세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

이 절차의 전반적인 목표는 일본뇌염 바이러스와 같이 게놈이 세포 mRNA와 동일한 극성을 가진 양성 가닥 RNA 바이러스의 클론 cDNA로부터 감염성 바이러스 입자를 복구하는 것입니다. 이러한 cDNA 기반의 역유전학은 바이러스 게놈 RNA를 직접 조작할 수 있게 하여, 바이러스 복제 및 병원성에 관한 분자 및 유전학적 연구를 위한 재조합 바이러스를 생성할 수 있게 하는 핵심적인 방법입니다. 또한 이 기술은 외래 유전자 전달을 위한 유전적으로 정의된 백시니아 바이러스 벡터 개발을 가능하게 하는 가치 있는 플랫폼을 제공합니다.

이 방법들은 음성 또는 양성 균주, RNA 바이러스, 특히 게놈 크기가 10 kb보다 큰 바이러스의 전장 cDNA 클로닝에 적용 가능합니다. 실험 과정의 시연은 본 연구실의 연구원인 윤상임, 박사후 연구원 송병학 및 김진경, 그리고 학부생 조던 프랭크(Jordan Frank)가 수행할 예정입니다.

본 출판물의 비디오 부분에서는 관심 서열을 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC)의 제작, 백-플라스미드(back plasmid)로부터 전사된 RNA의 합성, 그리고 RNA의 감염력 및 바이러스 수득률 측정 방법을 다룹니다. BAC 플라스미드를 생성하기 전에 사용된 모든 절차는 텍스트 프로토콜에 매우 상세히 제공되어 있습니다. 본 절차를 위해, 먼저 BAC 플라스미드를 보유한 E. coli DH10B의 단일 콜로니를 클로람페니콜이 함유된 3mL의 2X YT 배지에서 배양합니다. 배양액을 35°C에서 225~250 RPM으로 흔들어주며 10시간 동안 배양합니다.

10시간 후에 배양 규모를 확대합니다. 그런 다음 500 µL의 배양액을 500 mL의 배지에 접종하고, 강하게 흔들어주며 6시간 동안 접종균을 배양합니다. 6시간 후, 세균 배양액을 250 mL 병 2개에 나누어 4 °C에서 3,100 g로 15분간 원심분리합니다. 그런 다음 각 펠렛을 30 mL의 GTE 용액에 재현탁합니다.

라이소자임 500 µL를 첨가하고 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그동안 다음 단계를 위해 신선한 용해 용액(lysis solution)을 준비합니다. 10분 후, 용해 용액 60 mL를 첨가하고 용액이 투명해질 때까지 소용돌이 방식으로 섞어줍니다.

실온에서 10분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 각 병에 중화액 45 milliliters를 넣고 충분히 섞일 때까지 병을 뒤집어 줍니다. 그 후 10분 동안 얼음에 보관합니다.

고속 냉장 원심분리를 통해 중화된 용해물을 수집합니다. 그 다음 상층액을 두 개의 새로운 250 mL 병에 수집합니다. 각 병에 0.6 부피의 100% isopropanol을 첨가하고 20분 동안 얼음 위에 둡니다.

다음으로, 침전물을 원심 분리하여 가라앉힌 후 상층액을 제거하고 펠렛을 5 mL의 TE 완충액에 녹입니다. 두 부피의 용액을 하나의 50 mL 튜브에 합치고, 동일한 부피의 5 M 염화리튬을 첨가한 후 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양하여 RNA를 침전시킵니다. 20분간 저온 원심 분리를 수행하여 RNA 침전물을 수집합니다.

그런 다음 상층액을 새로운 250 milliliter 튜브로 옮기고, 2 volumes의 100% isopropanol을 첨가한 후 DNA 침전물이 형성되도록 튜브를 얼음에 둡니다. 20분 후에 침전물을 원심 분리하고, 상층액을 흡입하여 제거한 다음, DNA 펠렛을 9.5 milliliters의 TE buffer에 재현탁시키고 DNA 용액을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.

에티듐 브로마이드가 포함된 염화 세슘 농도 구배를 설정하여 준비 과정을 계속합니다. 18게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 혼합물을 밀봉 가능한 폴리프로필렌 튜브에 넣고 튜브를 밀봉합니다. 밀봉된 튜브를 초원심분리기에서 하룻밤 동안 회전시켜 염화 세슘 농도 구배를 형성합니다.

다음 날, 세슘 클로라이드 농도 구배에서 BAC 플라스미드의 DNA 밴드를 수집합니다. 18게이지 바늘을 사용하여 농도 구배 상단에 공기 배출구를 만들고, 20게이지 바늘과 주사기를 사용하여 농도 구배 측면에서 BAC DNA를 수집한 후, 수집물을 1.7 밀리리터 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 세척 과정을 수행하기 위해 2.5배 부피의 포화 부탄올 수용액을 첨가하고 일반적인 볼텍싱으로 혼합합니다.

