은 수준을 초래할. 따라서, 적절한 BiFC 구성은 초기 테스트를 통해 측정 한 후 안정한 세포주를 확립하는 것이 권장된다. 안정한 세포주는 독시사이클린 유도 (15)를 통해 조정 가능한 발현의 가능성을 가지고있다. 감염 후 세포는 일반적으로 퓨로 마이신과 각 구조에 대한 네오 마이신, 하나, 항생제로 선택됩니다. 샘플 준비, 이미지 수집 및 데이터 분석을위한 후속 단계는 프로토콜에 상세히 설명한다. 이 방법, 라스-Raf를 RBD의 BiFC-PALM 이미지에서 나노 클러스터의 형성이 정기적으로 관찰된다 (그림 2A &lt;/ STRONG&gt;). 지속적으로, 라스-Raf를 RBD의 SMT-PALM 궤도는 확산 상태 (그림 2B-D)에서 이종 분포를 보여줍니다. 이러한 결과는 라스-Raf를 착체 잠재적 생물 함의 아마도 단량체 및 클러스터로서, 세포막의 여러 상태에 있는지 제안한다. 이 작업은 종래 BiFC 형광 공동 지역화 또는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 얻는 것이 어려울 수 나노 미터의 공간 해상도와 단일 분자 감도를 가진 세포에서의 프로톤 펌프 억제제의 선택적 이미징 BiFC-PALM의 전력을 나타낸다. BiFC 실험을 설계하고 결과를 해석 할 때, BiFC 프로세스가 분할 PAmCherry1을 포함하여 대부분의 경우에 돌이킬 명심하는 것이 중요하다. 두 조각이 결합하여 완전한 PAmCherry1 단백질, 두 조각 사이의 결합을 형성하고, 일단 따라서 PPI는 영구된다. 이것은 BiFC과 BiFC-PAL의 사용을 제한프로톤 펌프 억제제의 역학 (즉, 결합 반응 속도가 아니라이 형성되면 단백질 복합체의 확산 역학)를 모니터링하고 시간에 M 심지어 PPI 단지의 mislocalization가 발생할 수 있습니다. BiFC-PALM 실험을 설계하는 형광 단백질에 내재되어 발색단 성숙의 지연 인 경우 추가 요인을 고려해야한다. 두 단백질이 상호 작용하고 FP 조각이 함께 모여되면, 그들은 일반적으로 초 (EYFP 3 60 초 하프 타임)의 순서에 접힘. 그러나, 이후의 발색단의 성숙과 형광 신호 분 정도의 개발. 형광 분할 금성, 빨리 접는 YFP 변형의 재구성 후 10 분 이내에 검출 할 수 있지만, 일반적으로 성숙 하프 타임은 종종 약 60 분 (16)이다. 분할 PAmCherry1 비슷한 속도를 가지고 관찰 하였다. 따라서, BiFC과 BiFC-PALM 실시간 PPI 속도론을 모니터링 현재 가난한 선택할 수 있습니다; 다른 나FRET과 같은 최근 개발 된 이량 종속 형광 단백질 17 thods 등이 목적에 더 적합 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>현미경 프레임</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X 오일 이멀젼 TIRF 대물렌즈(1.49 NA</td><td>포함) Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm 레이저</td><td>옵토 엔진</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm 레이저</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm 이색성 미러</td><td>셈록</td><td>&nbsp; Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561nm 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561nm 노치 필터</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>온도 및 CO2 제어 단계</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD 클로닝</td><td>클론텍</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Packaging</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 형질주입 시약</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II 챔버 커버 글라스</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1.5 유리 바닥 접시</td></tr><tr><td>U2OS 셀</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 DMEM</td><td>라이프 테크놀</td>스 <td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 페놀 레드</td><td>라이프 테크놀</td>스 <td>21063</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>라이프 테크놀</td>스 <td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovit's L-15, 페놀 레드 없음</td><td>라이프 테크놀스 21083-027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>감소 