Name: 인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑 2 +와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 랑겐도르프 관류 토끼 심장에서 막 횡단 잠재력과 근질 그물 칼슘을 동시에 광학 매핑하는 방법을. 이 기술은 심장 전기생리학 연구에 필수적인 SR 칼슘 역학을 직접 관찰할 수 있게 합니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01 HL 111600)과 미국 심장 협회(American Heart Association, 12SDG9010015)의 일부 지원을 받았습니다.

동물과 관련된 모든 절차는 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 건강의 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 부착했다. 1. 준비 <ol><li> 4 ° C에서 사전 및 저장소에 수정 된 타이로드의 솔루션의 두 집중 (25X) 주식을 준비한다 : (1) 주식 I (MM에서 : 염화나트륨 3205, 염화칼슘 2 32.5, KCl을 117.5,의 NaH 2 PO 4 29.75,의 MgCl 2 26.25) 및 (2) (MM의 :의 NaHCO3 500) 주식 II. <ol><li> (DI)을 염화나트륨 128.2, CaCl2를 1.3의 KCl 4.7의 MgCl 2 1.05의 NaH 2 PO 4 1.19의 NaHCO3 (20) 및 탈 이온수 1840 ㎖에 결합하여 11.1 글루코스 : 갓 (㎜)에하기 조성의 2 L 타이로드의 용액을 제조 물 80 ml의 스톡 I, II의 스톡 80 ㎖, 및 글루코스 4g. 직접 주식 나는 그리고 스톡 II를 함께 사용하지 마십시오 추가1,840 ml의 DI에 m은 침전을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 사전에 10 mg을 무수 디 메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 / ㎖에서 여기 수축 uncoupler의 blebbistatin의 주식 솔루션을 준비하고 4 ℃에서 원액을 저장합니다. </li><li> 형광 염료의 스톡 용액을 제조한다 : (1) 전압에 민감한 염료 RH237 (DMSO에 1 ㎎ / ㎖), (2) 낮은 친 칼슘 지시등 FLUO-5N AM 제조자의 권장 사항에 따라 (DMSO 2 ㎎ / ㎖)를. 적재 능력의 후속 손실 분해를 방지하기 위해 즉시 준비를 사용합니다. </li><li> 프라임 산소화 함께 재순환 랑겐 돌프 관류 시스템 (95 % O 2, 5 % CO 2)의 타이로드 용액. 7.4 ± 0.05의 타이로드 용액의 pH를 유지하기 위해, O2 / CO (2)의 흐름을 조정한다. 지속적으로 관류를 필터링 : 인라인 나일론 짠 그물 필터 (11 μm의 기공 크기)를 사용합니다. <ol><li> 이후 loadi으로 실온에서 국무 관류 시스템,FLUO-5N 오전 NG 실온에서 수행됩니다. FLUO-5N 오전 로딩, 순환 관류의 작은 볼륨 (~ 150 ㎖)를 사용합니다. 염료로드 한 후, 관류의 더 큰 볼륨 사용 (1-2 패, 그림 1C 참조). </li></ol></li><li> 데이터 수집 시스템의 전원을 켜고 심전도 및 관류 압력을 지속적으로 모니터링 준비합니다. 압력 모니터링 시스템을 준비합니다 관류 라인에 압력 변환기를 연결하고 transbridge 앰프 관류 압력을 모니터링 할 수 있습니다. 심장이 관류 시스템에 연결되지 않은 경우 0 mmHg로 기준선 관류 압력을 조정합니다. </li><li> V 분 및 SR 칼슘 신호 사이의 공간 정렬을 보장하기 위해 광학 매핑 카메라를 맞 춥니 다. <ol><li> 첫째, 통치자 또는 관류 접시에 텍스트 개체를 배치하여 카메라 초점을 맞 춥니 다. 라이브 뷰 모드로 매핑 카메라를 켜고 텍스트가 선명하고 선명해질 때까지 초점을 조절합니다. 