세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

이 절차의 전반적인 목표는 일본뇌염 바이러스와 같이 게놈이 세포 Mr.NA 와 동일한 극성에 있는 양성 가닥의 복제된 CDNA, RNA 바이러스로 완전히 만들어진 감염성 바이러스 입자를 구출하는 것입니다. 이 CNA 기반 regene genetics는 바이러스 게놈 RNA를 직접 조작할 수 있는 semial 방법으로, 바이러스 복제 및 발병기전에서 분자 및 유전 연구를 위한 재조합 바이러스를 생성합니다. 이 기술은 또한 외래 유전자 전달을 위해 유전적으로 정의된 백신 및 바이러스 벡터를 개발할 수 있는 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

이 vessels는 길이 또는 양성 균주, RNA 바이러스, 특히 10kb보다 큰 게놈을 가진 바이러스에 대한 전체 길이 CDNA를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다. 제 연구실 연구 조교수인 San Nun 교수와 박사 후 연구원인 UNG 및 Xing y Kim, 그리고 학부생인 Jordan Frank의 여러 구성원이 절차를 시연할 것입니다. 이 간행물의 비디오 부분에서는 관심 염기서열을 포함하는 박테리아 인공 염색체의 준비, 후면 플라스미드에서 전사된 RNA의 합성, RNA의 감염성 및 바이러스 수율을 측정하는 방법을 다룹니다.

back plasmid를 생성하기 전에 사용되는 모든 절차는 텍스트 프로토콜에 매우 자세하게 제공됩니다. 이 절차를 위해, 먼저 e coli DH 10 B의 단일 식민지를 성장시키고, 클로람페니콜이 함유된 2개의 XYT 육수 3밀리리터에 백 플라스미드를 운반합니다. 섭씨 35도에서 225-250RPM으로 진탕하면서 섭씨 35도에서 10시간 동안 배양합니다.

10시간 후 배양을 확대한 다음 500마이크로리터의 성장을 500밀리리터의 배지에 접종하고 6시간 후 격렬하게 흔들면서 6시간 동안 접종물을 배양합니다. 2,250밀리리터 병에 담긴 박테리아 배양을 섭씨 3, 100G에서 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 각 펠릿을 30ml의 GTE 용액에 재현탁합니다.

라이소자임 500마이크로리터를 넣고 얼음 위에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 그 동안 다음 단계를 위해 새로운 용해 용액을 준비합니다. 10분 후 용해액 60ml를 넣고 용액이 투명해질 때까지 휘젓면서 섞습니다.

반응을 실온에서 10분 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 각 병에 45ml의 중화 용액을 넣고 완전히 혼합될 때까지 병을 뒤집습니다. 그런 다음 10분 동안 얼음 위에 올려 놓습니다.

High G 냉장 원심분리로 중화된 용해물을 수집합니다. 그런 다음 상층액을 250ml의 새 병 2개에 모읍니다. 각각 0.6 부피의 100 % 이소프로판올을 넣고 20 분 동안 얼음에 넣으십시오.

다음으로, 침전물을 스핀 다운시킨 다음 상등액을 버리고 펠릿을 5 밀리리터의 TE 완충액에 용해시킵니다. 단일 50 밀리리터 튜브에 두 부피를 결합하고 동일한 부피의 5 몰 염화 리튬을 첨가하고 혼합물을 얼음에서 10 분 동안 배양하여 RNA를 침전시킵니다. 20분 저온 원심분리를 사용하여 RNA 침전물을 수집합니다.

그런 다음 상등액을 새 250ml 튜브로 옮깁니다. 100% 이소프로판올 두 부피를 넣고 튜브를 얼음 위에 올려 DNA 침전물이 형성되도록 합니다. 20분 후, 침전물을 스핀다운하고, 상층액을 흡인하고, DNA 펠릿을 9.5ml의 TE 완충액에 재현탁하고, DNA 용액을 50ml 튜브로 옮깁니다.

th dium bromide로 염화 세슘 구배를 설정하여 준비를 계속합니다. 18 게이지 바늘이 있는 주사기를 사용하여 밀봉 가능한 폴리프로필렌 튜브에 혼합물을 넣고 튜브를 밀봉합니다. 초원심분리기에서 밀봉된 튜브를 밤새 돌려 염화세슘 구배를 형성합니다.

다음 날에는 염화세슘 구배(cesium chloride gradient)에서 역 플라스미드(back plasmid)의 DNA 밴드를 수집합니다. 18 게이지 바늘을 사용하여 그라디언트 상단에 통풍구를 만들고 주사기가 있는 20 게이지 바늘을 사용하여 그라디언트 측면에서 뒤쪽 DNA를 수집한 다음 컬렉션을 1.7ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 세척을 수행하고 2.5 부피의 물 포화 부탄올을 넣고 일반 소용돌이와 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 혼합물을 원심분리하고 하부 수성상을 새로운 1.7ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 이 세척을 총 6회 반복하여 브롬화 에티듐을 모두 제거합니다. 이제 뒤쪽 DNA를 침전시킵니다.

