Name: 세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 배우세요 세균 인공 염색체(BAC)를 이용하여 일본 뇌염 바이러스(JEV)의 전장 cDNA에서 감염성 바이러스 입자를 구출하는 방법을. 이 기술은 양성 가닥 RNA 바이러스의 유전체학 연구와 유전자 정의 백신 개발에 활용됩니다.

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저자는 YML을 지원하기 위한 유타 과학기술연구기금과 SIY를 지원하기 위한 한국연구재단 보조금(2009-0069679 및 2010-0010154)에 감사를 표합니다. 이 연구는 유타 주립 대학의 유타 농업 실험소(Utah Agricultural Experiment Station)의 지원을 받았으며 저널 논문 번호 UAES #8753으로 승인되었습니다. 또한 저자는 편집 도움을 준 Deborah McClellan 박사에게 감사를 표합니다.

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언했습니다.

현재의 프로토콜은 성공적으로 두 개의 서로 다른 균주 (CNU / LP2 (27)와 사 (14) -14-2 28) JEV, 그 기능 cDNA를 입증했다 구축 할 본질적으로 어려울 수있는 플라 비 바이러스의과에 대한 전체 길이 감염의 cDNA 클론을 생성하는 데 사용 된 때문에 숙주 세포 독성 및 클로닝 된 cDNA의 유전 적 불안정성 전파 8,74-76을이 프로토콜은 세 개의 주요 구성 요소가 포함됩니다. 고성능 역 전사 효소를 사용하여 바이러스 RNA의 충실한의 cDNA 복사본의 합성 / 증폭을 최대화 먼저 / DNA 중합 효소; 둘째로, 마지막으로 전체 길이의 cDNA 조립 공정 초기에 서브 클로닝 된 cDNA로부터 매우 낮은 카피 수의 벡터에서 BAC (미발표 데이터) 서열을 함유하는 독성 바이러스 E-PRM 코딩 영역 74,77,78 클로닝; 그리고 세 번째, 분명히 더 큰 DNA의 INSE을 용인 120-350킬로바이트, 19-21의 평균 크기의 외래 DNA를 수용 할 수있는 클로닝 벡터의 혈중 알코올 농도를 이용하여보다 RTS는 다른 복제 벡터를 않습니다. 이 복제 방법은 다른 많은 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스, ~ 10 내지 32 KB의 큰 RNA 게놈을 가진 특히 일반적으로 적용 가능할 것이다. 게놈은 숙주 세포 변이가 단백질로 번역되는 바이러스 성 mRNA의 작용 때문에 감염성 cDNA를 클론의 발생은, 특히 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스에 대해, RNA 바이러스에 대한 역 유전학 시스템을 개발에서 중요한 단계이다. 따라서, 바이러스 복제는 감수성 숙주 세포에 유래하는 cDNA 게놈 길이의 RNA 분자의 도입에 의해 개시 될 수있다. 감염성 JEV의 cDNA 클론의 가용성 재조합 DNA 기술과 결합 될 때, 이러한 유전자 발현 73,79과 게놈 복제로서, 분자 수준에서 바이러스 생활주기의 다양한 양상의 이해를 증가 하였다. 63, 64이 또한, 전체 길이의 cDNA 클론 JEV 바이러스 백신은 28과 유전자 전달 벡터의 개발을위한 가치있는 도구임이 입증되었다. &lt;SUP&gt; 80, 81 모든 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스와 같이, 고도로 감염성 RNA를는 시험 관내에서 합성 될 수있는 JEV위한 안정적인 기능의 cDNA를 구축 여러 중요한 단계가있다. 이상적으로, 전체 길이의 cDNA 클론으로부터 전사 된 RNA를 합성의 순서는 바이러스 게놈 RNA 바이러스 RNA 복제의 개시에 필요한 특히 5&#39;- 및 3&#39;- 말단의 서열과 동일해야 . 60-62 현재 프로토콜에서, 인증 된 5&#39;- 및 3&#39;- 말단 마지막 하류를 바이러스 게놈의 제 아데닌 뉴클레오티드 상류의 SP6 프로모터 서열을 배치하고 고유 인공 XbaI으로 I 제한 부위의 위치에 의해 보장 된 각각 바이러스 게놈의 티민 염기. XbaI으로 I-선형화와 MBN 처리 cDNA를 TE의 결선 전사에 의해 생산 된 정통 5 &#39;및 3&#39;끝과 합성 RNA를 출장mplate M (7) G (5 &#39;)를 준비하는 SP6 RNA 중합 효소 PPP (5&#39;) 캡 아날로그를 사용하여. 이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 그것은에없는 경우 시험 관내 전사를 들어, 다른 박테리오파지 RNA 폴리머 라제 (예, T3 또는 T7)이 그것의 잘 정의 된 프로모터 서열과 함께 사용될 수있다. (27)를 결선 부위로서, 다른 제한 사이트를 이용할 수있다 선형화 된 cDNA에서 바이러스 게놈과 경우 합성 RNA는 본격적인 3 &#39;끝으로 끝납니다. 합성 RNA는 그 3 &#39;말단에 서너 바이러스 무관 뉴클레오티드를 포함하는 경우 3&#39;- 말단의 염기 서열의 중요성은 RNA 감염성의 ~ 10 배 감소에 의해 입증되었다. 시험 관내 전사 반응에 (27), 두 M (7) G (5 &#39;) PPP (5&#39;)와 M (7) G (5 &#39;) PPP (5&#39;) G 캡 아날로그 5 바이러스의 후반 장소하지만 관련이없는 여분의 G 염기 상류 잘 동일하게 사용할 수 있습니다 &#39;-end하지만추가 감염 또는 합성 RNA의 복제를 변경하지 않습니다. (27) 또한, DNase의 I 소화에 의해 RNA 전 사체로부터의 cDNA 템플릿의 제거가 RNA의 감염 테스트를 위해 필요하지 않다 cDNA를 템플릿 자체는 감염되지 않기 때문에. (27) BAC 기술은 이제 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스, 즉, 두 JEVs, CNU / LP2 (27)와 사 (14) -14-2 28 (게놈 크기, ~ 11킬로바이트)의 소수에 대한 감염의 cDNA 클론을 구성에 적용되었습니다; 두 뎅기열 바이러스, BR / 90 (26)와 NGC 29 (11 ~ KB); 소 바이러스 성 설사 바이러스, SD1 (12 ~ KB)을 25 개의 전형적인 돼지 열 바이러스, C 및 패더 (12 ~ KB) 24 국경 질환 바이러스, Gifhorn의 (12 ~ KB) 24 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 , PL97-1 / LP1 (15 ~ KB) 30 전염성 위장염 바이러스, PUR46 - MAD (~ 29킬로바이트) 16 고양이 전염성 복막염 바이러스,DF-2 (~ 29킬로바이트) 32 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스, 우르 바니 (30 ~ KB) 9 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스, EMC / 2012 (30 ~ KB), (17)과 인간 코로나 바이러스, OC43 (~ 31킬로바이트) 31의 cDNA 건설 BAC에 사용의 주요 이점은 대형, 1 또는 2 복사본 BAC 플라스미드의 유전 적 안정성이 높은 것이다.; 그러나, 극히 낮은 카피 수의 본질 때문에 BAC DNA의 염색체 DNA를 호스트에 대하여 BAC의 DNA의 순도가 감소 그에 매우 낮은 수율, 또한 큰 단점이다. 현재 프로토콜에서, BAC DNA의 수율은 E. 성장에 의해 극대화 대장균 DH10B는 영양이 풍부한 매체는 2xYT에 / 감염성 BAC의 PBAC와 SA (14) -14-2을 바꾸었다. 이러한 노력에도 불구하고, 평균 수율은 ~ 15 μg의는 2xYT 국물 500ml의에서 BAC의 DNA이다. 또한, BAC DNA의 순도는 정제를 위해 가장 CSCL-EtBr을 밀도 구배 원심 분리를 이용함으로써 달성된다오히려 일반적으로 사용되는 컬럼 기반의 플라스미드 분리보다. 그러나, 명심하는 것이 중요하다 BAC 변환 된 E. 이 복제 된 cDNA의 유전 적 안정성을 위태롭게 할 수 있기 때문에 대장균이 자라다하지 말아야하며, 더 높은 성장이 반드시 더 큰 수익률 또는 더 높은 순도의 BAC DNA로 이어질하지 않습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 JEV에 대한 BAC으로 유 전적으로 안정된 전체 길이 감염의 cDNA 클론의 건설 및 전파를위한 최적화, 효율적이며 능률적 인 방법, 절차는 한 번 실질적으로 불가능하다고 생각. 이 같은 클로닝 전략은 또한 다른 많은 양 가닥 RNA 바이러스에 적용될 수있다. 일반적으로, 감염의 cDNA 클론 바이러스 복제 및 병인에 생물학적 기능을 연구하는 바이러스 RNA 게놈에 돌연변이 (예를 들어, 삭제, 삽입, 및 점 돌연변이)의 다양성을 소개 할 수있게. 이 cDNA를 기반​​ 역 유전학 시스템으로 개발할 수있게하고 TESt 백신 및 특정 관심 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스의 병원성 인자 (들)를 치료 표적 후보. 또한, 이러한 감염성 cDNA의 기술은 또한 생물 의학 연구에 많은 응용 관심 외래 유전자 (들)을 발현 할 수있는 바이러스 벡터로 이용 될 수있다.