각각의 카메라로부터 하나의 프레임 화상을 취득. </li><li> 오버레이두 이미지가 볼 수 있도록 이러한 이미지 및 상단 이미지의 투명도를 조정합니다. 이미지의 텍스트가 정확히 겹쳐한다. 완벽하게 정렬되지 않은 경우 두 이미지가 정렬 될 때까지, 다이크로 익 미러 또는 각 카메라의 위치의 각도를 조정한다. </li></ol></li></ol> 토끼 심장의 2. 수확, 관류, 그리고 염료 로딩 <ol><li> 승인 된 토끼 제한 수단의 토끼를 고정합니다. 깊이 펜 토바 비탈 나트륨 (50 mg / kg) 및 헤파린 (1000 IU)의 정맥 내 주사 (귀 가장자리 정맥)을 통해 마취. <ol><li> 토끼가 표시 침해 반사 신경이 부족하면, 중간 선 피부 절개는 흉골과 갈비뼈를 노출 할 수 있습니다. 흉골에 xyphoid에서 무딘 팁 수술 가위로 흉골을 통해 잘라. 흉골을 여는 동안 심장이 손상되지 않도록주의하십시오. 마음을 노출 갈비뼈를 확산. </li><li> 빠르게 빠르게 모든 선박과 결합 조직을 절단하여 전체 심장 - 폐 블록은 절제. 최단 당일tely 얼음처럼 차가운 타이로드의 용액에 심장 - 폐 블록을 배치합니다. </li></ol></li><li> 역 행성 관류의 대동맥을 찾습니다. 대동맥 궁의 세 가지에 바로 인접 상행 대동맥을 잘라. 관류 시스템에 연결 8 G 캐 뉼러에 대동맥 Cannulate. 캐 뉼러에 대동맥을 확보하기 위해 USP 0 실크 봉합사의 조각을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 마음에서 기관, 폐 및 심 외막 지방을 해부하다. 날카로운 집게 및 해부 가위, 승모판의 위치를​​주의 깊게 손상 또는 좌심실에서 솔루션 혼잡을 방지하기 위해 하나의 전단지를 제거합니다. </li><li> 이미징이 위를 향하도록 마음의 전방 표면과 수평으로 유리 외피 관류 실에 마음을 담근다. 매핑 (그림 1D) 동안 마음의 움직임을 방지하기 위해 접시의 실리콘 바닥에 U 자형 핀 실 가드의 조각에 캐 뉼러를 고정합니다. 원하는 경우, STA에 대한 심장의 정점에 작은 곤충 핀을 삽입bilization. </li><li> 위치 심전도 (ECG) 심장의 오른쪽과 왼쪽에 목욕 전극. 완전히 욕 전극 잠수함 그들이 리드 I 구성으로 부피가 유사한 실시 ECG 제공 심장 표면과 접촉하지 않는 보장. 보통의 리드 나는 심전도 형태를 확인합니다. 70 mmHg로 - 대동맥 압력이 60으로 유지 될 수 있도록 - (35 ml / 분 25) 흐름을 조정합니다. </li><li> 실내 조명을 끄고 0.3 추가 - 관류 (- 20 μm의 최종 농도 10)에 blebbistatin 주식 솔루션 (단계 1.2)의 0.6 ml에. <ol><li> blebbistatin의 photoinactivati​​on을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오. 필요한 경우, 소형 스포트 또는 전조등은 작업 조명을 제공하기 위해 사용될 수있다. 주 :이 Blebbistatin 미오신 ATP 아제 억제제 및 여진 수축 uncoupler이다. 심장 에너지 생산이 손상 될 수있다 - FLUO-5N 로딩 확장 (60 분), RT (저체온증) 조건을 요구하기 때문에 (2.10 단계 2.8 참조). 목erefore, 관류 종래에 blebbistatin 첨가 에너지 수요 (16)을 감소시키고 후속 광학 레코딩 17 동안 모션 아티팩트를 제거 할 수있다 로딩 염료. </li></ol></li><li> 심장의 수축이 중단되면 (10 - 대동맥 압력 기록에 대한 확인 15 분), 작은 볼륨 순환 관류 시스템 (단계 1.4.1 참조)로 전환합니다. </li><li> 준비하고 FLUO-5N 오전 로딩 솔루션을로드 : 0.25 ml의 따뜻한 20 % 플루로 닉 F127에 FLUO-5N 오전 원액 (1.3 단계)의 0.25 ML을 추가합니다. 