그런 다음 혼합물을 상온에서 원심분리하고 하층의 수성상을 새로운 1.7 milliliter 마이크로 튜브로 옮깁니다. 모든 에티듐 브로마이드를 제거하기 위해 이 세척 과정을 총 6회 반복합니다. 이제 BAC DNA를 침전시킵니다. 튜브에 3 molar 아세트산 나트륨을 부피의 1/10만큼, 100% 에탄올을 2.5배 부피로 첨가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 침전물을 상온에서 원심분리하고 1 milliliter의 70% 에탄올로 DNA 펠렛을 세척합니다. 원심분리를 반복하여 펠렛을 다시 수집합니다. 마지막으로 펠렛 형태의 DNA를 10분 동안 공기 건조시킨 후 200 microliters의 TE 버퍼로 용출합니다.

총 부피 100 µL에서 Xba-one을 사용하여 BAC 플라스미드의 대규모 제한 효소 절단을 시작합니다. 이 절단 반응을 37 °C에서 12~15시간 동안 수행합니다. 그 다음, 25 units의 mung-bean nuclease를 추가하여 30 °C에서 2시간 동안 추가로 배양합니다.

배양 후, 증류수를 사용하여 부피를 300 µL로 맞춥니다. 이제 희석된 샘플에 동일한 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올을 첨가하고, 1분 동안 강하게 볼텍싱하며, 튜브를 원심 분리한 뒤 상층액인 수층을 새 튜브로 옮겨 페놀 추출을 수행합니다.

그런 다음 클로로포름으로 추출 과정을 반복합니다. 다음으로, 에탄올 침전을 통해 선형화된 BAC DNA를 회수합니다. 원심분리로 DNA 펠렛을 수집하고, 상층액은 버린 후 1mL의 70% 에탄올로 펠렛을 세척합니다. 원심분리 단계를 반복하고 펠렛을 공기 중에서 건조합니다. 10분간 건조한 후, DNA 펠렛을 30µL의 증류수에 용해합니다. 그런 다음 회수된 BAC 1µL를 0.8% 아가로스 겔에서 확인합니다.

다음으로, RNA 정량을 위해 tritium 표지 UTP를 포함하여 선형화된 BAC DNA의 25 µL runoff transcription을 설정합니다. 37 °C에서 1시간 동안 반응을 수행합니다. 그런 다음 0.6% agarose 젤에서 runoff transcription 반응액 1~2 µL를 확인합니다.

디시당 300만 개의 세포를 분주하여 150mm 디시에서 24시간 동안 배양한 BHK-21 세포로 시작합니다. 세포 단층을 차가운 용액 A로 헹군 후, 트립신 처리를 통해 세포를 분리합니다. 270 g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.

그 다음 세포를 50 milliliters의 차가운 용액 A에 재현탁하고 다시 원심 분리합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다. 마지막 세척 후, 세포를 용액 A에서 ml당 20 million의 농도로 재현탁합니다. 이어서 세포 현탁액 400 microliter 분취액을 2 millimeter 큐벳에서 2 micrograms의 합성 RNA와 혼합합니다.

최적의 조건에서 혼합물을 즉시 전기천공하고 세포를 10분 동안 휴지시킵니다. 그 후, 600 µL의 완전 배지가 들어 있는 마이크로원심분리관으로 세포를 옮깁니다. 이제 전기천공된 세포를 1 mL 부피로 10배 연속 희석하여 준비합니다. 각 희석액 100 µL를 정상 BHK21 세포 단층 위에 분주합니다. 4~6시간 동안 배양한 후, FBS가 첨가된 MEM 내 0.5% agarose를 세포 위에 덮고 4일 더 배양합니다.

BHK21 세포를 모의 전기천공하거나, 전체 길이의 JEV-BAC의 독립된 두 클론에서 유래한 RNA 전사체를 전기천공하였습니다. 4일 후, 세포 내의 감염성 RNA를 관찰하기 위해 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였습니다. 이 염색법을 사용하여 감염 중심(infectious centers)의 수를 정량화하였습니다. 다음으로, 전기천공 후 20시간이 지난 RNA 전기천공 세포에서 anti-NS-one 토끼 항혈청과 적색으로 표시된 Cy3-결합 2차 항체를 사용하여 바이러스 단백질 발현을 조사하였습니다. 핵은 청색으로 표시된 DAPI로 대조 염색하였습니다. 이후 전기천공 22시간 및 40시간 후에, RNA 전기천공 세포의 배양 상층액에 축적된 감염성 비리온의 생성량을 플라크 분석법으로 조사하였습니다.

이 영상을 시청한 후, 일본뇌염 바이러스와 같은 양성 균주의 클론 cDNA, RNA로부터 감염성 바이러스를 완전히 복구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 일본뇌염 바이러스 및 기타 인체 병원성 미생물을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하기 전에는 적절한 생물안전 교육이 반드시 필요합니다.