RNA 바이러스 학자를 들어, 1970 년대 후반에, 재조합 DNA 기술의 출현은 가능한 다음 RNA 바이러스의 유전 적 조작을위한 박테리아 플라스미드로 전파 될 수의 cDNA 클론 내로 바이러스 RNA 게놈을 변환했다. (1) 제 RNA 바이러스로 복제 분자는 박테리오파지 Qβ, 대장균 감염 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스이다. E.에 도입 할 때 Qβ 게놈 RNA의 전체 cDNA의 복사본을 포함하는 플라스미드 전염성 Qβ 파지 초래했다 대장균. (2) 그 후 곧,이 기술은, 소아마비 바이러스에인가 인간과 동물의 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스 하였다. 폴리오 바이러스 게놈 RNA의 전장 cDNA 베어링 플라스미드 감염성 포유 동물 세포 내로 형질 감염성 비리 온을 생성 할 때 3, 클로닝 된 cDNA는 바이러스 RNA 복제를 개시하는 세포 내에서 전사되어야이 &quot;DNA 발사&quot;접근 방식이다.;전사가 개시되는 방법과 증명서가 올바른 바이러스 서열에 어떻게 처리되는지 그러나 불분명하다. 이러한 문제는 다른 &quot;RNA 발사&quot;의 개발을 주도하고있다 접근법, 바이러스 RNA 게놈의 완전한 cDNA의 사본 E. 인식 프로모터 하에서 복제된다 숙주 세포 내로 도입 될 때 완전한 바이러스 복제 사이클을 겪는다 정의 5 &#39;및 3&#39;말단을 가진 시험관에서 합성 RNA를, 생산 용 대장균 또는 파아지 RNA 폴리머 라제.이 방식 제 성공 브롬 모자이크 바이러스에 대해보고 된 4,5- , 6,7- 식물의 양 가닥 RNA 바이러스. 그 후, RNA 발사 접근법 caliciviruses, alphaviruses, 플라 비 바이러스, arteriviruses 및 코로나 포함한 양성 가닥 RNA 바이러스의 광범위한 개발되었다. 1,4,5,8- DNA- 및 모두에서, FUL의 구성을 역 유전학 시스템 RNA 발사~ 10 L - 길이의 cDNA 클론은 감염성 DNA 또는 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스의 RNA를 생성하는 키이지만 바이러스 게놈 크기가 증가 상당한 기술적 도전. 특히 9-17의 큰 RNA 게놈진다 -32 KB는 전신 기능의 cDNA 클로닝에 세 가지 주요 장애물을 제시한다. RT-PCR의 정확도는 바이러스 성 RNA의 길이에 반비례하므로 18 제 어려움 복사 충실한 cDNA를 합성한다. 긴 RNA 분자는 E. 불안정 플라스미드에서의 cDNA 단편을 제조 할 수있는 예기치 않은 서열을 포함 할 가능성이 있기 때문에 두번째 장애물은 잠재적으로 독성 서열의 존재이다 대장균. 이&gt; 10 KB의 바이러스 cDNA를 삽입을 수용 할 수있는 클로닝 벡터를 발견하기 어렵 기 때문에 셋째, 가장 중요한 이슈는, 적당한 벡터의 유용성이다. 지난 3 년 동안,이 장벽은 효소 학, 방법론, 여러 진보에 의해 극복되었다D의 vectorology. 이들 중 1,4,5,8-는 가장 유망한 혁신 개발은 큰 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스 등 전염성 세균 인공 염색체 (BAC에)의 복제입니다. BAC 벡터는 E.에 기초하여 저 복사 클로닝 플라스미드 (1-2 복사 / 셀) 인 DNA의 평균 삽입 크기를 갖는 대장균 인자 불임, ~ 19-21 120-350 KB DNA 단편은 일반 클로닝 벡터로 클로닝에 유사한 방식으로 BAC 벡터에 삽입된다.; 결과 BAC 클론 E. 많은 세대에 걸쳐 안정적 대장균. 현재까지 22, 23는, BAC 기술은 즉 세 가지 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스 가족, 플라 비비 리다, 24 ~ 29 Arteriviridae, 30 Coronaviridae의&gt; 10 명에 대한 감염의 cDNA 클론을 만드는 데 사용되었다. 9,16,17 , 31, 32 예를 들어 일본 뇌염 바이러스 (JEV)를 사용하여, 본 연구는 일 수 상세한 절차를보고양성 가닥 RNA 바이러스의 다양한 유전자 안정된 전장 감염성 BAC를 구성하는데 사용된다. 발생 JEV가, JEV 감염이 심한 종종 치명적인 신경 질환 일본 뇌염이 발생할 수 있습니다 인간에서 동물 매개 모기 벡터에 의해 조류, 돼지, 그리고 다른 척추 동물의 호스트 사이의 자연에서 전송 플라 비 바이러스 (33). (34, 35)입니다 (JE), (36) ~ 50,000-175,000 임상 경우의 예상 연간 발병률 아시아와 서태평양, 37, 38의 부품. 39, 40 JEV의 게놈 ~ 11 KB, 단일 가닥 긍정적 인 감지 RNA 분자이며 구성 5 &#39;및 3&#39;두 개의 비 코딩 영역 (의 NCR)에 의해 형벌 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 종료된다. 41, 42 ORF가 지정된 10 개별 단백질을 생성하는 호스트 및 바이러스 성 단백질 분해 효소에 의해 분해되는 폴리를 인코딩 C, PRM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 또한 C- 말단 방향에 N-있다. 34,43,44, 전자NS1 (NS1 &#39;)의 xtended 양식 코돈 NS2A의 8-9에 의해 -1 리보솜 frameshifting 표현된다. 이들 11 단백질의 45, 46, 세 개의 구조 단백질 (C, PRM, E는) 감염의 형성에 필수적인 비리, 47, 48 및 나머지 8 비 구조 단백질 (NS5에 NS1 및 NS1 &#39;)는 바이러스 성 RNA 복제, 49-51 입자 어셈블리, 52-56 및 선천성 면역 회피에 대한 중요하다. 57-59 모두 5&#39;3 &#39;의 NCR은 기본 시퀀스 및 바이러스 성 RNA 복제를 조절에 중요한 형태의 RNA 1 차 / 2 차 구조, 60-62을 보존 포함. 63, 64 이 프로토콜은 SA (14) -14-2 전체 길이 JEV의 감염 혈중 알코올 농도를 생성하기위한 도구, 방법 및 전략을 설명합니다. (28)이 기능 BAC 클론은 발기인에 포함되어 JEV 게놈 RNA의 전체 cDNA를 복사, (65)을 포함 SP6의 RNA 중합 효소에 대한 상향바이러스의 5&#39;- 말단 및 체외 런 - 오프 전사 바이러스 3&#39;- 말단의 하류 고유 XbaI으로 I 제한 사이트. 이 기술은 BAC 양성 가닥 RNA 바이러스의 배열에 대해 완전히 기능 분자의 cDNA 클론을 구축에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 분자 클로닝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>방사성</td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 병</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 (낮은 융점)</td><td>생명 기술 (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>새로운 잉글랜드 BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>부탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>발암성</td></tr><tr><td>DE-81 여과지</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균 DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>독성 및 고변이원</td></tr><tr><td>필터 컬럼 (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>자극성</td></tr><tr><td>글루코스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>고화질 DNA 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>이소아밀 알코올</td><td>시그마-알드리치</td><td>I9392</td><td>가연성</td></tr><tr><td>이소프로판올&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>리튬 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 역전사 효소</td><td>라이프 테크놀로지스 (인비트로겐)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>녹두 뉴클레아제</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>생물학적 위험(날카로운 물건 폐기물)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>통합 DNA 기술</td><td>맞춤형 올리고뉴클레오티드 합성</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>페놀(완충</td>액)<td>Life Technologies(Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>독성 및 고부식성</td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:Isoamyl Alcohol</td><td>Life Technologies(Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>독성 및 부식성이 높은</td></tr><tr><td>페놀:Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies(Ambion)</td><td>10296-010</td><td>독성, 부식성, 그리고 자극성</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 아세테이트</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP 세트</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>밀봉 가능한 폴리프로필렌 튜브 (16 &times; 76 mm)& 주의;</td><td>벡크만 쿨터</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>스핀 컬럼 (플라스미드 Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (yeast)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>엑스바이&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. 세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>배양 접시 (150mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>큐벳 (2mm 갭)</td><td>하버드 기기</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>독성 및 발암성</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>비타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose 젤 전기영동 시스템</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td><td></td><td>UVP UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>과학 산업</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