혈청 매체</td><td>라이프 테크놀스</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 농축기</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>레트로바이러스 농축기</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10cm 배양 dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomycin</td></tr><tr><td>Doxycyline</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>피셔</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>파이프</td><td>시그마</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100nm 금 입자</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 물</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep 키트</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0.6 ml 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>15ml 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC 매체</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>유능한 세포</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

단백질-단백질 상호작용(PPI)은 생물학의 핵심 분자 사건입니다. 그러나 기존 광학 현미경의 해상도는 회절이 ~250nm로 제한되기 때문에 세포에서 충분한 해상도와 감도로 PPI를 시각화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 광활성화 국소화 현미경(PALM)을 결합하여 단일 분자 감도와 나노미터 공간 분해능으로 세포에서 PPI를 시각화할 수 있습니다. BiFC는 형광 단백질을 두 개의 비형광 단편으로 분할하는 형광 대비로 PPI를 시각화하는 데 일반적으로 사용되는 기술입니다. PALM은 광활성 형광 단백질(PA-FP)과 같은 광변형 가능한 형광 프로브를 사용하여 나노미터 및 단일 분자 규모에서 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 최신 초고해상도 현미경 기술입니다. BiFC-PALM은 PALM과 호환되는 PA-FP인 PAmCherry1을 분할하여 단량체 특성, 우수한 단일 분자 밝기, 높은 명암비 및 화학량론 측정에 대한 유용성을 입증했습니다. 아미노산 159와 160으로 분리할 때 PAmCherry1은 PPI에 대한 특이성이 높고 비특이적 재형성이 낮은 37°C에서 효율적으로 재용해되는 BiFC 프로브로 만들 수 있습니다. Ras-Raf 상호 작용은 BiFC-PALM이 나노미터 규모 및 단일 분자 분해능으로 상호 작용을 조사하는 데 어떻게 도움이 되는지 보여주기 위한 예로 사용됩니다. 이들의 확산은 단일 분자 추적(smt-) PALM을 사용하여 살아있는 세포에서 추적할 수도 있습니다. 이 프로토콜에서는 BiFC-PALM을 위한 융합 단백질을 설계할 때 고려해야 할 요소에 대해 논의하고, 시료 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석 단계를 설명하고, 몇 가지 예시적인 결과를 보여줍니다. 높은 공간 분해능, 특이성 및 감도를 제공하는 BiFC-PALM은 온전한 생물학적 샘플에서 PPI를 연구하는 데 유용한 도구입니다.

표시된 BiFC-PALM 예제 CRaf의 도메인 (RBD) (그림 1A)를 결합 라스와 상호 작용 KRAS G12D 돌연변이입니다. 논의 된 바와 같이 그것의 라스 막 지역화 때문에 생물학적 활성을 방해 할 것이기 때문에, RN 또는 RC 라스 단편의 C- 말단에 태그되지 않았다. 이 네 가지 (그림 1B)에 여덟에서 가능한 조합을 감소시켰다. 이러한 네 개의 조합들 각각은 렌티 바이러스를 사용하여 감염 U2OS 세포에 도입 하였다. 프로토콜에서 설명하는대로 세포를 고정하고, BiFC 신호는 팜 설정을 사용하여 평가 하였다. 405 nm의 레이저가 켜져 때 긍정적 인 BiFC 신호와 세포 형광의 급격한 증가에 의해 확인되었다; 561 nm의 레이저 이미징 실험 내내이었다. 형광이 갑작스러운 변화는 405 nm의 레이저와 조명에 따라 BiFC-재구성 PAmCherry1의 photoactivati​​on 때문이다. 샘플의 복수의 영역은이 방법을 사용하여 평가 하였다및 B...

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

