Name: 헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 배우세요 머리카락에서 유래한 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 방법을. 에피소말 벡터를 활용한 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술 지원을 해준 Harene Ranjithakumaran과 Stacey Jackson에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council, R.C.B. Wong, A. Pébay), 멜버른 대학교(R.C.B. Wong), 호주 망막(Retina Australia, R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) 및 호주 안과 연구소(Ophthalmic Research Institute of Australia, R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 호주 연구 위원회 미래 펠로우십(A. Pébay, FT140100047), 크랜본 재단 펠로우십(RCB Wong); 미국 국립보건원(National Institutes for Health, R.C.B. Wong, S.S.C. Hung)의 교내 자금 지원 및 빅토리아 주 정부의 운영 인프라 지원.

개인의 인간의 머리카락 샘플의 수집은 호스트 기관에서 인간의 연구 윤리위원회 윤리의 승인을 필요로하며, 제도적 지침에 따라 수행해야합니다. 뽑아 머리에서 각질 1. 분리 <ol><li> 얼음 O / N에 (즉, 마트 리겔) 해동 세포 외 기질 (ECM) 솔루션입니다. </li><li> 사전 냉장 피펫 팁을 사용하여, 냉장 DMEM / F12 배지 12 ml를 200 μL ECM 솔루션을 추가합니다. 코트의 각 웰에 희석 된 ECM 용액 1 ㎖와 함께 12 웰 플레이트. 37 ° C에서 코팅 된 플레이트 O / N을 품어. 사용하기 전에 미리 예열 DMEM / F12 배지로 코팅 된 판을 씻으십시오. </li><li> 머리카락의 뿌리 부근에 손가락을 배치 한 빠르고 부드러운 동작으로 머리를 따 버릴에 의해 개인의 머리에서 차 인간의 머리카락을 수집합니다. 각 수집 머리를 그대로 모낭이 포함되어 있는지 확인하고 헤어 유엔의 성장 단계를 결정하기 위해 확인해부 현미경 (그림 1) 데르. <ol><li> 각질 세포를 추출하는 각 개인으로부터 5 ~ 10 성장기의 머리카락을 수집합니다. 프로세스는 각질 세포의 성공적인 유도를 보장하기 위해 가능한 한 빨리 털을 뽑아. 참고도 1은 성장주기의 다른 단계에서의 모발 형태를 도시한다. 성장기 모발 ORS 알려진 모발의 길이를 둘러싸는 상피의 가시 외층과, 성장 단계에있다. 한편, 휴지기 모발 휴식 단계에서 머리를 나타내고 가시 ORS이 없지만 휴지기 융기 알려진 모발의 뿌리를 덮는 셀 명확한 공을 갖는다. </li></ol></li><li> 실온에서 5 분간 씻어 항생제 믹스 10 ㎖를 포함하는 페트리 접시에 머리 샘플을 놓습니다. </li><li> 머리 샤프트​​의 1cm - 멸균 가위와 집게를 사용하여, 그대로 모낭 주위에 0.5으로 머리 조각을 떠나, 과도한 헤어 샤프트를 잘라. </li><li> 조심스럽게 TRA겸자를 이용하여 ECM 코팅 플레이트의 각 웰에 1 nsfer 머리 단편. </li><li> 모발 샘플 - (200 μL ~ 100) 1 mL를 피펫을 사용하여, 녹아웃 세럼 교체 (KSR) 매체의 약 3 방울을 추가합니다. 주 : 부착 및 후속 각질 생장을 허용하도록 플레이트 표면에 밀착 머리 단편 유지. 이 단계에서 과도한 미디어를 추가 할 수있다 머리 조각이 떠있는 원인과 성공적인 헤어 첨부 파일의 기회를 감소시킨다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 머리카락 샘플을 품어과 모낭은 / N을 O를 첨부 할 수 있습니다. 촉촉한 모발 샘플을 유지하기 위해 - (200 μL ~ 100) 다음 날, 부드럽게 KSR 매체의 또 다른 3 방울을 추가합니다. </li><li> 모낭이 성공적으로 연결되었는지 확인하기 위해 매일 머리 샘플을 관찰한다. 일반적으로 모낭의 부착 1-3 일 이내에 알 수있다. 잔털이 높은 가지고 두꺼운 머리카락, 잔털에 비해 부착 일반적으로 쉽게경향은 첨부 파일 프로세스를 방해하는 떠. <ol><li> 머리가 코팅 된 플레이트에 부착 한 후, 웰에 KSR 매체의 500 μl를 추가합니다. 머리 샘플이 단단히 연결되지 않았을 수 있습니다으로 매체를 추가 할 때 좀 더주의를 기울여. 이 시점에서, 2 일마다 미디어를 변경합니다. 