Name: 공 촛점 분석을 사용하여 아프리카 발톱 개구리 laevis의의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 공 촛점 현미경을 사용하여 Xenopus laevis 상피 조직에서 형광 표지 리간드의 분비와 확산을 시각화하는 방법을. 이 기술은 형태 발생 그라디언트 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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BBSRC에 의해 투자 된이 작품은 (BB / H010297 / 1), SAR에 BBSRC 할당량 재학 및 SWF에 MRC 학생이기을 MEP에 부여합니다.

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
<li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPownall%2C+ME+%22FGF+Signalling+in+Vertebrate+Development%22">FGF Signalling in Vertebrate Development</a>. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).</li>
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<li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+animal+development%3A+paradigms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li>
<li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+positional+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li>
<li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics%2C+spatial+range%2C+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li>
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<li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube%3A+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li>
<li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li>
<li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li>
<li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li>
<li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
<li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li>
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<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
<li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury%3A+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled%2C+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li>
<li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li>
<li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li>
<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

이 프로토콜의 핵심적인 부분은 일반적으로, 처리 된 분비, 및 장착 된 형광 부분이 있음에도 불구하고, 수용 세포의 반응을 유도 할 수있는 생물학적 활성 리간드를 생성한다. 이 형광 표지 된 유전자 산물은 적절한 분석법을 이용하여 생물학적으로 활성화되어 있음을 확립하는 것이 중요합니다. 쉬-GFP를 들어 PTC1의 발현을 활성화 할 수있는 능력을 확인 하였다 (16). Wnt8a는 하나의 복부 할구 20 ~ 21로 표현하고, Wnt8a-HA-eGFP는이 생물학적 활성을 유지 보였다 때 보조 축을 유도하는 현저하게 강력한 기능을 가지고 있습니다. Wnt11b은 수렴 확장 21-22를 겪고에서 티빈 처리 외배엽 외식을 억제하고, Wnt11b-HA-eGFP는 또한 그것의 생물학적 활성 (17)을 유지합니다. 태그가 지정되지 않은 단백질에 상응하는 반응을 유도 할 수있는 태그 리간드의 능​​력은 결론입니다 b 형광 리간드...