튜브에 10분의 1 부피의 3몰 아세트산나트륨과 2.5부피의 100% 에탄올을 추가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 침전물을 원심 분리하고 DNA 펠릿을 1 밀리리터의 70 % 에탄올로 세척합니다.

회전을 반복하고 펠릿을 다시 수집합니다. 마지막으로, 펠릿화된 DNA를 10분 동안 자연 건조하고 200마이크로리터의 TE 완충액에서 ute합니다. xbo를 사용한 back plasmid의 대규모 제한 효소 분해로 시작합니다.

총 부피 100 마이크로 리터 중 하나. 섭씨 37도에서 12-15시간 동안 이 소화를 수행합니다. 다음으로, 추가로 25 단위의 녹두 뉴클레아제를 섭씨 30도에서 2시간 동안 추가로 배양합니다.

배양 후 증류수로 최대 300 마이크로 리터의 부피를 가져옵니다. 이제 희석된 샘플에 동일한 부피의 페놀 클로로포름, 이소 아밀 알코올을 추가하여 페놀 추출을 수행합니다. 1분 동안 격렬하게 소용돌이치고, 튜브를 회전시키고, 상부 수성상을 새로운 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 클로로포름으로 추출을 반복합니다. 다음으로, 에탄올 침전에 의해 선형화된 백 DNA를 회수합니다. 원심분리로 DNA 펠릿을 수집하고 상등액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올 1밀리리터로 세척합니다.

원심분리 단계를 반복하고 펠릿을 자연 건조시킵니다. 10분 건조 후 DNA 펠릿을 증류수 30마이크로리터에 용해시킵니다. 그런 다음 0.8%AROS 겔에서 회수된 1마이크로리터를 검사합니다.

다음으로, RNA 정량화를 위한 트리티화된 UTP를 포함하여 선형화된 후면 DNA의 25마이크로리터 유출 전사를 설정합니다. 섭씨 37도에서 한 시간 동안 반응을 수행합니다. 그런 다음 0.6%AROS 겔에서 유출 전사 반응의 1 또는 2 마이크로리터를 검사합니다.

BHK 21 세포를 150mm 접시에서 24시간 동안 배양하고 접시당 300만 개의 세포로 시작합니다. 차가운 용액 A로 세포 단층을 헹구고 트립신으로 분리합니다. 화. 270GS에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.

그런 다음 50ml의 차가운 용액 A에 세포를 재현탁시키고 다시 스핀다운합니다. 마지막 세탁 후 이 세탁을 세 번 반복합니다. 용액 A.Then 세포 현탁액의 400 마이크로 리터 분취액을 2 밀리미터의 정제액에서 2 마이크로 그램의 합성 RNA와 혼합

즉시 최적의 조건에서 혼합물을 전기 정제하고 세포를 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 600마이크로리터의 완전한 배양 배지가 들어 있는 마이크로 퍼지 튜브로 세포를 옮깁니다. 이제 4-6시간의 배양 후 정상 bhk 21 세포의 단층에 각 희석액의 100마이크로리터 분취액을 1밀리리터 용량으로 전기천공된 세포의 10배 연속 희석을 준비하고, MEM과 FBS에 0.5%aros를 겹쳐서 4일 더 배양합니다.

Bhk 21 세포는 전장 JEV의 두 개의 독립적인 클론에서 유래한 RNA 전사체로 모의 전기천공 또는 전기천공을 실시했습니다.4일 후, 세포의 감염성 RNA를 보기 위해 세포를 크리스털 바이올렛으로 염색했습니다. 이 염색을 사용하여 감염 센터를 정량화했습니다. 다음으로 transfection 20시간 후 RNA 전기천공 세포에서 anti NS, rabbit antis serum 1개 및 빨간색으로 보이는 SI 3개의 복합 2차 항체를 사용하여 바이러스 단백질 발현을 검사했습니다.

핵은 파란색으로 보이는 DAPI로 대조염색되었습니다. 나중에 transfection 후 22시간 및 40시간이 지나면 감염성 varian의 생성이 배양에 축적되었습니다. RNA 전기천공된 세포의 상등액을 플라크 분석법으로 검사하였다.

이 비디오를 시청한 후에는 일본뇌염 바이러스와 같은 양성 균주인 RNA의 복제된 CNA에서 감염성 바이러스를 완전히 구출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 따라서 일본뇌염 바이러스 및 기타 인간 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하기 전에 적절한 생물 안전성 교육이 필요합니다.