세균 인공 염색체 : rna 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

복제된 cDNA에서 감염성 바이러스를 완전히 구출하는 방법인 역유전학은 게놈이 세포 mRNA와 동일한 극성을 가진 양성 가닥 RNA 바이러스 분야에 혁명을 일으켰습니다. cDNA 기반 역유전학 시스템은 바이러스 게놈 RNA를 직접 조작할 수 있는 독창적인 방법으로, 바이러스 복제 및 발병기전에서 바이러스 RNA 요소와 유전자 산물 모두에 대한 분자 및 유전 연구를 위한 재조합 바이러스를 생성합니다. 또한 외래 유전자 전달을 위해 유전적으로 정의된 백신과 바이러스 벡터를 개발할 수 있는 귀중한 플랫폼을 제공합니다. 그러나 일본뇌염 바이러스(JEV)와 같은 많은 양성 가닥 RNA 바이러스의 경우 복제된 cDNA가 불안정하여 기능적 cDNA의 구성 및 전파에 큰 장애물이 됩니다. 본 보고서에서는 바이러스 RNA 분리, cDNA 합성, cDNA 서브클로닝 및 변형, 전장 cDNA 조립, cDNA 선형화, 시험관 내 등의 일반적인 실험 절차를 사용하여 유전적으로 안정적인 전장 감염성 JEV cDNA를 박테리아 인공 염색체(BAC)로 생성 및 증폭하는 데 있어 전략적 고려 사항을 설명합니다. RNA 합성 및 바이러스 회수. 이 프로토콜은 다양한 양성 가닥 RNA 바이러스, 특히 >10kb 길이의 게놈을 BAC 벡터로 복제하는 데 적용할 수 있는 일반적인 방법론을 제공하며, BAC 벡터에서 감염성 RNA를 박테리오파지 RNA 중합효소로 in vitro에서 전사할 수 있습니다.

