헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 모발 유래 각질 세포를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 기증자로부터 모발을 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 각질 세포의 성장을 촉진하기 위해 모발을 플레이트로 감싸는 것입니다.

다음으로, 각질 세포는 in vitro에서 유지 및 확장됩니다. 마지막 단계는 에피솜 재프로그래밍(episomal reprogramming) 방법을 사용하여 각질세포를 인간 유도 만능 줄기세포로 재프로그래밍하는 것입니다. 궁극적으로 human IPS cell은 만능 마커의 발현을 보여주기 위해 면역조직화학을 사용하여 분리하고 특성화할 수 있습니다.

레트로바이러스 또는 렌티바이러스 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 방법의 전반적인 장점은 에피솜 인자를 사용함으로써 바람직하지 않은 전이유전자를 피할 수 있다는 것입니다. 생성된 줄기세포의 게놈에 통합 세포외 기질 용액이 담긴 바이알을 얼음 위에서 하룻밤 동안 해동하는 것으로 시작합니다. 다음 날 아침, 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 12ml의 냉각된 DM F 12 배지에 200마이크로리터의 용액을 추가합니다.

12개의 각 웰에 희석된 세포외 기질 용액 1ml를 추가합니다. 웰 플레이트를 플레이트하고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양하여 웰을 매트릭스로 코팅합니다. 다음으로, 손가락을 모발 뿌리 가까이에 놓고 한 번의 빠르고 부드러운 동작으로 머리카락을 뽑아 기증자의 머리에서 1차 인간의 머리카락을 수집합니다.

수집된 각 모발에 온전한 모낭이 포함되어 있는지 확인하십시오. 해부 현미경으로 모낭을 놓고 각 모발의 성장 단계를 측정합니다. 각 개체에서 5-10개의 항원 털을 수집하여 각질 얼음을 추출합니다.

항원기는 T기와 달리 여러 층의 상피를 포함합니다. 모발 샘플을 10ml의 항생제 혼합물이 들어 있는 페트리 접시에 5분 동안 넣은 다음 실온에서 PBS로 5분 동안 씻습니다. 그런 다음 멸균 집게로 모발을 잡고 멸균 가위를 사용하여 여분의 모간을 잘라내고 모낭이 손상되지 않은 모발 조각과 0.5-1cm 정도의 모간을 남깁니다.

하나의 모발 조각을 세포외 기질 코팅된 플레이트의 각 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 멸균 겸자를 사용하여 약 100-200 마이크로 리터의 혈청 교체를 만집니다. 모발 샘플이 들어있는 각 웰에 매체를 적가합니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 넣고 다음날 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 모낭이 부착되고 5% 이산화탄소가 되도록 합니다. 100-200 마이크로 리터의 세럼 대체품을 부드럽게 첨가하고 모발 샘플을 촉촉하게 유지하기 위해 중간 정도를 떨어뜨립니다. 매일 모발 샘플을 확인하여 모낭이 플레이트에 성공적으로 부착되었는지 확인하십시오.

부착되면 웰에 500마이크로리터의 매체를 부드럽게 추가합니다. 이틀에 한 번씩 미디어를 교체합니다. Preco는 콜라겐이 있는 6개의 벽 플레이트입니다.

유형 1은 키트에서 각 웰로 680 μl의 희석 매체에서 코팅 매트릭스 키트와 같은 전처리를 사용한 다음 6.8 μl의 코팅 매트릭스 용액을 사용합니다. 균일한 코팅을 위해 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 코팅된 플레이트를 각질세포를 플레이팅하기 전에 실온에서 30분 동안 배양합니다.

코팅 용액을 제거하고, 웰당 500마이크로리터의 0.25% 트립신을 첨가하여 배양 중인 각질세포를 단일 세포 현탁액으로 해리한 다음 섭씨 37도에서 2-5분 동안 플레이트를 배양합니다. 세포가 플레이트에서 분리되면 500마이크로리터의 혈청 함유 배지로 트립신을 비활성화하고 멸균된 15ml 튜브에 세포를 수집합니다. 멸균된 집게를 사용하여 머리카락 조각을 제거하고 세포를 펠렛으로 만든 다음 다시 사용합니다.