0.5 ml의 혼합물에 따뜻한 타이로드의 솔루션을 추가 잘 혼합하고, 소량 순환 관류 시스템에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 연속적으로 관류 압력 및 ECG를 모니터하고 필요하다면 흐름을 조절한다. 염료 로딩은 실온에서 약 1 시간 소요됩니다. 로딩 후 45 분, 37 ℃로 관류 시스템 및 관류를 따뜻하게 시작 순환 물 목욕을 켜 시작했다. </li><li> FLUO-5N 오전 로딩, SWI의 60 분 후큰 부피 재순환 관류 시스템에 관류 TCH (단계 1.4 참조). </li><li> 따뜻한의 타이로드 액 1ml에 전압 감응 염료 RH237 원액 (단계 1.3) 50 μL를 희석하고 캐뉼라에 주입구 근위로 (~ 5 분에 걸쳐)을 천천히 부가. </li></ol> 3. 광학 매핑 <ol><li> 염료로드의 마지막 순간 동안, 마음을 놓고 실험에 대한보기의 해당 필드를 보장하기 위해 광학 매핑 카메라 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 원하는 경우, 페이싱에 대한 마음의 심​​ 외막 표면에 양극 페이싱 전극을 배치합니다. </li><li> 인해 관류의 재순환에 존재할 수있는 액체의 표면에 동 잡음을 줄이기 위해 관류 챔버의 표면에 플라스틱이나 유리 커버 슬립을 배치했다. 주 : 커버 슬립에 대한 대안이 깨끗한 플라스틱 50mm 페트리 접시 덮개를 사용할 때. </li><li> 균일 전자와 마음의 표면을 조명 빛 가이드를 초점xcitation 빛. 495 nm의 대역 통과 필터 (도 1a) - 청색 발광 다이오드 (LED) 광원을 사용하여 상기 (475)로 광을 필터링. </li><li> macroscope 두 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS) 광학 매핑 카메라와 방출되는 형광을 수집합니다. 545 nm에서 이색 거울 방출 된 빛을 분할합니다. <ol><li> 롱 패스는 700 nm에서, V의 m 신호를 포함하는, 긴 파장 부분을 필터링. 534 나노 미터 (도 1A) - 밴드 패스 (502)에서, SR 칼슘 신호를 포함하는, 단파장 잔기 필터. 1 kHz에서 - 0.5 광 데이터 수집의 빈도를 설정합니다. </li></ol></li><li> 각각의 광 기록, 처음으로, 원하는 페이싱 프로토콜을 시작 여기 광을 켜고 1 수집 - 데이터의 4 초. 필요한 경우, 페이징 프로토콜 및 데이터 획득을 동기화. 주 : 것은 불가능 FLUO-5N AM, 따라서 신호 대 잡음비 (SNR)를 재 로딩한다 decrea자체 SR에서 누출 염료에 의한 실험을하는 동안. 높은 SNR 값을 보장하기 위해 2 시간 - 1 실험 프로토콜을 제한합니다. </li><li> 실험 후, 탈 이온수로 다시 DI 물, 70 % 알코올 시약의 순차적 관류 시스템을 씻어. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지를 이용하여 공간 가우시안 필터 (반경 3 픽셀)를 각 데이터 세트를 필터링. </li><li> 필요한 경우, 공간적으로 V의 m 및 SR 칼슘 2 + 데이터 세트를 맞 춥니 다. 단계 1.6에서와 같이, 각각의 카메라에서 이미지를 중첩되는지 확인보기 (즉, 정맥, 페이싱 전극)의 분야에서 심장의 해부학 적 구조 (즉., 관상 동맥 혈관, 심방의 가장자리 또는 심실) 또는 기타 항목을 정확하게 중복. 그렇지 않은 경우, 데이터 세트의 공간 배치가 필요하다. </li><li> 화소 번호를 기록하게 정확한 오버랩까지 X 축 및 Y 방향이 달성에 상부 투명 이미지를 이동이미지는 각 방향으로 이동해야합니다. 상부 이미지 (V m 또는 SR 칼슘 하나)에 대응하는 전체 데이터 세트는 V의 m 및 SR 칼슘 2 데이터 세트 사이의 정확한 정렬을 보장하기 위해, 각 방향의 화소 수만큼 시프트 결정되어야한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