모든 포지티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대해, 역 유전학 시스템의 신뢰성 및 효율을 가진 시퀀스 바이러스 성 게놈 RNA의 공통 서열에 해당 클로닝 된 전장 cDNA의 유전 적 안정성에 의존한다. (27)도 1은 5- 도시 JEV SA에 대한 BAC로 전체 길이 감염의 cDNA의 건설을위한 단계 전략 14 -14-2 28 : 1 단계, JEV 감염 BHK-21 세포 (그림 1A)의 세포 배양 상층 액에서 바이러스 RNA의 정화; 2 단계, 전체 바이러스 게놈 (도 1b)에 걸친 네 중첩 된 cDNA 증폭 (F1 내지 F4)의 합성; PBAC / F4 (그림 1C)에 PBAC / F1을 만드는 3 단계, BAC 벡터에 네 개의 연속 된 cDNA 조각의 각각의 서브 클로닝; 4 단계, SP6의 RNA 중합 효소, 즉와 체외 실행 - 오프 전사 복제 된 cDNA의 수정, SP6을 배치프로모터 서열 무음 점 돌연변이를 도입하여 뉴클레오티드 9131에서 기존 내부 XbaI으로 I 사이트를 제거 바이러스 5&#39;- 말단 (PBAC / F1 SP6)의 바로 상류, 9134는 T (PBAC / F3 KO), 그리고 삽입 →을 바이러스 3&#39;- 말단 (PBAC / F4 RO) (그림 1D)의 바로 하류 새로운 인공 XbaI으로 나는 실행 오프 사이트; 그리고 5 단계, 전체 길이의 조립 SA (14) -14-2의 cDNA BAC, PBAC / SA (14) -14-2 (그림 1E). 표이 복제 과정에서 사용되는 올리고 뉴클레오티드 (1) 목록. (28) 기능적 JEV의 cDNA 건설, 제 중요한 단계는 RT-PCR을위한 주형으로 정제 된 바이러스 RNA를 이용하여 네 개의 중첩 된 cDNA 단편을 합성한다. (2)가 있었다 네 RT-PCR 제품에 대한 대표적인 결과를 제공 도표 0.8 %에 전기 영동아가 로스 젤. 이 젤은 전체 길이 JEV cDNA를 네 개의 중첩 된 cDNA 조각으로 증폭되는 것을 명확하게 보여줍니다. 때때로, RT-PCR 반응은 cDNA 합성 때문에 / 증폭시 프라이머의 어닐링 특이성, 예상되는 대부분의 제품보다 작은 하나 이상의 추가의 바이러스 특이 적 또는 비특이적 인 제품을 얻을 수있다. 한편, 거의 또는 전혀는 RT-PCR 산물 때문에 바이러스 RNA 분리 또는 부적절한 RT-PCR 성능 중에 우발적으로 RNase 오염 증폭 될 것이라고 예상. 다음으로 중요한 단계는 partial- 또는 전장 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 비교적 간단한 절차 BAC에 JEV의 cDNA의 클로닝 및 변형 예이다. (69)도 3을 함유하는 BAC 클론의 정제를위한 대표적인 결과를 나타낸다 CSCL-EtBr이 기울기에 밴딩으로 JEV SA (14) -14-2의 전체 길이의 cDNA.이 실험에서, 401,700 × g에서 16 시간 동안 원심 분리 후, 두 개의 별개의 대역, 즉, E. 상기 대장균 염색체 DNA 및 아래 수퍼 코일 BAC 플라스미드 DNA는, 장파 자외선 하에서 관의 중간에서 볼 수있다. 하부의 BAC DNA 밴드의 최소 부피 (~ 400 μL)을 조심스럽게 튜브의 측면에 주사기로 구멍을 파고에 의해 수집 하였다. 그 후, EtBr로는 부탄올 추출 BAC DNA로부터 추출하고 EtBr이없는 BAC DNA는 에탄올 침전에 의해 농축시켰다. 마지막 단계는 허용 세포에 RNA 형질 전환 (그림 4) 후 전체 길이 SA (14) -14-2 BAC (PBAC / SA (14) -14-2)에서 체외에서 전사 합성 RNA를 특정 감염의 결정이다. 3 &#39;단계 1에서, 전체 길이의 선형화 SA 14 -14-2의 cDNA :이 단계는 세 개의 순차적 인 단계를 포함-end 바이러스 게놈 (도 4a)의; 2 단계, 실행 - 오프 전사 (그림 4B)에 의해 선형화 된 cDNA의 합성 RNA를 생산; 그리고 3 단계의 RNA 합성 (도 4C)로 형질 BHK-21 세포에서의 재조합 바이러스의 구조. 실험적으로, PBAC / SA (14) -14-2의 두 개의 독립적 인 클론 XbaI으로 내가 소화와 선형화 및 XbaI으로 나는 분해에 의해 생성 된 네 개의 염기 5 &#39;오버행을 제거하기 위해 MBN 처리 하였다. 선형화 BAC에 에탄올 침전,이어서 페놀 - 클로로포름 추출하여 정리 하였다. 두 개의 정제 BAC에의 선형화는 0.8 % 아가 로스 젤 (그림 5A)에 증명되었다. 페놀 - 클로로포름 추출은 선형화 된 BAC에가의 RNase가없는 것을 확인하기 위해주의 깊게 수행해야합니다. 두 개의 선형 BAC에 각각 M (7) G (5 &#39;) PPP의 존재 SP6 RNA 중합 효소를 사용하여 결선 전사 cDNA를 템플릿으로 제공 (5&#39;) 캡 유사체. 합성 RNA를의 무결성을 기준 1킬로바이트의 DNA 사다리 (그림 5B)와 함께, 0.6 % 아가 로스 젤에있는 두 개의 전사 반응 혼합물의 분취 량을 실행하여 나타내었다.이 간단한 분석에서, 주요 저명한 RNA 밴드는 언제나 마이그레이션 3킬로바이트 아래의 DNA 밴드를 참조하고 날카로운 것으로 나타났다. 그러나, RNA는 동일한 겔에 도말 외관이 저하 것이다. 감염성 중심 분석은 합성 RNA는 감염성의 비를 결정하기위한 금 표준이다. 이 분석은 (3 × 105 세포 / 웰) 나이브 BHK-21 세포를 함유하는 6- 웰 플레이트에서 10 배 희석 한 일렉트로 세포의 분취 량을 시드, RNA 샘플을 BHK-21 세포를 electroporating, 아가 로스 오버레이에 의해 이루어졌다 세포 단층 상. 4 일 동안 배양 한 후, 생존 세포는 포름 알데히드로 고정하고, 크리스탈 바이올렛의 염색olution는 세포 (도 6A)에 전달되는 감염성 RNA 분자의 수에 대응 감염성 센터 (플라크)의 수를 정량화한다. 시험 관내 전사에 사용되는 cDNA의 템플릿이 아닌 감염성 것으로 입증 되었기 때문에, 전사 반응 혼합물의 분취 량 (27)은 직접적으로 전기 천공을 위해 사용 하였다. 전기는 RNA 형질에 대한 선호되는 방법입니다; 대안 적으로,이 RNA를 DEAE 덱스 트란과 양이온 성 리포좀을 사용하는 다른 방법에 의해 형질 전환 될 수있다. RNA의 전기 천공은 매우 효과적이지만, 전기 펄스의 &quot;아크&quot;를 염 전기 반응이나 전기 천공 큐벳 재사용되는 경우 존재하는 경우에 드물게 발생한다. RNA 형질 감염된 세포에서 바이러스 단백질의 발현을 방지 NS1 토끼 항혈청 (도 6b)을 사용하여 면역 형광 분석법에 의해 검사 하였다. RNA 형질 감염된 세포의 상청액에 축적 된 바이러스 입자의 제작했다플라크 분석 (그림 6C)에 의해 alyzed. 이러한 실험의 결과는 cDNA를 합성 유래의 RNA가 재조합 바이러스의 높은 역가를 생성 허용 BHK-21 세포에 감염임을 분명히 보여준다. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 올리고 뉴클레오티드 </td><td> 시퀀스 (5 &#39;3&#39;) </td><td> 위치 (B) </td><td> 극성 </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> 1 층 </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532에서 2553 사이 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> 개미ISENSE </td></tr><tr><td> 2 층 </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800에서 1821 사이 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> 3 층 </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952-10977 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> 4 층 </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10956-10977 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac 고마워 </td><td></td><td> 감각 </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670-10694 </td><td> 감각 </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954-10977 </td><td> 안티센스 </td></tr><tr><td colspan="4"> JEV 시퀀스는 대문자로 표시하고, BAC 시퀀스는 소문자로 표시됩니다. B 염기 위치는 JEV SA (14) -14-2 (GenBank 액 번호 JN604986)의 전체 게놈 서열을 의미한다. </td></tr></tbody></table> 표 1 : cDNA 합성, PCR 증폭, BAC 및 돌연변이 유발을 위해 사용 된 올리고 뉴클레오티드. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> 그림 1.0; 전략 BAC으로 JEV SA (14) -14-2의 전체 길이의 cDNA의 건설을위한 JEV의 입자 바이러스 RNA의 (A)를 분리.. JEV SA 14 -14-2의 게놈 RNA의 개략도가 도시. 바이러스 게놈 전체를 덮는 (B) 네 개의 중첩 된 cDNA 단편의 합성 (F1 내지 F4). PBAC / F4에 PBAC / F1 키를 생성 BAC 벡터에 네 개의 중첩 된 cDNA 조각의 (C) 서브 클로닝. 체외에서 결선 전사 복제 된 cDNA의 (D) 수정. PBAC / F1 SP6는 바이러스의 5&#39;- 말단의 상류 SP6 프로모터 서열을 포함 PBAC / F1의 유도체이다. PBAC / F3 KO로 자동 점 돌연변이 (T → 9134, 별표)를 포함 PBAC / F3의 유도체이다. PBAC / F4 소유주는 바이러스 3&#39;- 말단의 하류 인공 XbaI으로 나는 실행 오프 사이트를 포함 PBAC / F4의 유도체이다. (E </<html> 강한&gt;) 전체 길이 SA (14) -14-2 BAC 조립 (PBAC / SA (14) -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> JEV SA 14 -14-2의 전체 길이 게놈 RNA 걸친도 네 중첩 된 cDNA 단편의 합성 2 (F1 내지 F4). 네 개의 RT-PCR 산물은 0.8 % 아가 로스 겔에서 전기 영동에 의해 평가된다. M, 1킬로바이트의 DNA 사다리. 네의 cDNA 조각의 예상 크기는 젤 이미지의 맨 아래에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; JEV의 전장 cDNA SA 14 -14-2 함유 BAC도 3의 정제. BAC 플라스미드는 E.로부터 단리 SDS-알칼리 용 균법에 의해 대장균 DH10B은 더욱 협동 학습-EtBr이 구배 밴딩 그래피. 16 × 76mm 밀봉 폴리 프로필렌 튜브를 사용하여 협동 학습 - EtBr이 경사의 예는 것입니다 발표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> JEV SA (14) -14-2 cDNA를 BAC 조립 전체 길이에서 감염성 바이러스의 회복 그림 4. 개요. cDNA를 템플릿 () 선형화. JEV 혈중 알코올 농도가 절단되는 전체 길이XBA I 및 MBN로 처리 하였다. RNA 전 사체의 (B)를 합성. 선형화 된 cDNA를 m 7 G (5 &#39;) PPP (5&#39;)의 캡 유사체의 존재하에 SP6 RNA 중합 효소로 전사된다. 합성 JEVs의 (C) 복구. 시험 관내 전사의 RNA를 합성 바이러스의 높은 역가를 생성하는 전기에 의해 BHK-21 세포로 형질 전환된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> cDNA를 템플릿으로 전체 길이 JEV의 혈중 알코올 농도를 사용하여 시험 관내 전사에 의해 그림의 RNA 5. 합성을. 선형화 된 전체 길이 JEV BAC, PBAC / SA (14) -14-2의 (A) 세대. PBAC의 두 개의 독립적 클론/ SA (14) -14-2 (Cl.1과 c12에)는 MBN과 XbaI으로 내가와 소화 및 후속 처리로 선형화된다. 선형화의 BAC는 0.8 % 아가로 스겔 전기 영동에 의해 검사된다. 결선 전사에 의해 합성 RNA를 (나) 생산. 두 개의 선형 BAC에 각각 SP6의 RNA 중합 효소 실행 - 오프 전사의 템플릿으로 사용됩니다. 두 전사 반응의 분취 량은 0.6 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. M은 1킬로바이트 DNA 사다리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> 전체 길이 JEV의 BAC 및 합성 바이러스의 회복 전사 합성 RNA를 그림 6. 특정 감염. BHK-21 세포 FR 유래 RNA 전 사체와 (모의) 일렉트로 - 모의 또는 일렉트로 있습니다전장 JEV의 BAC (Cl.1 및 c12에)의 두 개의 독립적 인 클론의 각 OM. (A) RNA의 감염. 세포는 아가로 오스와 겹쳐 및 사후 형질 사일에 크리스탈 바이올렛으로 염색된다. 감염성 RNA는 세포 (좌측 패널)에 전기 천공 감염성 RNA의 양을 추정하기 위해 감염성 센터 세이에 의해 결정된다. 또한, 전염성 센터의 대표 이미지 (오른쪽 패널) 표시됩니다. (B) 단백질 발현. 세포 4- 웰 챔버 슬라이드에 배양했다. 20 시간 후 - 형질 감염 (HPT)에서 RNA-일렉트로 세포에서 바이러스 성 단백질 발현은 일차 항 NS1 토끼 항혈청과 이차 Cy3가 접합 된 염소 항 - 토끼의 IgG (적색)를 이용하여 면역 형광 분석법에 의해 분석된다. 핵은 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (파란색)으로 대조된다. 면역 형광 이미지는 해당 미분 간섭 콘트라스트 이미지 상에 오버레이된다. (C) 바이러스 수율. 세포를 배양하고 1 아르50mm 배양 접시. 22, 40 HPT에서 RNA-일렉트로 세포의 배양 상층 액에 축적 감염성 비리의 생산은 플라크 분석에 의해 조사한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

