공 촛점 분석을 사용하여

본 방법론의 전반적인 목표는 *Xenopus laevis*에서의 발현을 통해 온전한 상피 조직 내에서 형광 표지된 리간드의 분비와 확산을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 초기 배아 발달 과정 중 세포 계통의 지정에 필수적인 것으로 알려진 형태발생 기울기의 형성に関する 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 상피 내에서 리간드 분포를 시각화할 수 있는 간단한 방법이라는 점입니다.

본 프로토콜의 핵심 부분은 형광 태그가 부착되어 있음에도 불구하고 정상적으로 가공 및 분비되어 수용 세포에서 반응을 유도할 수 있는 생물학적 활성 리간드를 생성하는 것입니다. 공초점 현미경은 독립적인 레이저와 검출기를 사용하여 3차원 조직 내 형광 태그 단백질의 국소화를 연구하기에 이상적인 방법이며, 이를 통해 이러한 복잡한 조직 유형 내에서 정밀한 분석과 강력한 데이터 수집이 가능합니다. 서면 프로토콜에 따라 형광 태그 리간드를 위한 mRNA 코팅을 생성하고 XUS lavis 배아를 확보한 후, 필요에 따라 membrane RFP와 같은 계보 추적자와 함께 mRNA를 16~32 세포 단계의 단일 세포에 주입하십시오. 조절제의 효과를 분석하려면 형광 리간드 및 계보 마커와 함께 조절제를 공동 주입할 수 있습니다.

때로는 인접한 세포에 함께 주입하는 것이 유용할 수 있습니다. 여기서는 이전에 주입한 세포의 옆에 있는 두 번째 세포에 주입을 수행합니다. 한 세포에는 GFP 태그가 붙은 리간드와 막 RFP와 같은 계보 추적자를 코딩하는 mRNA를 주입하고, 다른 세포에는 모듈레이터와 막 cerulean과 같은 다른 계보 추적자를 코딩하는 mRNA를 주입합니다. 배아를 12.5 °C 인큐베이터로 옮겨 새로운 컵에서 배양합니다. 다음 날, 배아가 8단계에 도달하면 1% agarose가 코팅된 접시에 NAM 2를 채우고 텅스텐 바늘을 이용한 컷오프 유리 피펫을 사용하여 배아를 옮깁니다.

주입된 배아와 대조군 배아의 동물극에서 원형의 외배엽을 박리하되, 중배엽이 포함되지 않도록 주의하십시오. 동물 외배엽을 1% agarose로 코팅된 55mm 페트리 접시에 옮기고, 형광 단백질이 성숙하여 릴리프(relief)를 생성할 수 있도록 배아를 4시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 준비하기 위해 현미경 슬라이드 위에 PVC 절연 테이프를 두 겹으로 붙여 완전히 평평하게 누릅니다.

동물 캡 고정을 위해 테이프를 14 by 10 밀리미터 크기의 직사각형으로 자릅니다. 다음으로, 릴리프 슬라이드에 NM 2를 두 개의 별개 방울로 피펫팅합니다. 그런 다음 절단된 P 20 팁을 사용하여 각 슬라이드에 최대 15개의 동물 설명편을 옮기고, 포셉을 사용하여 X 설명편의 정단면이 위를 향하도록 배치합니다.

다이아몬드 펜으로 유리 커버슬립에 흠집을 낸 후 이를 깨뜨려 더 작은 크기의 커버슬립을 만듭니다. 굽힌 19 gauge 바늘을 사용하여 유리 커버슬립을 릴리프 슬라이드 위에 조심스럽게 내려놓아 슬라이드에 맞춥니다. 이를 통해 동물 캡 세포의 정단층을 압착합니다.

매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉한 뒤 어두운 곳에서 20분 동안 건조시키고 4~6시간 이내에 이미징합니다. 건강한 동물 캡(animal caps) 상태를 유지하려면, 전용 슬라이드와 커버슬립 내에서 동물 캡의 방향을 정확하게 맞추어야 합니다. 슬라이드에 조심스럽게 로딩하십시오.