신선한 keratinocyte 성장 매체 격판덮개 40, 각질 세포 매체의 면전에서 교원질에 의하여 입힌 판의 1개의 우물로 000의 keratinocytes에서 그(것)들을 중단하십시오. 배양이 대략 80%confluent V 부호 젤라틴을 가진 6개의 벽 판을 각각으로 0.1%gelatin 해결책의 2 밀리리터를 추가해서 일 때 매체를 매일 바꾸고 통행 젤라틴은 실내 온도에 적어도 20 분 동안 입히는 것을 젤라틴을 허용한다. 그 동안, 6번 이하의 계대에 있는 각질세포를 웰당 1ml의 0.25%tryin을 첨가하고 2-5분 동안 세포를 배양하여 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.

섭씨 37도에서 혈청이 포함된 배지 1ml로 트립신을 비활성화하고 15ml 튜브에 세포를 수집합니다. 세포를 펠렛화하고 각질 세포 배지에 재현탁시킵니다. 다음 판 100, 000에서 150, 젤라틴으로 된 6개의 좋은 판에 있는 우물 당 000의 keratinocytes는 세포가 50에서 60%confluent이다는 것을 지키기 위하여 다음 날, 일 0에 밤새 그(것)들을 잠복시키고 판을 검사한다.

동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 총 혈장 DNA 2마이크로그램에 대해 8마이크로리터의 형질주입 시약의 비율을 사용하여 각질세포에서 에피솜 재프로그래밍 벡터의 형질주입을 수행합니다. 다음 날인 첫째 날, 각질세포 배지를 변경하고 형광 현미경에서 녹색 형광 단백질 양성 세포의 비율을 추정하여 transfection 효율을 확인합니다. 2일차에는 60-70%의 transfection 효율이 예상됩니다.

트랜스펙션을 반복하여 트랜스펙션 효율을 90% 이상으로 높입니다.그런 다음 10cm 접시에 0.1% 젤라틴 5밀리리터를 최소 20분 동안 사전 코딩합니다. Conrad Al에 설명된 대로 FBS 배지에 10cm 접시당 400만 개의 유사분열로 비활성화된 피더 셀을 플레이트화하고 세포가 3일차에 5%의 이산화탄소가 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에서 밤새 정착하고 부착할 수 있도록 합니다. 앞서 보여준 바와 같이 형질주입된 각질세포를 채취하여 KSR 배지 플레이트에 재현탁합니다.

90%우물 중 하나에서 각질 세포를 피더 세포로 준비한 10cm 접시에 넣고 KSR로 덮습니다. Medium 21일째부터 수동 해부로 인간 유도 만능 줄기 세포 군락을 분리합니다. 서로 밀접하게 밀집되어 있는 군체는 피하고 다른 군체와 명확하게 분리된 군체만 선택하십시오.

수동 해부의 경우 26게이지 바늘을 사용하여 해부 현미경으로 군체를 약 300-600마이크로미터 길이의 작은 조각으로 자릅니다. 한 콜로니의 조각을 새로운 MEF 피더 플레이트로 옮겨 인간 유도 만능 줄기 세포의 클론 라인을 구축합니다. 배양액이 직경 약 1.5mm 계대의 인간 유도 만능 줄기 세포 콜로니와 70-80% 유창성에 도달하면 세포는 Accutane, sase, 또는 collagenase와 같은 표준 효소 포장 방법을 사용합니다.

제조업체의 지시에 따라 4개. 이 프로토콜을 따르면 모발 부착 후 3일 후부터 recy outgrows가 관찰될 수 있으며 계속 증식할 것입니다. 여기에 표시된 각질세포는 새로운 플레이트에 배양되었으며 이러한 세포는 여러 계대 동안 유지될 수 있습니다.

이 이미지는 전형적인 각질세포에서 유래한 인간 유도 만능 줄기세포 군락을 보여줍니다. 32일간의 재프로그래밍 후, 인간 유도 만능 줄기세포 군집의 중심에서 약간의 분화가 발생할 수 있습니다. 일단 수동으로 선택되면, 파생 세포는 일반적으로 높은 핵 대 세포질 비율과 정의된 콜로니 경계를 나타냅니다.

그들은 또한 OCT four nag 및 TRA one 60과 같은 여러 만능 마커를 발현합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 머리카락에서 각질 세포를 추출하여 인간이 유도한다고 주장하는 줄기 세포로 다시 프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.