폐 종양 세포 모집 분석 결과
2019년 2월 26일
이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.
이 방법은 전이의 분자 기계장치에 관하여 종양 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원격 기관 내의 종양 세포의 모집이 수량일 수 있다는 것입니다. 표준 프로토콜에 따라 배양 용기에서 형광 단백질 발현 루이스 폐 암종 또는 LLC세포를 제거하기 위해 비 효소 세포 해리 시약을 사용하여 시작합니다.
결과 세포 용액을 원심분리 전에 15밀리리터 원원형 튜브로 옮기고, 원심분리기는 세척당 PBS의 5밀리리터에서 펠릿을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 40 마이크로미터 모공 세포 스트레이너를 통해 세포를 필터링하고, 현탁액을 밀리리터 농도당 6세포로 10배로 희석한다. 그런 다음 29 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 주사기에 세포를로드하고 8- 10 주 된 C57-Black-6, 수컷 마우스의 꼬리 정맥에 100 마이크로 리터의 셀을 주입하십시오.
적절한 실험 적 끝점에서 가위를 사용하여 각 마우스의 복부 표면에서 피부를 제거하고 갈비뼈와 횡격막을 잘라 흉부 구멍을 노출시하십시오. 25 게이지 날개 주입 바늘과 튜브를 사용하여 오른쪽 심실을 통해 PBS의 15 밀리리터를 플러시하고 심장과 흉통을 제거하십시오. 집게로 기관을 잡고, 당겨, 기관 주위의 결합 조직을 해부, 폐를 수확.
그런 다음 PBS에서 폐를 세척하고 형광 현미경으로 시상에서 형광 세포의 시각화를 위해 하나의 엽을 분리합니다. 폐 조직을 소화하기 위해, 먼저 가위로 caudal 엽을 주사위, 10 밀리리터 주사기에 폐 조각을 배치. 플런저로 주사기를 닫고 소화용액 5밀리리터를 주사기에 흡인시키고, 플런저를 주사기 샤프트 안팎으로 이동하여 폐 조직이 용액 전체에 보급될 때까지 주사기 샤프트 안팎으로 이동합니다.
폐 슬러리를 50 밀리리터 튜브에 분배하고, 섭씨 37도와 150rpm에서 15분 동안 상호 셰이커에 티슈를 소화합니다. 인큐베이션의 끝에서, 폐 세포가 완전히 분산 될 때까지 나머지 조직을 삼각하고, 추가 30 분 동안 셰이커에 튜브를 반환합니다. 그런 다음 40 마이크로미터 모공 스트레이너를 통해 세포를 필터링하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
혈중 세포측정에 의해 고립된 폐 세포를 분석하기 위해, 실온에서 1분 동안 적혈구 용해 완충제 의 2밀리리터에서 펠릿을 재보중단하고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 그런 다음 신선한 PBS의 5 밀리리터에서 펠릿을 두 번 원심 분리하여 세척당 1 %소 세럼 알부민으로 보충합니다. 두 번째 원심 분리 후, 신선한 PBS 플러스 BSA의 1 밀리리터에서 펠릿을 재연하고, 혈동 세포에 의해 종양 세포의 정량화를 위한 새로운 40 마이크로미터 모공 스트레이너를 통해 세포를 필터링한다.
폐는 주입 후에 2 시간 많은 GFP-LLC 세포를 제출합니다, 세포의 대다수는 24 시간 안에 폐에서 사라지고 있습니다. 빨간색 필터 내에서 감지되는 형광 반점은 셀 수에서 제외되어야 합니다. 폐내GFP-LLC의 수를 확인하기 위해, 로브 중 하나는 입증된 바와 같이 유동 세포 측정 분석에 사용될 수 있다.
이 절차를 시도하는 동안, 냉동 단면 절차는 종양 세포의 정확한 위치를 관찰하기위한 보다 정확한 방법입니다 기억하는 것이 중요합니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 원고는 종양 전이 동물 모델에서 폐 내의 종양 세포 축적량을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 원격 장기 내로의 종양 세포 모집을 정량화함으로써 전이의 분자적 기전에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 세포생물학
배경
- 종양 전이를 이해하는 것은 암 연구에 있어 매우 중요합니다.
- 종양 세포의 축적량을 정량화함으로써 중요한 생물학적 통찰을 얻을 수 있습니다.
- 암 진행 연구에는 동물 모델의 사용이 일반적입니다.
- 형광 단백질을 발현하는 세포를 이용하면 추적 및 정량화가 용이합니다.