초기 배아 발달 동안 세포가 점진적 분화의 특정 계통을 따라 약속 :이 전능성 (또는 다 능성) 하나의 세포 유형을 야기하도록 결정된 선조 세포의 개체수를 구축을 점차 제한 될 셀들의 그룹을 의미한다. 세포 - 세포 신호 배아 개발하는 동안 혈통 사양의 규제의 핵심입니다. 이러한 신호의 조작은 새로운 의학적 치료를 지원하기 위해 특정 운명 향해 줄기 세포를 지향 시키도록 요구 될 것이다. 신호 전달 경로의 상대적으로 적은 수의 TGF 상과 (nodals 및 BMPs에) 1-2 FGFs 3 Wnts 4 및 5에 대응 고슴도치 경로를 포함하여 개발하는 동안 반복된다. 이들 분비 단백질함으로써 유전자 발현 및 / 또는 세포의 행동을 변경하는 신호 전달을 활성화하는 세포막에 존재하는 수용체에 결합한다. 세포 기호의 꽉 규제Alling은 세포 혈통 사양과 정상적인 발전을 위해 필수적이다. 이들 경로들 사이의 크로스 토크는 세포의 운명을 결정하는 것도 중요하지만, 하나의 리간드는 그 자체가 다른 농도에서 별개의 응답을 이끌어 낼 수있다. Morphogen 구배는 세포 유형 세포 (6)의 필드에서 파생 할 수있는 방법 다른 설명하는 이론으로 100 년 전에 설명했다. 셀들의 하나의 그룹에 의해 생성 된 분자를 시그널링하는 것은 소스로부터 더 먼 거리와 농도의 감소, 특정 범위를 통해 확산 될 수있다. 신호에 노출 된 세포는 별개의 위치에 세포 신호의 상이한 레벨로 상이하게 응답하여, 전지의 분야에서 자신의 위치에 국소 농도에 반응 할 것이다. morphogens의 존재에 대한 증거는 초기 초파리 배아 7 및 8 날개 디스크뿐만 아니라 척추 사지 9 신경관 (10)의 연구로부터 온다. 방법은의에 필요설립 방법 morphogen 그라디언트 vestigate 이러한 구배를 조절에서 중요한 다른 분자를 식별 할 수 있습니다. 다른 유전 적 배경의 맥락에서, 생체 내에서 내인성 단백질을 가시화하기 위해 면역 조직 화학을 사용하여 우아한 실험 morphogen 구배 11-12을 조사하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 좋은 항체 및 특정 돌연변이는 항상 사용할 수 없으며, 그래서 우리는 대안 외래 유전자 산물이 세포의 필드에 걸쳐 리간드의 분포에 영향을 미칠 수있는 방법을 절개하는 간단한 방법을 제공하는데, 제노 푸스에서 형광성 리간드의 과발현을 사용하여 여기 프로토콜을 설명한다. Xenopus의 laevis의은 초기 단계에 액세스 할 수 있도록 자신의 태아가 외부 개발로 실험 이러한 유형의를 수행 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 그들은 (아직도 약 20 상대적으로 큰만큼 그들의 큰 크기 (지름 1-1.5mm)는 미세 주입 및 수술 조작을 단순화하고 포배는 단계적으로 세포 이미지에 쉽게81)에 걸쳐 미터. Xenopus의에서 과발현 연구 할 간단하다 : 초기 배아에 주입 mRNA의 특정 세포를 타겟으로 할 수 있고, 효율적으로 변환됩니다. 찬란 태그 Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP는 구조가 PCS2 Wnt8a-HA (13), PCS2 Wnt11b-HA (14)와 eGFP는을 사용하여 생성되었다. HA 펩타이드는 유전자 산물 모두 작동하도록의 Wnt 및 eGFP는 단백질을 분리하는 스페이서의 역할을하는 것으로 생각되기 때문에 추가적인 분자 태그를 제공 할뿐만 아니라,하지만을 포함하는 것이 중요하다. 쉬의 시각화에 사용 구조체 이전 쉬-eGFP는 융합 단백질 (15)을 발현 트랜스 제닉 마우스를 생성하는 데 사용되었다; 이것은 친절 앤디 맥마흔에 의해 제공되었다. 중요하게는, 모든 구조에 대한 GFP 태그가 처리 후에도 유지되도록 신호 서열에 3 &#39;복제된다. 그것은 최종 단백질 변형에 필요한 서열, 예컨대 additio 포함되어 있는지 확인하는 것도 중요같은 지질의 N은 합성의 mRNA의 prodution에 최적화되어 PCS2 + 발현 벡터에 서브 클로닝 하였다 쉬와의 Wnt ligands.The 된 cDNA의 경우입니다; 그것은 SP6 프로모터 및 폴리아 데 닐화 신호 (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors)를 포함한다. 여기에 설명 된 작업은 분비와 형광의 확산을 비교하기위한 간단한 프로토콜의 Wnt 및 쉬가 리간드 태그 태그 제공합니다. 합성의 mRNA의 정의 양을 주입하여, 프로토콜은 서로 다른 프로모터를 사용하여 다른 벡터로부터 변수 표현과 관련된 모든 문제를 주항. 이러한 방법은 최근에 쉬-eGFP는과 Wnt8a / Xenopus의 16 ~ 17에서 Wnt11b-HA-eGFP는 분비 및 확산에 헤파 란 황산 endosulfatase Sulf1의 효과를 조사하기 위해 적용되었다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Ambion</td><td>From Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>중탄산</td><td>염 VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>질산칼슘</td><td>시그마</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>캡 아날로그(m7G(5'))Applied</td> <td>Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인 염산염 일수화물</td><td>시그마</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>시그마</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>피지 이미지 J 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>무료 다운로드 http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립, No.1.5&nbsp;</td><td>과학 실험실 용품</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유리 바늘 끌어당기는 사람</td><td>Narishige Narishige</td><td>PC -10</td><td></td></tr><tr><td>유리 당겨 바늘</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>인간 만성 성선 자극 호르몬 (HCG)</td> <td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>염화 리튬 (LiCl)</td> <td>시그마</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 및 Zen 소프트웨어 (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab 소프트웨어</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>분자 등급 물&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>네일 바니시&nbsp;</td><td>부츠</td><td>바코드 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (55mm)</td> <td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>페놀 클로로포름</td><td>시그마</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>포토샵 소프트웨어</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>고충실도 DNA 중합 효소 및 버퍼&nbsp;</td><td>바이오랩</td><td>M0530S&nbsp; 버퍼 - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>PVC 절연 테이프</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>젤 추출 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소 완충액</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT 완충액 세트 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free DNAse</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>스틸 백 싱글 에지 블레이드</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td></td><td></td><td>홈메이드</td></tr><tr><td>Zen lite 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>무료 다운로드&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 wnt 및 쉬 morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

이 프로토콜은 세포의 필드 분산 리간드를 시각화하는 방법을 설명한다. 함께 초기 배아에서의 세포의 큰 크기, 외래 단백질을 발현의 용이성, 제노 푸스는 GFP - 태그 리간드를 시각화하는 유용한 모델을 laevis의합니다. 합성 mRNA를 효과적으로 초기 Xenopus의 배아 내로 주입 한 후 변환되고, 주사는 단일 세포를 타겟으로 할 수있다. 이러한 막 닿는 RFP 같은 혈통 추적과 함께 사용하면 과잉 발현 된 단백질을 생산하고 주입 된 세포 (및 그 자손이) 쉽게 따라 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산을위한 방법의 형광 주입의 mRNA에서의 Wnt 및 쉬 리간드 태그에 대해 설명합니다. 방법은 마일을 포함외배엽 외식 (동물 모자)와 여러 샘플 리간드 확산의 분석 CRO의 해부. 공 초점 영상을 사용하여, 세포의 필드 위에 리간드 분비 및 확산에 관한 정보를 얻을 수있다. 공 초점 이미지의 통계적인 분석은 리간드 구배의 형상 정량적 데이터를 제공한다. 이들 방법은 morphogen 그라디언트의 형상을 조절할 수있는 요소의 효과를 테스트 할 연구에 유용 할 수있다.