이 절차의 전반적인 목표는 일본뇌염 바이러스와 같이 게놈이 세포 mRNA와 동일한 극성을 가진 양성 가닥 RNA 바이러스의 클론 cDNA로부터 감염성 바이러스 입자를 복구하는 것입니다. 이러한 cDNA 기반의 역유전학은 바이러스 게놈 RNA를 직접 조작할 수 있게 하여, 바이러스 복제 및 병원성에 관한 분자 및 유전학적 연구를 위한 재조합 바이러스를 생성할 수 있게 하는 핵심적인 방법입니다. 또한 이 기술은 외래 유전자 전달을 위한 유전적으로 정의된 백시니아 바이러스 벡터 개발을 가능하게 하는 가치 있는 플랫폼을 제공합니다.이 방법들은 음성 또는 양성 균주, RNA 바이러스, 특히 게놈 크기가 10 kb보다 큰 바이러스의 전장 cDNA 클로닝에 적용 가능합니다. 실험 과정의 시연은 본 연구실의 연구원인 윤상임, 박사후 연구원 송병학 및 김진경, 그리고 학부생 조던 프랭크(Jordan Frank)가 수행할 예정입니다.본 출판물의 비디오 부분에서는 관심 서열을 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC)의 제작, 백-플라스미드(back plasmid)로부터 전사된 RNA의 합성, 그리고 RNA의 감염력 및 바이러스 수득률 측정 방법을 다룹니다. BAC 플라스미드를 생성하기 전에 사용된 모든 절차는 텍스트 프로토콜에 매우 상세히 제공되어 있습니다. 본 절차를 위해, 먼저 BAC 플라스미드를 보유한 E. coli DH10B의 단일 콜로니를 클로람페니콜이 함유된 3mL의 2X YT 배지에서 배양합니다. 배양액을 35°C에서 225~250 RPM으로 흔들어주며 10시간 동안 배양합니다.10시간 후에 배양 규모를 확대합니다. 그런 다음 500 µL의 배양액을 500 mL의 배지에 접종하고, 강하게 흔들어주며 6시간 동안 접종균을 배양합니다. 6시간 후, 세균 배양액을 250 mL 병 2개에 나누어 4 °C에서 3,100 g로 15분간 원심분리합니다. 그런 다음 각 펠렛을 30 mL의 GTE 용액에 재현탁합니다.라이소자임 500 µL를 첨가하고 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그동안 다음 단계를 위해 신선한 용해 용액(lysis solution)을 준비합니다. 10분 후, 용해 용액 60 mL를 첨가하고 용액이 투명해질 때까지 소용돌이 방식으로 섞어줍니다.실온에서 10분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 각 병에 중화액 45 milliliters를 넣고 충분히 섞일 때까지 병을 뒤집어 줍니다. 그 후 10분 동안 얼음에 보관합니다.고속 냉장 원심분리를 통해 중화된 용해물을 수집합니다. 그 다음 상층액을 두 개의 새로운 250 mL 병에 수집합니다. 각 병에 0.6 부피의 100% isopropanol을 첨가하고 20분 동안 얼음 위에 둡니다.다음으로, 침전물을 원심 분리하여 가라앉힌 후 상층액을 제거하고 펠렛을 5 mL의 TE 완충액에 녹입니다. 두 부피의 용액을 하나의 50 mL 튜브에 합치고, 동일한 부피의 5 M 염화리튬을 첨가한 후 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양하여 RNA를 침전시킵니다. 20분간 저온 원심 분리를 수행하여 RNA 침전물을 수집합니다.그런 다음 상층액을 새로운 250 milliliter 튜브로 옮기고, 2 volumes의 100% isopropanol을 첨가한 후 DNA 침전물이 형성되도록 튜브를 얼음에 둡니다. 20분 후에 침전물을 원심 분리하고, 상층액을 흡입하여 제거한 다음, DNA 펠렛을 9.5 milliliters의 TE buffer에 재현탁시키고 DNA 용액을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.에티듐 브로마이드가 포함된 염화 세슘 농도 구배를 설정하여 준비 과정을 계속합니다. 18게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 혼합물을 밀봉 가능한 폴리프로필렌 튜브에 넣고 튜브를 밀봉합니다. 밀봉된 튜브를 초원심분리기에서 하룻밤 동안 회전시켜 염화 세슘 농도 구배를 형성합니다.다음 날, 세슘 클로라이드 농도 구배에서 BAC 플라스미드의 DNA 밴드를 수집합니다. 18게이지 바늘을 사용하여 농도 구배 상단에 공기 배출구를 만들고, 20게이지 바늘과 주사기를 사용하여 농도 구배 측면에서 BAC DNA를 수집한 후, 수집물을 1.7 밀리리터 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 세척 과정을 수행하기 위해 2.5배 부피의 포화 부탄올 수용액을 첨가하고 일반적인 볼텍싱으로 혼합합니다.그런 다음 혼합물을 상온에서 원심분리하고 하층의 수성상을 새로운 1.7 milliliter 마이크로 튜브로 옮깁니다. 