성공적인 FLUO-5N 염료 로딩 키 염료 대량의 로딩 시간 (1 시간)의 길이에 대한 필요없이 높은 FLUO-5N 농도 허용 소량 재순환 관류 셋업하고, 로딩을 수행 실온에서. 로딩 빠르게 생리 온도, 셀룰러 절단 효소 활성 염료 세포질에서 염료 분자를 포착하고이를 SR 세포막을 통과 할 수없는, 세포막을 통과 -AM 태그에서 수행되는 경우. RT에서, 그러나, 효소 활성은 둔화되고 -AM 태그 전에 세포막과 SR 막 모두를 교차 할 수 염료 충분량 SR에 염료를 포착, 절단된다. 심지어 최적의 하중 조건으로, 그러나, 신호 진폭이 접근 분수 형광 변화 (ΔF / F)는 높은 친 화성 염료와 V (m)의 전통적인 광학 매핑 및 세포 내 칼슘보다 낮은 것. 예를 들어, LED를 여기 광, 거시적 목적, 큰 필터와 다이크로 익 미러 (5 cm × 5 cm)에, 그리고 CMOS 카메라, 분수 형광 변화 이루어져 여기서 사용되는 광 설정으로 ...

온전한 Langendorff-관류 심장에서 세포 내 Ca2+ 및 막관통 전위(Vm)의 이중 광학 매핑은 부정맥 및 흥분-수축 결합1-4의 메커니즘을 포함하여 심장 전기생리학 연구의 주류가 되었습니다. 이 접근법은 정상 및 비정상 전기생리학에 대한 전례 없는 지식을 제공했으며, 중요하게는Vm과 세포 내 Ca2+ 사이의 양방향 관계에 대한 지식을 제공했습니다. 그러나 친화성이 높은 형광 지표(예: Rhod-2 및 Fluo-4)를 사용한 세포 내 Ca2+의 광학 매핑은 세포 내 Ca2+의 벌크 변화만 보고하며 이러한 변화가 막관통 Ca2+ 플럭스, 세포 내 저장소로의 방출 및 재흡수로 인한 것인지 아니면 대부분의 경우 두 가지 모두의 조합으로 인한 것인지 구별할 수 없습니다. 또한, 친화도가 높은 Ca2+ 지표는 온-오프 역학이 느리고 Ca2+ 농도5의 급격한 변화를 정확하게 보고하지 못할 수 있습니다.
각 활동 전위는 세포 내 Ca2+ 과도 (CaT)로 알려진 세포 내 Ca2+의 상승을 유발합니다. 포유류의 심장에서 전체 CaT의 약 70 – 90%는 리아노딘 수용체(RyRs)의 개방을 통해 근소포체(SR)에서 Ca2+의 방출로 인한 것입니다6. SR 내에서 총 Ca2+의 약 절반은 칼세퀘스트린(CSQ) 및 기타 SR 내 완충액7에 결합되어 있으며, 이는 SR Ca2+ 항상성8,9에 중요한 역할을 합니다. free SR Ca2+의 양은 SR Ca2+ 방출의 원동력과 RyR의 게이팅을 결정하므로 세포 내 CaT에 상당한 영향을 미칩니다. 또한, SR Ca2+ 방출 또는 재흡수의 변경은 차례로 전기발생 Na+-Ca2+ 교환을 통해 Vm에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 부정맥 유발 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 CaT 외에도 free SR Ca2+의 모니터링은 수축 및 전기생리학적 기능 장애에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
지난 몇 년 동안 연구자들은 고립된 심장 근세포와 온전한 심장의 단일 위치에서 SR Ca2+를 모니터링하는 데 상당한 진전을 이루었습니다. 이러한 방법 중 하나는 RyR을 열기 위해 빠른 카페인 펄스를 필요로 하며, 그런 다음 세포 내 Ca2+10의 즉각적인 상승으로부터 SR Ca2+ 함량을 추론하거나 계산합니다. 또 다른 흥미로운 접근법은 자유 SR Ca2+에 결합하는 Fluo-5N11 또는 Mag-Fluo412와 같은 낮은 친화도 Ca2+ 지표를 사용합니다. 이러한 지표는 10 – 400 μM 범위의 해리 상수(Kd)를 가지므로 Ca2+ 농도([Ca2+]SR)가 밀리몰 범위에 있는 SR 루멘에 비해 세포질에서 최소한의 형광을 나타냅니다. 낮은 친화성 Ca2+ 지표를 사용하여 분수 SR Ca2+ 방출 및 Ca2+ 대체13,14의 메커니즘을 포함하여 분리된 근세포 수준에서 SR Ca2+ 사이클링의 여러 측면을 조사했습니다. 그러나 온전한 심장에서 SR Ca2+ 순환의 이질적인 특성과 공간적으로 구별되는 부정맥 현상에서 SR Ca2+의 역할을 완전히 이해하기 위해서는 온전한 심장의 심외막 표면을 가로질러 SR Ca2+를 영상화하는 방법이 필요하다15.