슬라이드를 밀봉할 때 매니큐어를 너무 많이 사용하지 않는 것이 매우 중요합니다. 매니큐어를 과하게 사용하면 테이프에 주름이 생겨 나중에 슬라이드의 밀봉이 깨질 수 있기 때문입니다. 이 기술에 숙달되면, 관심 있는 조건당 20개의 양질의 동물 극(animal caps)을 얻기 위해 약 25개의 배아를 주입해야 합니다. 이렇게 얻은 샘플들은 다음 날 공초점 현미경으로 분석할 수 있습니다.

이미징을 수행하려면 저배율 대물렌즈를 사용하여 X explan을 찾으십시오. 그 후, 더 높은 해상도의 이미징을 위해 63 x 1.4 오일 대물렌즈로 전환하십시오. MIAN을 위한 405, GFP를 위한 488, 그리고 561을 포함하여 필요한 레이저를 켜십시오.

MRFP의 경우, 모든 형광체가 검출될 수 있도록 레이저 출력을 최적화하십시오. 전압과 이득(gain)의 요구량을 최소화하면서 32 검출기 어레이를 사용한 다음, Lambda 모드를 선택하고 405 nanometers, 488 및 561 nanometer 레이저를 선택하십시오. 더 넓은 시야를 확보하기 위해 이미지 배율을 0.6 x로 축소하십시오.

다음으로, 프레임 크기를 원하는 이미지 크기로 설정하십시오. 이는 분석을 위한 충분한 해상도를 제공하며, 신호 대 잡음비를 높이기 위해 평균값을 4에서 8회로 설정하고 이 데이터 세트에 맞게 핀홀을 최적화합니다. 405, 488, 561nm 레이저를 사용하였으며, 561nm 레이저 기준 1 airy unit을 사용하였습니다.

Diic 거울은 membrane Saru, GFP 및 membrane RFP에서 방출되는 빛을 수집합니다. 본 실험에서는 415에서 720nm 사이의 범위를 약 10nm 간격으로 수집하였습니다. 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 분석을 수행하십시오. 대조군 조건의 동물 캡 X 설명에서 GFP가 태그된 sonic hedgehog의 분포를 보여줍니다. sonic hedgehog GFP는 분비되어 주입된 mRNA를 발현하는 영역 외부로 확산됩니다.

하지만 조절자인 SULF1이 존재할 때, Sonic Hedgehog GFP의 분포는 더 제한적입니다. 이 샘플에서는 이를 생성하는 세포 클론에서 짧은 거리 내에 소수의 Sonic Hedgehog GFP 포커스만 관찰할 수 있습니다. 이 그림은 여기에 표시된 대로 세포에 주입된 두 가지 형광 표지 Wnt 리간드의 특성 분석을 보여줍니다. Wnt8A와 Wnt11B-HAE-GFP 모두 동물극 캡 세포의 막에 축적되며, Wnt8A-HAE-GFP가 Wnt11B보다 더 효율적으로 축적됩니다. 이 그림은 막 결합 Cerulean으로 표시된 세포 클론에서 발현된 Wnt8A-HAE-GFP의 분포를 보여줍니다.

형광 표지된 리간드가 소스 세포로부터 확산되어 상피의 주변 세포로 이동하는 것이 관찰됩니다. 여기에서 보여주는 바와 같이, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 여러 실험 샘플에서 형광 표지된 wind 리간드의 분포 데이터를 추출합니다. mem Saru 발현 클론으로부터의 거리와 GFP 형광 수준을 측정하여 wind 확산 범위와 구배의 형태를 결정합니다.

리간드의 분포를 측정한 후, 이 프로토콜을 다른 분석법과 결합하여 수신 세포의 반응을 모니터링함으로써 신호 전달 경로의 출력을 평가할 수도 있습니다. 이러한 방식을 통해 모포젠(morphogen)의 임계 범위(threshold range)를 결정할 수 있습니다.