모든 에티듐 브로마이드를 제거하기 위해 이 세척 과정을 총 6회 반복합니다. 이제 BAC DNA를 침전시킵니다. 튜브에 3 molar 아세트산 나트륨을 부피의 1/10만큼, 100% 에탄올을 2.5배 부피로 첨가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 침전물을 상온에서 원심분리하고 1 milliliter의 70% 에탄올로 DNA 펠렛을 세척합니다. 원심분리를 반복하여 펠렛을 다시 수집합니다. 마지막으로 펠렛 형태의 DNA를 10분 동안 공기 건조시킨 후 200 microliters의 TE 버퍼로 용출합니다.총 부피 100 µL에서 Xba-one을 사용하여 BAC 플라스미드의 대규모 제한 효소 절단을 시작합니다. 이 절단 반응을 37 °C에서 12~15시간 동안 수행합니다. 그 다음, 25 units의 mung-bean nuclease를 추가하여 30 °C에서 2시간 동안 추가로 배양합니다.배양 후, 증류수를 사용하여 부피를 300 µL로 맞춥니다. 이제 희석된 샘플에 동일한 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올을 첨가하고, 1분 동안 강하게 볼텍싱하며, 튜브를 원심 분리한 뒤 상층액인 수층을 새 튜브로 옮겨 페놀 추출을 수행합니다.그런 다음 클로로포름으로 추출 과정을 반복합니다. 다음으로, 에탄올 침전을 통해 선형화된 BAC DNA를 회수합니다. 원심분리로 DNA 펠렛을 수집하고, 상층액은 버린 후 1mL의 70% 에탄올로 펠렛을 세척합니다. 원심분리 단계를 반복하고 펠렛을 공기 중에서 건조합니다. 10분간 건조한 후, DNA 펠렛을 30µL의 증류수에 용해합니다. 그런 다음 회수된 BAC 1µL를 0.8% 아가로스 겔에서 확인합니다.다음으로, RNA 정량을 위해 tritium 표지 UTP를 포함하여 선형화된 BAC DNA의 25 µL runoff transcription을 설정합니다. 37 °C에서 1시간 동안 반응을 수행합니다. 그런 다음 0.6% agarose 젤에서 runoff transcription 반응액 1~2 µL를 확인합니다.디시당 300만 개의 세포를 분주하여 150mm 디시에서 24시간 동안 배양한 BHK-21 세포로 시작합니다. 세포 단층을 차가운 용액 A로 헹군 후, 트립신 처리를 통해 세포를 분리합니다. 270 g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.그 다음 세포를 50 milliliters의 차가운 용액 A에 재현탁하고 다시 원심 분리합니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다. 마지막 세척 후, 세포를 용액 A에서 ml당 20 million의 농도로 재현탁합니다. 이어서 세포 현탁액 400 microliter 분취액을 2 millimeter 큐벳에서 2 micrograms의 합성 RNA와 혼합합니다.최적의 조건에서 혼합물을 즉시 전기천공하고 세포를 10분 동안 휴지시킵니다. 그 후, 600 µL의 완전 배지가 들어 있는 마이크로원심분리관으로 세포를 옮깁니다. 이제 전기천공된 세포를 1 mL 부피로 10배 연속 희석하여 준비합니다. 각 희석액 100 µL를 정상 BHK21 세포 단층 위에 분주합니다. 4~6시간 동안 배양한 후, FBS가 첨가된 MEM 내 0.5% agarose를 세포 위에 덮고 4일 더 배양합니다.BHK21 세포를 모의 전기천공하거나, 전체 길이의 JEV-BAC의 독립된 두 클론에서 유래한 RNA 전사체를 전기천공하였습니다. 4일 후, 세포 내의 감염성 RNA를 관찰하기 위해 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였습니다. 이 염색법을 사용하여 감염 중심(infectious centers)의 수를 정량화하였습니다. 다음으로, 전기천공 후 20시간이 지난 RNA 전기천공 세포에서 anti-NS-one 토끼 항혈청과 적색으로 표시된 Cy3-결합 2차 항체를 사용하여 바이러스 단백질 발현을 조사하였습니다. 핵은 청색으로 표시된 DAPI로 대조 염색하였습니다. 이후 전기천공 22시간 및 40시간 후에, RNA 전기천공 세포의 배양 상층액에 축적된 감염성 비리온의 생성량을 플라크 분석법으로 조사하였습니다.이 영상을 시청한 후, 일본뇌염 바이러스와 같은 양성 균주의 클론 cDNA, RNA로부터 감염성 바이러스를 완전히 복구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 일본뇌염 바이러스 및 기타 인체 병원성 미생물을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하기 전에는 적절한 생물안전 교육이 반드시 필요합니다.