이 기사에서는 친화도가 낮은 Ca2+ 지표 Fluo-5N을 사용하여 온전한 Langendorff 관류 토끼 심장에서 자유 SR Ca2+ 및 Vm의 이중 광학 매핑 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 심장의 심외막 표면을 가로질러 SR Ca2+ 특성을 공간적으로 드러내는 것 외에도Vm을 동시에 모니터링할 수 있는 이점이 있어 Vm과 SR Ca2+ 사이의 양방향 관계를 조사할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Tyrode 솔루션 구성 요소</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Tyrode 솔루션 구성 요소</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Tyrode 솔루션 구성 요소</td></tr><tr><td>MgCl2(6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Tyrode 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Tyrode 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Tyrode 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Tyrode 용액의 구성 요소</td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td>Air가스</td><td>탄화물</td><td>Tyrode 용액의 산소화 및 pH용</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Excitation-contraction uncoupler</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>전압에 민감한 염료</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>낮은 친화도 Ca2+ 지시자; 대안: Invitrogen F-14204; 로딩은 실온에서 수행해야 합니다</td></tr>. <tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>Ca2+ 표시기 로딩용; 용액이 깨끗해질 때까지 사용 전에 따뜻하게 하십시오</td></tr>: <tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>블레비스타틴과 염료를 용해시키기 위해</td></tr><tr><td>필터</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &#956; m 인라인 필터</td></tr><tr><td>압력 트랜스듀서</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>관류 압력 측정용</td></tr><tr><td>트랜스브리지 트랜스듀서 증폭기</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>압력 신호 전달/증폭용; PowerLab은 적절한 BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>AD와</td><td></td> 함께 사용할 수도 있습니다.<td>압력 및 ECG 신호의 연속 기록,</td></tr><tr><td>THT, Macroscope</td><td>, SciMedia</td><td></td><td>, Macroscopic 광학 설정. 세부 정보: 0.63X 대물렌즈(NA = 0.31), 2X 응축 대물렌즈, 결과 시야 = 3.1cm x 3.1cm, 초점 심도 = ~ 1.5mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>광학 매핑 카메라</td></tr><tr><td>정밀 LED 스포트 라이트</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED 광원</td></tr></tbody></table>