참고 : 케 라티노 사이트의 outgrowths는 3-7일 (그림 2A-B) 후 머리 조각의 ORS 지역에서 볼 수 있어야합니다. 각질은 다음 섹션에 설명 된대로 세포를 계대 14 일 전으로 성장하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol> 2. 유지 관리 및 각질과 Passaging <ol><li> 사전 코트 코팅 매트릭스 키트를 사용하여 6 웰 플레이트. 코팅 매트릭스 솔루션의 6.8 μL 뒤에 아니라 각 키트에서 희석 매체의 680 μl를 추가합니다. 플레이트에 도포 매트릭스 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 플레이트를 흔들어. </li><li> 코팅 된 플레이트는 실온에서 30 분 동안 품어하도록 허용합니다. 제거각질 세포의 도금하기 전에 코팅 매트릭스 솔루션입니다. </li><li> 37 ℃에서 2-5 분 동안 웰 당 0.25 % 트립신 500 μL와 단일 세포 현탁액 내로 해리 각질. 매체를 포함하는 혈청 (예, 우 태아 혈청 (FBS) 배지) 500 μL와 트립신을 비활성화하고 멸균 15 ㎖의 튜브에 수집한다. 멸균 집게를 사용하여 머리 조각을 제거합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 수확 세포의 수를 결정합니다. </li><li> 200 X g에서 3 분 동안 세포를 원심 분리기. PBS를 반복 원심 분리와 세포를 씻으십시오. PBS를 대기음 신선한 각화 세포 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 각질 세포 배지의 존재 ECM 코팅 플레이트의 한 웰 플레이트에 4 × 10 아래 4 각화 세포. 5 % CO 2 (그림 2C)와 37 ° C 배양기에서 각질 세포를 유지합니다. 문화가있는 경우 ~ 용지를 80 % 합류를 매일 통과 세포를 변경, WHI채널은 각질 세포의 통과 번호와 확산 속도에 따라 약 2-7일 걸릴 수 있습니다. 유래 각질 세포는 표준 느린 냉동 냉동 보존 방법 (16)를 사용하여 충분한 냉동 주식을 생성하기 위해 확장되어야한다. 참고 : 설명 배양 조건은 전형적인 조약돌 형태 (그림 2C)와 각질 형성 세포의 균일 한 인구의 확장을 지원합니다. 때때로, 몇 가지 차별화 된 대형 평면 형태와 각질 세포 및 복제 성 잠재력을 잃었다는 문화에서 관찰 할 수있다. 각화 세포의 특성화 cytokeratin 14 대해 항체를 이용한 면역 염색에 의해 수행 될 수는 앞서 ​​설명한 17. 설립 각질 세포주는 또한 시판 키트를 사용하여 1-3 통로 이후 마이코 플라즈마에 대해 시험한다. </li></ol> 에피 솜 벡터를 사용하여 각질 형성 세포에서 hiPSCs의 3 세대 <ol><li> 6 웰 플레이트와 사전 코트0.1 % 젤라틴 (2 ㎖ / 웰). RT에서 적어도 20 분 동안 코트에 젤라틴을 허용. </li><li> 리 프로그래밍 실험, 사용 각질 세포는 더 이상 통과 6.보다 해리는 37 ° C에서 2-5 분 동안 잘 당 0.25 % 트립신 1 ml의 단일 세포 현탁액에 각화 없습니다. 혈청 함유 매체 (예를 들어, FBS 배지)의 1 ml의 트립신 불활 및 15 ㎖의 튜브에 수집한다. </li><li> 각질 세포 배지에서 200 XG와 재현 탁 세포에서 3 분 동안 원심 분리기 세포. 젤라틴 화 판 O / N 잘 플레이트 당 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 각질. </li><li> 다음 날 (0 일)에서 세포 50-60 %의 합류 있는지 확인하기 위해 판을 확인합니다. 참고 : 각질 세포가 ~ 50 %의 합류가 아니라 형질 전환 후 성장하지 않을 수보다 작은 경우. </li><li> 0 일에, 2 μg의 총 플라스미드 DNA에 8 ㎕를 형질 전환 시약의 비율을 이용하여 각질 세포에서 에피 좀 벡터의 재 프로그래밍 형질 전환을 수행한다.<ol><li> 4 플라스미드 (pCXLE-eGFP는, pCXLE-hOct3 / 4 shP53F, pCXLE - HSK, pCXLE - 훌)의 각각 0.5 μg의를 타고 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM) 100 ㎕에 희석. 주 : 플라스미드 pCXLE-eGFP는 각질 세포는 형질에서 효율을 모니터링하기 위해 사용되며, 성공적 프로그래밍에 필요한 것은 아니다. </li><li> 희석 된 DNA와 형질 전환 시약의 8 μl를 추가합니다. 