형광 태그로 단백질을 발현하는 동물 캡 이식편의 촛점 분석은 다양한 실험 조건 하에서 리간드 분포를 시각화하기위한 효과적인 시스템을 제공한다. 일 예에서, GFP의 분포는 쉬 (도 1)를 나타낸다 태그. 2- 세포 단계에서 Xenopus의 배아 제어의 mRNA 또는 mRNA를 Sulf1, 세포 표면 헤파 란 황산 수정 및 쉬 morphogen 구배 16 영향을 미치는 효소의 코딩 중 하나와 모두 세포 내로 주입된다. 이 배아는 32 세포 단계까지 배양 및 단일 세포 공동 주입의 mRNA가 (혈통 추적 등) 쉬-GFP 및 memRFP에 대한 코딩입니다. 이것은 세포막 닿는 RFP로 표시됩니다 쉬-GFP를 발현하는 세포의 복제를 만듭니다. 포배 단계에서, 동물 모자 외식은 공 초점 현미경으로 분석을 수행한다. 그림 1 제어 조건 하에서, 쉬-GFP가 분비되는 것을 보여주고 다시 외부 확산기온이 주입 된 mRNA를 발현. 그러나 Sulf...

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

본 방법론의 전반적인 목표는 *Xenopus laevis*에서의 발현을 통해 온전한 상피 조직 내에서 형광 표지된 리간드의 분비와 확산을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 초기 배아 발달 과정 중 세포 계통의 지정에 필수적인 것으로 알려진 형태발생 기울기의 형성に関する 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 상피 내에서 리간드 분포를 시각화할 수 있는 간단한 방법이라는 점입니다.본 프로토콜의 핵심 부분은 형광 태그가 부착되어 있음에도 불구하고 정상적으로 가공 및 분비되어 수용 세포에서 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 리간드를 생성하는 것입니다. 공초점 현미경은 독립적인 레이저와 검출기를 사용하여 3차원 조직 내 형광 태그 단백질의 국소화를 연구하기에 이상적인 방법이며, 이를 통해 이러한 복잡한 조직 유형 내에서 정밀한 분석과 강력한 데이터 수집이 가능합니다. 서면 프로토콜에 따라 형광 태그 리간드를 위한 mRNA 코팅을 생성하고 XUS lavis 배아를 확보한 후, 필요에 따라 membrane RFP와 같은 계보 추적자와 함께 mRNA를 16~32 세포 단계의 단일 세포에 주입하십시오. 조절제의 효과를 분석하려면 형광 리간드 및 계보 마커와 함께 조절제를 공동 주입할 수 있습니다.때로는 인접한 세포에 함께 주입하는 것이 유용할 수 있습니다. 여기서는 이전에 주입한 세포의 옆에 있는 두 번째 세포에 주입을 수행합니다. 한 세포에는 GFP 태그가 붙은 리간드와 막 RFP와 같은 계보 추적자를 코딩하는 mRNA를 주입하고, 다른 세포에는 모듈레이터와 막 cerulean과 같은 다른 계보 추적자를 코딩하는 mRNA를 주입합니다. 배아를 12.5 °C 인큐베이터로 옮겨 새로운 컵에서 배양합니다. 다음 날, 배아가 8단계에 도달하면 1% agarose가 코팅된 접시에 NAM 2를 채우고 텅스텐 바늘을 이용한 컷오프 유리 피펫을 사용하여 배아를 옮깁니다.주입된 배아와 대조군 배아의 동물극에서 원형의 외배엽을 박리하되, 중배엽이 포함되지 않도록 주의하십시오. 동물 외배엽을 1% agarose로 코팅된 55mm 페트리 접시에 옮기고, 형광 단백질이 성숙하여 릴리프(relief)를 생성할 수 있도록 배아를 4시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 준비하기 위해 현미경 슬라이드 위에 PVC 절연 테이프를 두 겹으로 붙여 완전히 평평하게 누릅니다.동물 캡 고정을 위해 테이프를 14 by

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

여기서, 배아의 고정, 면역 염색 및 절편화를 위해 최적화된 단계별 프로토콜이 제공되어 마우스 조직에서 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 특수한 신호전달 필로포디아(filopodia)를 검출한다.

사이토네메 분석을 위한 배아 마우스 조직의 고정

Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다.   이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

학습하세요 공 촛점 현미경을 사용하여 Xenopus laevis 상피 조직에서 형광 표지 리간드의 분비와 확산을 시각화하는 방법을. 이 기술은 형태 발생 그라디언트 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

공 촛점 분석을 사용하여

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