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ 핸들링은 정상적인 흥분-수축 결합에서 중요한 역할을 하며 비정상적인 SR Ca2+ 핸들링은 특정 유형의 부정맥에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 부정맥은 공간적으로 구별되는 창발적 현상이기 때문에 조직 수준에서 조사해야 합니다. 그러나 온전한 심장에서 SR Ca2+를 직접 조사하는 방법은 여전히 제한적입니다. 이 논문은 Langendorff-관류된 토끼 심장에서 막관통 전위(Vm) 및 자유 intra-SR [Ca2+]([Ca2+]SR)의 이중 광학 매핑을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법은 친화성이 낮은 Ca2+ 지표 Fluo-5N을 활용하는데, 이 지표는 세포 내 [Ca2+]([Ca2+]i)가 상대적으로 낮은 세포질에서 최소한의 형광을 보이지만 [Ca2+]SR이 밀리몰 범위에 있는 SR 루멘에서 상당한 형광을 나타냅니다. 이 접근법은 심장의 심외막 표면을 가로질러 SR Ca2+ 특성을 공간적으로 드러내는 것 외에도 Vm을 동시에 모니터링할 수 있는 뚜렷한 이점이 있어 Vm과 SR Ca2+ 사이의 양방향 관계와 부정맥 현상에서 SR Ca2+의 역할에 대한 조사를 할 수 있습니다.