이 현미경 기술의 전반적인 목표는 단일 분자 및 나노미터 수준에서 단백질과 단백질 간의 상호작용을 시각화하는 것입니다. 따라서 이 방법은 발암성 신호 전달 과정에서의 분자 상호작용과 같이 생물학 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 민감도와 특이도가 높으며, 단일 분자 및 나노미터 해상도를 제공한다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 선임 연구원인 Tahan 박사가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 RA 및 RAF R-B-D-P-A-M Cherry 1 단편을 클로닝하여 바이러스 입자에 패키징하고 U2 OS 세포에 감염시킵니다. 이미징 샘플을 준비하기 위해, phenol red free DMEM 350 µL가 담긴 8웰 글라스 바텀 챔버 슬라이드의 웰당 약 5.5 × 10⁴개의 안정적 발현 세포를 분주합니다. glutaraldehyde가 포함된 신선한 paraldehyde를 사용하여 세포를 고정하고, 고정액을 PBS 또는 이미징 버퍼로 교체한 후 100 nm 금 입자를 볼텍싱하여 이미징 중 스테이지 드리프트를 추적하기 위해 웰당 35 µL씩 첨가합니다.현미경으로 다가가 셔터를 닫은 상태에서 405 및 561 nanometer 레이저의 전원을 켭니다. 이때 561 nanometer 다이크로익 미러와 노치 필터가 장착되어 있는지 확인하십시오. 이미지 획득 소프트웨어를 실행합니다. E-M-C-C-D 카메라의 전원을 켜고 냉각시킨 후, 노출 시간을 100 milliseconds로, E-M-C-C-D 게인을 적절한 값으로 설정하십시오.대물렌즈에 이머전 오일을 도포하고 시료를 현미경 스테이지 위에 고정합니다. 다음으로 명시야 또는 561 nanometer 레이저를 사용하여 RA 및 기타 막 단백질의 이미징을 위해 시료의 초점을 맞춥니다. 수치구경 1.49의 60 x APO chromat turf 대물렌즈를 사용하고 현미경을 turf 구성으로 설정합니다.흥분 레이저가 turf 대물렌즈의 후면 개구부에 닿을 때 중심에서 벗어나도록 조정하면, 레이저가 커버 슬립 버퍼 인터페이스에 도달했을 때 굴절됩니다. 임계각에 도달하여 레이저가 다시 반사될 때까지 레이저 입사 위치를 계속 조정하십시오. 시야에 여러 개의 금 입자가 보이는 이미징 대상 세포를 찾으십시오.그 다음, 세포 전체 또는 세포의 일부 영역과 금 입자를 포함하는 관심 영역(region of interest)을 설정합니다. 높은 발현 수준으로 인해 이미 충분한 활성화가 일어나고 있는 경우에도 동일하게 설정하십시오. 405 nanometer 레이저는 끄고 561 레이저는 켠 상태로 획득을 시작합니다. 그렇지 않은 경우에는 405 nanometer 레이저를 공장 출하 시 최저 전력 설정으로 켜고, 프레임당 수십 개의 분자가 나타나 단일 분자들이 충분히 분리될 때까지 전력을 점진적으로 높입니다.데이터 수집이 계속됨에 따라, 스폿 밀도를 대략 일정하게 유지하기 위해 405 nanometer 레이저 출력을 점진적으로 증가시키십시오. 높은 405 nm 출력에서도 더 이상 반응이 나타나지 않을 때까지 이미지 수집을 계속하십시오.이미지 처리를 위한 활성화 이벤트가 종료됩니다. 이미지 처리 소프트웨어를 다운로드하십시오. MATLAB을 실행하고 WFI 판독 소프트웨어를 로드하십시오.원본 이미지 시퀀스를 확인하고 관심 영역(ROI)을 결정하십시오. 스택에서 처리할 영역을 왼쪽 클릭하여 원하는 영역 주변에 상자를 드래그함으로써 선택합니다. 획득 과정에서 관심 영역이 축소되지 않았다면, 계산 시간을 단축하기 위해 더 작은 영역을 선택하십시오. 영역 선택을 해제하고 전체 프레임을 처리하려면 이미지의 아무 곳이나 오른쪽 클릭하십시오. 다음으로, 이미지 스택 전반에 걸쳐 시야 내에 존재하며, 잘 분리되어 있고 모양이 균일한 커버스립 흡착 금 나노입자와 같은 기준 마커 세트를 정의하십시오. 이미지 상의 금 입자 후보를 왼쪽 클릭하고 그 주변에 작은 상자를 드래그하여 선택하는 것부터 시작하십시오.입자 추적(particle tracking) 항목에서 추적(track) 버튼을 클릭하십시오. 선택한 금 입자의 위치가 이미지 스택 전체에서 어떻게 나타나는지를 보여주는 그래프가 생성되며, 이를 통해 드리프트의 정도를 확인할 수 있습니다. 이 과정을 반복하여 가능한 한 많은 금 입자를 추적하고, 함께 이동하는 입자들을 파악하십시오.전체 드리프트는 한 번에 최대 0.1 pixel 정도의 크기로 발생합니다. 함께 추적되었으며 입자 추적 하에 있는 금 입자들을 선택하십시오. 마커 추가 버튼을 클릭하십시오.입자가 마커로 추가되어 드리프트 보정에 사용됨을 나타내는 녹색 십자 표시가 나타납니다. 값을 약간씩 변경하여 sigma 범위, smoothing 범위 및 임계값을 필요에 따라 조정하십시오. 입자 찾기(find particle) 버튼을 클릭하여 설정을 테스트하고, 상대적으로 둥글고 밝은 PAM cherry 분자와 같은 공정 입자들이 박스로 표시되고 그렇지 않은 입자들은 제외되는지 시각적으로 확인하십시오.이미지 프로세싱을 시작하려면 make cord file 버튼을 클릭하고, 이미지 후처리 및 palm 이미지 렌더링을 위해 원하는 이름으로 파일을 저장하십시오. MATLAB에서 palm 패키지를 실행하고 방금 생성한 dot core 파일을 불러옵니다. 제어 버튼 옆의 이미지 상자에 거칠게 렌더링된 이미지가 나타납니다.