연구 목적
- 폐 내 종양 세포 축적량을 정량화하는 방법을 개발한다.
- 전이 모델에서 종양 세포의 보충(recruitment)을 조사한다.
- 전이의 기저에 있는 분자적 기전에 대한 이해를 높인다.
사용된 방법
- 비효소성 세포 해리 시약의 활용.
- PBS 내 세포 펠릿의 원심분리 및 세척.
- 40-μm 공경의 세포 스트레이너를 통한 세포 여과.
- 희석된 세포 현탁액의 마우스 꼬리 정맥 주입.
주요 결과
- 본 방법은 종양 세포 축적의 효과적인 정량을 가능하게 합니다.
- 생체 내(in vivo)에서 종양 세포 추적의 가능성을 입증하였습니다.
- 종양 세포 모집의 역학에 대한 통찰을 제공하였습니다.
- 전이 과정의 이해에 기여하였습니다.
결론
- 이 방법은 종양 생물학을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
- 이는 동물 모델에서 전이를 조사하는 능력을 향상시킵니다.
- 향후 연구에서는 이 기술을 기반으로 치료 표적을 탐색할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 분석법은 원격 장기로의 종양 세포 모집을 정량적으로 평가할 수 있게 하여, 전이 표적 약물 발견 과정에서 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원합니다. 이 방법은 원발성 종양의 침습 단계를 우회함으로써, 전임상 표적 검증에 필수적인 기질 상호작용 및 혈관 외 유출(extravasation) 사건에 집중합니다. 본 방법은 체내(in vivo)에서 항전이 화합물을 평가하기 위해 재현 가능하고 확장 가능한 판독 결과를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 원격 장기의 전이에 기여하는 기질의 역할에 관한 치료 가설을 탐구합니다.
- 운영적 가치: 주입 후 폐 내의 종양 세포 축적량을 정량화하여 기능적 타겟 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 종양 세포 모집 역학에 미치는 화합물의 효과를 측정함으로써 포트폴리오 우선순위 결정을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 화합물 스크리닝 캠페인을 위해 유세포 분석을 통한 표준화된 정량적 결과물을 생성합니다.
- 재현성: 정의된 세포 농도와 주입 부피를 사용하여 일관된 전이 모델링을 보장합니다.
- 확장성: 표적 위험 제거를 위한 멀티웰 처리 및 고함량 분석(high-content analysis)과 호환됩니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 장기 특이적 정착 기전을 연구하기 위해 폐 미세전이를 모델링합니다.
- 중개적 연속성: 발견된 연구 결과를 항전이 제제의 전임상 검증으로 연결합니다.
- 위험 조정 결정: 표지된 종양 세포 수의 감소를 바탕으로 진행/중단(go/no-go) 기준을 설정합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
타겟 가설 검증부터 리드 최적화까지의 신약 발견 연속체 내 단계들에 위치하여, 전이 조절 화합물의 정량적 평가를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 전이 니치(metastatic niches) 내의 종양-기질 상호작용에 대한 기전 연구를 지원합니다.
- 스크리닝: 전이 분석에서 히트(hit) 검증을 위한 형광 기반의 정량적 판독 값을 제공합니다.
- 분석: 유세포 분석을 통해 용량-반응 및 통계 분석을 위한 계수 가능한 종양 세포 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: 생체 내(in vivo)에서 표지된 세포의 확산을 추적함으로써 바이오마커 전략과 연계합니다.
- 기업적 재사용: 프로젝트 간 전이 기전 연구를 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 정량화 가능한 장기 특이적 모집을 통해 전이 경로의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 종양 세포 전달 및 조직 처리 과정을 표준화하여 실험실 간 재현 가능한 비교를 가능하게 합니다.
- 전략적 가치: 전이 표적 치료제의 초기 리스크 제거를 가능하게 하여 자본 효율성을 높입니다.
- 포트폴리오 영향: 전임상 전이 억제 데이터에 기반하여 리스크가 조정된 개발 진행 결정을 용이하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 마우스 꼬리 정맥 주사 및 조직 해리 기술에 대한 전문 지식이 필요함.
- 유세포 분석기 장비 및 형광 보정 제어 장치에 의존함.
- 연구팀 간의 표준화된 세포 준비 프로토콜이 필요함.
- 과도한 폐 축적으로 인한 혼란 신호를 방지하기 위해 세포 용량의 최적화가 수반됨.
- 폐 축적량 정량화에 국한되며, 원발성 종양 침범이나 이후의 전이성 성장 단계는 포착하지 못함.