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

BHK-21(baby hamster kidney-21) 세포를 150 mm 배양 접시에 접시당 3 × 106 cells의 밀도로 분주하여 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다.

박테리아 인공 염색체 유래 합성 RNA가 형질전환된 세포로부터의 감염성 비리온 복구

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

Zika 바이러스의 최근 전염병은 백신 및/또는 치료 전략을 개발하기 위하여 역유전 접근을 확립의 중요성을 강조합니다. 여기서, 우리는 인간 시토메갈로바이러스의 제어하에 세균성 인공 염색체에 조립된 전신 cDNA 클론으로부터 전염성 재조합 Zika 바이러스를 즉각적으로 조기 프로모터로 구출하는 프로토콜을 기술한다.

세균성 인공 염색체 cDNA 클론에서 재조합 Zika 바이러스의 구조

호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

여기에서는 인서트의 3' 말단에 적절한 제한 부위를 도입하여 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상동 재조합 기술을 통해 벡터를 선형화하고 DNA 단편을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 발현 벡터 구축을 위한 원활한 클로닝 접근법

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

배우세요 세균 인공 염색체(BAC)를 이용하여 일본 뇌염 바이러스(JEV)의 전장 cDNA에서 감염성 바이러스 입자를 구출하는 방법을. 이 기술은 양성 가닥 RNA 바이러스의 유전체학 연구와 유전자 정의 백신 개발에 활용됩니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

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