다음의 일반적인 값을 사용하여 개별 좌표를 정렬하십시오. PAM Cherry의 경우, 결합 프레임은 8입니다. 나노미터 단위의 결합 거리는 100이며, 최소 RMS는 4입니다.최소 적합도(fit goodness)는 0.25이며 최대 편심률(eccentricity)은 1.4입니다. 정렬 버튼을 클릭하여 고해상도 이미지 렌더링 준비가 된 새로운 큐레이션 좌표 세트를 생성하십시오. 최종 이미지의 적절한 렌더링을 위해 이전에 결정된 원본 픽셀 크기, 일반적으로 평균 국소화 값보다 약간 높게 설정되는 렌더링 이미지의 희망 특징 크기, 그리고 10 nanometers와 같은 픽셀 크기 등의 값을 입력하십시오.렌더링된 이미지를 얻으려면 렌더 버튼을 클릭하여 손바닥 이미지를 생성하십시오. 그런 다음 피겨 창 도구 모음에 있는 플러스 및 마이너스 확대 아이콘을 사용하여 확대 및 축소함으로써 살아있는 세포 내의 단일 분자를 추적하십시오. 조직 배양 표면을 처리하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 세포를 플레이팅하십시오.세포를 절단하고 실험에 필요한 모든 처리 및 배양을 수행한 후, 커버글라스가 현미경 설정에 적합한 두께인지 확인하십시오. 그다음 배양 접시를 스테이지 상부 인큐베이터에 올립니다. 이 단계에서는 온도와 CO2 농도가 안정화될 때까지 접시를 스테이지 위에 몇 분간 둡니다. 레이저를 차단하십시오.CO2 조절이 불가능한 경우, 배경 형광을 억제하기 위해 이미징 직전에 Leibovitz's L 15와 같은 CO2 독립 배지로 교체하십시오. 마지막으로, 시간 분해능을 잃지 않으면서 양호한 신호 대 잡음비를 확보할 수 있도록 적절한 노출 시간을 설정하여 앞서 설명한 방식대로 이미지를 획득합니다. 이 그림의 BFC palm은 CRAF의 Ras 결합 도메인 또는 RBD와 상호작용하는 KRAS G 12 D 돌연변이체입니다. 여기에 제시된 네 가지 조합 각각을 렌티바이러스 감염을 통해 U2 OS 세포에 도입하였으며, 두 가지 구성에서 강한 양성 BFC 신호가 확인되었습니다. 이는 부모 PAM Cherry one과 동일한 실험 설정을 사용하여 여기에서 보여준 바와 같이, BFC 재구성 PAM Cherry one의 광활성화로 인해 405 nanometer 레이저를 켰을 때 형광이 급격히 증가한 것으로 확인되었습니다.RN R 및 RAF RBD RC 감염 후 강한 BFC 신호가 생성되었습니다. 여기서 RN과 RC는 각각 PAM Cherry one의 n-말단 및 C-말단 단편을 나타내며, 개별 분자와 그 나노스케일 공간 분포를 명확하게 확인할 수 있습니다. 이 실험에서는 개별 RA의 확산 궤적을 획득하기 위해 단일 분자 추적 palm이 수행되었습니다. 561 nm 및 405 nm 레이저로 지속적으로 조사된 RAF RBD 복합체입니다. 개별 PA m cherry one 분자 st.어두운 상태(dark states)로 진입하기 전 몇 프레임 동안 켜진 상태를 유지하며, 이때 분자들은 부동 상태이거나 이동 상태인 것으로 확인되었습니다. 여러 분자에 대한 이 기록 도표는 두 가지 유형의 궤적을 명확하게 보여줍니다. 연속된 프레임 사이의 분자 변위에 대한 히스토그램을 통해서도 확산 상태의 동일한 이질적 분포를 추론할 수 있습니다.이 기술은 적절하게 수행될 경우, 컨스트럭트(construct)를 일시적으로 전이시키는지, 형질전환시키는지, 또는 안정적으로 발현시키는지에 따라 1주에서 3주 정도 소요될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 해당 상호작용이 결여된 돌연변이 단백질과 같은 대조군을 준비하는 것이 중요합니다. 단백질 상호작용이 세포 내에서 공간적으로 어떻게 구성되어 있는가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 클러스터 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.실험실 세포 추적을 위한 평가 기반으로서, 단일 입자 추적을 통해 확산 상태와 발달 후의 전이 확률을 결정할 수 있습니다. 이 기술은 우리 실험실의 암 생물학 분야에서 RA 구동 상호작용뿐만 아니라 인간 종양 세포 내 HER 패밀리 수용체의 동종 및 이종 중합화를 탐구하는 데 사용되고 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 관심 있는 단백질 상호작용을 조사하기 위해 바이오접합 팜 S를 설계하고 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.항바이러스제 및 종양 세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 표준 생물 안전 프로토콜과 같은 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

배우세요 BiFC-PALM 현미경법으로 U2OS 세포에서 Ras-Raf 단백질 상호작용을 단일 분자 및 나노미터 해상도로 시각화하는 방법. 이 기술은 암 신호전달 경로 연구에 활용됩니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

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