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. DNA 반응 혼합물을 실온에서 15 분 동안 휴식을 흐트러 허용. </li><li> 신선한 매체와 각질 세포 매체를 교체합니다. </li><li> 부드럽게 4 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기에서 배양 각질 DNA 반응 혼합물을 추가 배양한다. 참고 : 그것은 그들이 낮은 생존 후 형질을 나타내는으로 각질 세포에 장기간 형질 전환 O / N을 수행하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 4 시간 포스트 형질 전환 한 후, 신선한 매체와 각질 세포 매체를 교체합니다. </li></ol></li><li> 1 일에 (1 일 이후 트랜스fection), 각질 세포 배지를 변경하고, 형광 현미경 하에서 eGFP는 양성 세포의 비율을 추정하여 형질 감염 효율을 확인한다. 전형적&gt; 60~70% 형질 효율이 프로토콜을 이용하여 일차 각질 세포에 대해 관찰된다. </li><li> 단계 3.5의 설명에 따라 2 일에서 형질를 반복합니다. 두 개의 연속 된 형질 감염은 일반적으로&gt; 90 %의 형질 전환 효율을 달성하는 것이다. 각질 세포 문화는 일반적으로 두 번째 형질의 말에 합류에 도달한다. <ol><li> 각 프로그래밍 반응에 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 피더 10cm 접시를 준비합니다. 이전 18 설명 된대로 mitotically 불 활성화 MEF 피더를 준비합니다. </li><li> 프리 코트를 적어도 20 분 동안 0.1 % 젤라틴을 5 ml와 10cm 접시. FBS 배지에서 10cm 접시 당 플레이트 4 × 10 6 mitotically 비활성화 MEF. 세포가 정착 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 O / N을 첨부 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 3 일에, HAR단계 3.2 및 3.3에 설명 된대로 0.25 % 트립신과 각질을 가득. KSR 배지에서 각질 세포를 재현 탁하고 KSR 배지 MEF 10cm 접시에 피더 6 웰 플레이트의 한 웰에서 각질 세포의 90 %를 접시. </li><li> 이후 4 일부터 매일 KSR 매체를 변경합니다. <ol><li> 또한 18 일 후, 모든 둘째 날 문화 매체를 교체합니다. 참고 : 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 닮은 정의 된 경계와 hiPSC 식민지가 날 14에서 등장 반면 비 재 각질 세포가 증식 중단됩니다 - (21). </li></ol></li><li> 이후의 날 (21)로부터 수동 절개로 hiPSC 식민지를 분리합니다. 긴밀 클러스터 만 명확하게 다른 사람에서 분리 hiPSC 식민지를 선택하고 있습니다 hiPSC 식민지를 피하십시오. 참고 : hiPSC 식민지 이전 포착 할 수 있지만 정의 된 경계와 식민지 작은 식민지 크기 주어진 이전 시점에서 명확하지 않을 수 있습니다. 재 프로그래밍 효율은 DIFF에 따라 다를 수 있습니다erent 환자의 각질 세포 및 또한 이러한 통로 번호 또는 각질 세포의 증식 속도와 같은 다른 요인들에 의해 영향을 받는다. <ol><li> hiPSC 식민지의 수동 해부를 들어, 해부 현미경 hiPSC 식민지를 잘라 26G 바늘을 사용합니다. 길이 600 μm의 - (300)의 주위에 작은 조각으로 hiPSC 식민지를 잘라. hiPSCs의 클론 라인을 설정하는 새로운 MEF 공급 판 (2.5 × 10 4 MEF / ㎠)로 한 hiPSC 식민지에서 조각을 전송합니다. 처음에, 문화는 12 웰 플레이트 또는 기관 배양 요리 잘 하나에 각 hiPSC 클론 라인은 다음 6 웰 플레이트 형식으로 확장합니다. </li><li> MEF 피더에 KSR 매체에 hiPSCs의 설립 클론 라인을 유지한다. 문화 일단 70에 도달 - hiPSC 식민지와 80 %의 포화 상태 ~ 직경 1.5 mm, 제조업체의 지시에 따라 표준 효소 계대 방법 (Accutase, 스파 아제 (Dispase) 또는 콜라게나 IV)를 사용하여 통과 hiPSCs. </li></ol></li><li> 설립 hiPSC 라인을 특성화S는 만능과 시험 관내 및 / 또는 생체 내 13, 19, 21, 23의 3 배엽 세포의 대표로 분화 할 수있는 능력을 확인합니다. 또한, 시판 키트를 사용하여 마이코 플라스마 정기적으로 설립으로 테스트합니다 hiPSC 라인은 무균 있는지 확인합니다. 정기적으로 핵형 또는 어레이 기반 복제 수 변이 (CNV) 분석에 의한 hiPSC 라인의 게놈 안정성을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol>