도 1a는 이중 V의 m 및 SR 칼슘 매핑 광학 구성의 개략도를 나타낸다. 이 설정으로, V의 m 및 SR 칼슘 신호 (그림 1B)의 전체 스펙트럼 분리가있다. FLUO-5N 염료 로딩에 사용되는 이중 루프 관류 시스템의 도면은도 1c에 도시된다.도 1d는 관류 접시 심장의 가로 방향을 나타낸다. 대표적인 V의 M과 심장의 심 외막 표면에 다른 위치에서 지속적으로 조율 중에 SR 칼슘 2 + 광학 추적은 그림 2A에 표시됩니다. 이 설정으로 뷰의 광 필드는 X 31mm 및 시야 내의 중심부의 방향이도 2b에 도시되어 31mm이다. 활성화 맵은 또한도 2b에 도시되어 있으며, 각 픽셀 (P)의 활성화 시간을 선택함으로써 구성된다등시...

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 분리된 토끼 심장을 LOR 관류 상태의 온전한 형태로 유지하며, 근소포체 내 유리 칼슘과 세포막 전위를 동시에 광학적으로 매핑하는 것입니다. 이를 위해 먼저 토끼의 심장을 적출하고 대동맥에 캐뉼라를 삽입하여 역행성 lanor 관류를 수행합니다. 두 번째 단계로는 관류액에 흥분-수축 탈커플링제를 첨가하여 심장 수축을 제거하는 것입니다.다음으로, 관류 방식을 소량 재순환 루프로 전환하고 실온에서 저친화성 칼슘 지시약을 첨가합니다. 마지막 단계로 대용량 관류 루프를 사용하여 심장을 37 °C로 가온하고 전압 민감성 염료를 첨가합니다. 따라서 실험 중에 청색광으로 심장을 자극하고 고속 CMOS 카메라로 방출되는 빛을 측정함으로써 칼슘 및 막전위의 변화를 측정합니다.기존 방법들과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 연구자가 세포막 칼슘 신호의 간섭 없이 근소포체(sarcoplasmic reticulum, SR)의 단기 칼슘 동역학을 직접 조사할 수 있다는 점입니다. 또한, 세포막 전위가 SR 칼슘과 동시에 기록되기 때문에 SR 칼슘 처리의 역할이 부정맥에 기여하는 방식과 관련된 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 광학적 SR 칼슘 신호의 진폭이 매우 낮기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 칼슘 지시약의 적절한 로딩이 필수적입니다. 본 프로토콜을 수행하기 위해서는 갓 제조한 tyro solution을 준비해 두어야 합니다.4 L면 충분합니다. 농축 스톡 용액을 희석 없이 혼합하지 마십시오. 또한 텍스트 프로토콜 버블에 안내된 대로 다른 용액들을 미리 준비하고, tyros 공급액에 95% oxygen과 5% carbon dioxide를 버블링하며 가스 유량을 조절하여 용액의 pH를 7.4에 매우 가깝게 맞추십시오.용액은 실온 상태여야 합니다. 관류액을 여과하기 위해 11 micron 공극의 인라인 나일론 필터를 장착하여 L andorf 재순환 관류 시스템을 준비하십시오. 이제 약 2L의 산소화된 tyros로 메인 관류 시스템을 프라이밍하십시오.리저버 내의 용액을 포함하여 총 부피는 2L가 되어야 합니다. 다음으로, FLU-OH5-NAM을 위한 소량의 재순환 관류 루프를 만들기 위해, 용액 리저버를 우회하는 짧은 관류 라인을 준비하고 프라이밍합니다. 더 작은 재순환 시스템의 총 부피는 약 150mL가 되어야 합니다.압력 모니터링 시스템을 준비하려면, 압력 변환기를 관류 라인에 연결하고 변환기의 출력을 트랜스 브리지 증폭기에 연결하십시오. 이제 데이터 수집 시스템의 전원을 켭니다. ECG와 관류 압력을 지속적으로 모니터링하도록 설정하십시오.다음으로, 기저 관류압을 0 mmHg로 조정합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 광학 매핑 카메라의 정렬을 맞춥니다. 시작하기 위해 토끼를 고정하고 펜토바르비탈로 마취하며, 헤파린 1000 unit을 일시 투여합니다.토끼를 진정시키기 위해 눈을 가립니다. 뭉툭한 끝의 가위를 사용하여 흉골과 갈비뼈가 드러나도록 정중선 절개를 시작합니다. 검상돌기와 흉골 사이의 흉골을 절개합니다.다음으로, 심장에 손상을 주지 않도록 주의하며 흉골을 열고 갈비뼈를 벌려 심장을 노출시킵니다. 그런 다음 주변의 모든 혈관과 조직을 절개하여 심장-폐 블록 전체를 빠르게 제거합니다. 제거한 심장-폐 블록을 약 100 milliliters의 얼음처럼 차가운 tyro solution으로 옮깁니다.절제된 조직 블록에서 대동맥을 찾아 대동맥궁의 세 분지 바로 근위측에서 상행 대동맥을 절단합니다. 그런 다음 관류 시스템에 연결된 8게이지 캐뉼라로 대동맥에 캐뉼라를 삽입합니다. USP 0번 실크 봉합사를 사용하여 대동맥을 캐뉼라에 고정합니다.캐뉼라를 고정한 후, 기관, 폐 및 심외막 지방을 조심스럽게 절제합니다. 다음으로 승모판을 찾아 예리한 핀셋과 가위를 사용하여 판막엽 하나를 손상시키거나 제거합니다. 이렇게 하면 좌심실 내에 용액 정체가 일어나는 것을 방지할 수 있습니다.심장을 관류 챔버에 전면이 위를 향하도록 수평으로 담급니다. 캐뉼라를 사드 조각 위에 놓습니다. 사드 조각을 통과해 관류 접시의 실리콘 바닥으로 U자형 핀을 삽입하여 캐뉼라를 고정합니다.이렇게 하면 심장의 움직임을 방지할 수 있습니다. 