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<li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

환자 별 hiPSCs의 생성은 시험관 내에서 질환 세포 유형의 발병 기전 연구를위한 독특한 방법을 제공하고, 또한 질환의 표현형을 구출 할 신규 한 분자를 식별하는 약물 스크리닝에 대한 플랫폼을 제공한다. hiPSCs를 이용하여 질병이 모델링 접근법은 긴 QT 증후군, 헌팅 톤병, 파킨슨 질환 및 근 위축성 측삭 경화증 (22)을 포함하여 다양한 질환에 대한 유망한 결과를 수득했다. 여러 이니셔티브는 이미 미국, 유럽, 호주, 중국, 한국, 일본 (23, 24)에 컨소시엄을 포함하여 환자 별 hiPSCs의 대규모 라이브러리를 구축 할 진행되고있다. 여기서 헤어 유래 케 라티노 사이트에서 hiPSCs을 확립 프로토콜 촉진하고 질병 특정한 hiPSCs의 대규모 라이브러리의 구축을 빠르게 추적 할 수있는 잠재력을 가지고있는 기재되어있다. 우선, 에피 솜 :이 프로토콜은 두 개의 이점을 제공한다이 프로토콜에 사용되는 시스템은 여...

유도 된 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)의 발견은 환자 맞춤형 줄기 세포의 생성을위한 1-3 가능한 방법을 제공하는 재생 의료 분야 혁명을 일으켰다. hiPSCs 성공적 4,5- 섬유 아세포, 조혈 세포 6,7, 소변 8에서 신장 상피 세포와 각화 9,10 포함하는 다양한 종류의 체세포에서 생성되었다. 현재까지, 피부 섬유 아세포 및 조혈 세포는 환자 별 iPSCs를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 셀의 소스를 나타낸다. 틀림없이, 이것은 피부 생검과 채혈 일상 의료 절차 및 여러 나라에서 확립 된 환자의 혈액 샘플의 피부 또는 대형 바이오 뱅크 있다는 사실에 기인한다. 혈액 세포 및 침윤성 추출 방법을 필요로 피부 섬유 아세포는 달리, 케 라티노 사이트는 hiPSC 생성에 쉽게 접근 세포 유형을 나타낸다. KeratinocytES는 피부의 외관 상피 장벽을 형성하고 또한 손톱 및 모발 (11)에서 발견되는 케라틴 풍부한 상피 세포이다. 특히 각질 세포가 모낭 내부 근초 (IRS) 셀 (12,도 1)와 함께 모발 덮여 셀룰러 외부 층의 외측 근초 (ORS)에서 찾을 수있다. 헤어 컬렉션 의료인의 도움을 필요로하지 않는 간단한 절차이므로 환자 수집 크게 hiPSC 생성을위한 환자 샘플의 수집을 용이하게 할 실험실에 자신의 머리 샘플을 보낼 수 있도록, 그 기회를 제공한다. 표피 각화 세포도 생성 hiPSC 9, 13의 시작으로 각질 형성 세포를 사용하는 장점에 추가하여 섬유 아세포에 비해 높은 효율 및 프로그래밍 빠른 프로그래밍 속도론있다. 또한, hiPSCs 또한 모낭 내의 다른 세포 집단을 사용하여 생성 될 수 있고,모낭 14,15 바닥에있는 모유두 세포를 포함. 헤어 유래 세포를 사용하여 IPSC 세대의 이전 보고서들은 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 기반의 프로그래밍 방법 9,14,15을 사용합니다. 그러나 이러한 바이러스 성 방법은 재 프로그래밍시 외국 유전자의 바람직하지 않은 게놈 통합을 소개합니다. 비교하여, 에피 솜 벡터의 사용은 통합 프리 iPSCs 4를 생성 가능한, 비 바이러스 프로그래밍 방법을 나타낸다. 우리는 이전에 효과적으로 에피 솜 벡터 (13)를 사용 hiPSCs으로 각질 세포를 재 프로그램하는 간단하고 비용 효율적인 비 바이러스 성 방법을 개발 하였다. 여기에 우리가 뽑아 머리, 확장 및 각질 세포의 유지 보수 및 hiPSCs를 생성 이후의 재 프로그래밍에서 각질 세포의 유도를 포함하여 각질 세포에서 파생 된 hiPSCs,의 생성에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>항생제 혼합물:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250ng/ml 항진균 암포테리신 B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>항생제 혼합물은 PBS로 구성됩니다.</td></tr><tr><td>1X 페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로젠</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>인비트로젠</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 대체품 (KSR) 매체:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>KSR 배지는 사용 전에 Stericup(Millipore, #SCGPU05RE)을 사용하여 여과합니다. bFGF는 사용 전에 배지에 새로 첨가합니다.</td></tr><tr><td>20% 녹아웃 세럼 대체품 (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12를 glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1회; MEM 비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.5&배; 페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.1 mM &beta;-메르캅토에탄올</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ng/ml, 신선 추가)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>각질 세포 배지:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 60&nbsp의 EpiLife; &마이크로; M 칼슘</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1&times; 인간 각질 세포 성장 보충제 (HKGS)</td> <td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) 매체 : &nbsp;</td><td></td><td></td><td>FBS 배지는 사용 전에 Stericup(Millipore, #SCGPU05RE)을 사용하여 여과합니다.</td></tr><tr><td>10% 소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>세포외 기질 (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel 재고 및 보관 -80°C; C 다음 제조업체' s 지침. Matrigel의 재고 농도는 배치마다 약간씩 다릅니다(~9mg/ml). 200&micro를 사용하는 것이 좋습니다. L 12웰 플레이트(~150&micro; g/well).&nbsp;</td></tr><tr><td>코팅 매트릭스 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>pCXLE-eGFP는 transfection 효율을 모니터링하는 데만 사용되며 재프로그래밍에는 필요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>애드진</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>애드진</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>애드진</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>트랜스펙션 시약 Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴(돼지 껍질에서 추출)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>증류수에 0.1% 젤라틴을 구성합니다. 사용하기 전에 오토클레이브.&nbsp;</td></tr><tr><td>환원된 혈청 배지: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포(MEF) 공급</td><td></td><td></td>기 <td>MEF는 앞서 설명한 바와 같이 미토마이신 C 처리 또는 방사선 조사에 의해 비활성화될 수 있습니다 16.</td></tr><tr><td>26G 니들</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate (조직 배양 처리)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate (조직 배양 처리)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dish (조직 배양 처리)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>에서 사용Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>TRA-160 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>5 &micro 사용; g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>5 &micro에서 사용; g/ml</td></tr><tr><td>NANOG 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>10 & micro에서 사용; g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert 감지 키트</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

최근 재프로그래밍의 발전으로 체세포를 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)로 바꿀 수 있게 되었습니다. 환자 특이적 hiPSC를 사용한 질병 모델링을 통해 발병의 기저 메커니즘을 연구할 수 있으며, 치료 옵션을 개선하기 위한 체외 약물 스크리닝 및 유전자 요법 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 재생 의학을 위한 hiPSC의 유망한 잠재력은 최근 몇 년 동안 iPSC에 대한 출판물 수(>7000건)가 증가하고 있는 것에서도 분명합니다. 피부 섬유아세포, 조혈 세포 및 표피 각질세포를 포함하여 서로 다른 계통의 다양한 세포 유형이 hiPSC 생성에 성공적으로 사용되었습니다. 피부 생검 및 혈액 채취는 hiPSC 생성을 위한 체세포 공급원으로 많은 실험실에서 일상적으로 수행되지만, 모발 각질 세포의 수집 및 후속 유도는 덜 일반적으로 사용됩니다. 모발 유래 각질세포는 환자로부터 세포 샘플을 얻기 위한 비침습적 접근 방식을 나타냅니다. 여기에서는 뽑은 모발에서 각질 세포를 유도하기 위한 간단한 비침습적 방법을 간략하게 설명합니다. 또한 episomal 벡터를 사용하여 통합 없는 hiPSC를 생성하기 위한 각질 세포의 유지 관리 및 후속 재프로그래밍에 대한 지침을 제공합니다.