이미징 중에 필요한 경우 작은 곤충 핀을 사용하여 심첨부를 고정할 수 있으며, 캐뉼라 삽입 중에 사용된 tyro 용액의 양을 측정하고 이를 새 용액으로 교체하여 전체 순환 용액의 양을 2 L로 유지하십시오. 이제 ECG 전극을 심장의 양측 조(bath)에 완전히 담그되, 심장과 접촉하지 않도록 하십시오.그런 다음 이것이 정상적인 lead I ECG 형태를 만드는지 확인합니다. 그동안 관류 유량을 25에서 35 milliliters per minute 사이로 조절하여 대동맥압을 60에서 70 millimeters of mercury로 유지합니다. 이제 실내 조명을 끄고, 최종 농도가 10에서 20 micromolar가 되도록 BLEs statin 스톡 용액 0.3에서 0.6 milliliters를 관류액에 첨가합니다.10분에서 15분 후면 심장 수축이 정지됩니다. 그 다음 소량 관류 시스템으로 전환하십시오. 성공적인 SR 칼슘 이미징의 핵심 중 하나는 flow five N am 염료를 적절하게 로딩하는 것입니다.높은 염료 농도와 실온 조건을 달성하기 위해 소량의 관류가 필요합니다. 세포질 내의 D 에스테르화를 방지하기 위해, 이제 500 µL의 flu O five N am 로딩 용액을 준비하여 500 µL의 road 용액과 혼합하십시오. 그런 다음 이를 PERFU eight에 첨가하십시오.다운로드를 45분 동안 진행한 다음, 순환식 항온수조를 켜서 시스템을 37 °C로 가온합니다. 다운로드가 1시간 동안 진행된 후, 다시 더 많은 양의 Perfu eight로 전환합니다. 다음으로, 50 µL의 전압 민감성 염료 RH 2 37을 1 mL의 따뜻한 tyros에 혼합합니다.약 5분에 걸쳐 이를 시스템에 천천히 주입하고 심장의 광학 매핑을 진행합니다. 먼저, PERFU 8 표면의 움직임을 줄이기 위해 광학 매핑 카메라의 초점을 적절한 영역에 맞춥니다. 용액 위에 커버스립을 띄웁니다.이제 심장에 균일한 조명이 제공되도록 LED 광선을 조정하십시오. 각 광학 기록에 대해 원하는 페이싱 프로토콜을 설정하십시오. 흥분광을 켜고 1~2시간 이내에 1~4초 분량의 데이터를 수집하십시오.누출된 염료로 인한 노이즈가 발생하면 실험을 종료합니다. 그런 다음 탈이온수로 시스템을 세척하십시오. 이어서 70% ethanol로 세척하고, 마지막으로 탈이온수로 다시 한번 헹구어 마무리합니다.설명된 프로토콜을 사용하여 transmembrane potential 신호와 sarcoplasmic reticulum 또는 SR calcium 신호의 분광학적 분리가 가능합니다. 지속적인 페이싱 중의 광학적 트레이스 또한 기록되었습니다. 이후 각 픽셀의 활성화 시간을 플롯하여 데이터로부터 활성화 맵을 구축하였습니다.등시성 그래프에서 두 신호 사이에는 일반적으로 8~10밀리초의 지연이 발생합니다. 이를 통해 다양한 페이싱 주기에서 이완기 SR 칼슘 부하와 수축기 SR 칼슘 방출 진폭의 상대적 변화를 정량화할 수 있었습니다. 베타 아드레날린 수용체 작용제인 isoproterenol을 처리한 후 병리적 SR 칼슘 핸들링이 관찰되었습니다.빨간색 화살표는 SR로부터 명확한 칼슘 누출이 일어나는 지점을 가리킵니다. 이러한 조건 하에서는 칼슘 매개 작용전위 유발이 발생할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 Lang-Endorf 관류 토끼 심장 모델에서 막전위와 SR 칼슘 신호의 동시 광학 매핑을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

연구

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Biology

생물학

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

이 보고서는 방법론과 스트레치 유발 심방 세동 동안 Langendorff - perfused 양의 마음을 그대로 좌심방의 전기적 자극을 동시에 endocardial와 epicardial 광학 매핑의 결과에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

스트레치 유도 심방세동 세동의 쉽 모델에서 고해상도 Endocardial 및 Epicardial 광학 매핑

이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

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그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

여기에, 우리는 높은 공간 및 시간 해상도, 마우스 우심방 특히 중국 - 심방 노드에서 전기 활동의 광학 매핑을위한 프로토콜을 제시한다.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

배우세요 랑겐도르프 관류 토끼 심장에서 막 횡단 잠재력과 근질 그물 칼슘을 동시에 광학 매핑하는 방법을. 이 기술은 심장 전기생리학 연구에 필수적인 SR 칼슘 역학을 직접 관찰할 수 있게 합니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑

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