성장기 (성장 단계), 퇴행기 (회귀 상) 및 휴지기 (나머지 상) (20, 21) : 머리는 3 가지 성장주기의 단계를 통해 간다. 성장기 모낭은 상피 세포의 여러 계층을 포함, 이들 층은 ORS, IRS 및 모간 (도 1)를 포함한다. 성장기의 머리는 결국 ORS 헤어 샤프트 차별화 종료의 사멸로 표시됩니다 퇴행기 단계로 전환 겪는다. 마지막으로, 세포 사멸의 멈추고 휴지기 모낭이 휴지기 특성과 정지가되는 휴지기 단계에 퇴행기 모발 전환 (20, 21)를 팽창. 그림 1은 휴지기 머리와 성장기 모발의 형태를 보여줍니다. 우리는 일반적으로 각질 세포의 유도를위한 성장기 머리를 사용합니다. 이 프로토콜에 따라, 각질 세포의 outgrowths은 빠르면 3 일 정도 머리 부착 (그림 2A) 후에 관찰 할 수 있으며 페이지에 계속roliferate <...

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

이 프로시저의 전체적인 목표는 모발 유래 각질 형성 세포를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 기증자로부터 모발을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 각질 형성 세포의 성장을 촉진하기 위해 모발을 플레이팅하는 것입니다.다음으로, 각질 형성 세포를 in vitro에서 유지 및 증식시킵니다. 마지막 단계는 에피좀 재프로그래밍 방법을 사용하여 각질 형성 세포를 인간 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 것입니다. 최종적으로, 면역조직화학 염색을 통해 만능성 마커의 발현을 확인하여 인간 IPS 세포를 분리하고 특성을 분석할 수 있습니다.레트로바이러스 또는 렌티바이러스 방법과 같은 기존 방법보다 이 방법이 갖는 전반적인 장점은 에피소말 인자를 사용함으로써 원치 않는 트랜스진의 삽입을 피할 수 있다는 점입니다. 생성된 줄기세포의 게놈 내로 통합되는 것을 방지합니다. 먼저 세포외 기질 용액 바이알을 얼음 위에서 하룻밤 동안 해동하여 시작하십시오. 다음 날 아침, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 냉각된 DM F 12 배지 12 milliliters에 용액 200 microliters를 첨가하십시오.희석된 세포외 기질 용액 1 mL를 12-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 웰을 기질로 코팅합니다. 다음으로, 손가락을 모발 뿌리 가까이에 대고 한 번의 빠르고 부드러운 동작으로 모발을 뽑아 기증자의 두피에서 일차 인체 모발을 채취합니다.수집된 각 모발에 온전한 모낭이 포함되어 있는지 확인합니다. 해부 현미경 아래에 모낭을 놓고 각 모발의 성장기를 판별합니다. 케라틴성 얼음을 추출하기 위해 각 개인당 5~10개의 항원 모발을 수집합니다.T 상과 달리 항원 상은 여러 층의 상피로 구성되어 있습니다. 모발 샘플을 10 milliliters의 항생제 혼합액이 담긴 페트리 접시에 5분 동안 넣어둔 다음, 상온에서 PBS로 5분 동안 세척하십시오. 다음으로, 멸균 핀셋으로 모발을 잡고 멸균 가위를 사용하여 과도한 모간 부분을 잘라내어, 손상되지 않은 모낭과 약 0.5에서 1 centimeter의 모간이 포함된 모발 조각만 남깁니다.세포외 기질(extracellular matrix)이 코팅된 플레이트의 각 웰에 모발 조각을 하나씩 조심스럽게 옮깁니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 모발 샘플이 담긴 웰에 약 100에서 200 µL의 혈청 대체 배지를 한 방울씩 떨어뜨립니다.그 다

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

이 프로토콜은 녹아웃 SR의 cryopreservation 매체 인간의 IPS 세포를 cryopreserving 완벽한 마네 SR 공급기 무료 (KSR - FF) 중간 또는 피더 기반 마네의 SR 매체에서 이러한 세포를 복구하는 자세한 절차를 설명합니다.

Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

이 문서는 인간의 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포의 분리와 문화에 대한 강력한 프로토콜을 제공합니다.

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 피부 구조 및 기능을 복제하기 위해 평면, 생리학적으로 관련된 공기-액체 계면 배양 시스템을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 모낭을 포함하는 피부 오가노이드를 생산하는 방법을 간략하게 설명합니다.

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

배우세요 머리카락에서 유래한 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 방법을. 에피소말 벡터를 활용한 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

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