Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

다음 실험의 전반적인 목적은 세포를 손상시키지 않고 매우 효율적으로 침투할 수 있는 시약인 이량체 형광 tat 또는 df tat을 사용하여 살아있는 세포 내로 거대분자를 전달하는 것입니다. 이는 먼저 전달제를 생성하고 정제한 다음, 두 번째 단계로 Dfta를 사용하는 방식으로 수행됩니다.

Dfta를 관심 거대분자 화물과 함께 37 °C에서 한 시간 동안 세포와 함께 배양하면, df tat이 내세포작용 소포 내부로 화물의 섭취를 유도합니다. 소포는 초기 엔도솜으로 성숙하며, 최종적으로 DF tat이 화물을 세포의 세포질 공간으로 방출할 수 있는 후기 엔도솜 단계에 도달합니다. 다음으로, detta와 관심 화물의 전달 효율을 평가하기 위해 형광 현미경으로 세포를 촬영합니다.

결과는 DF TT가 세포 내로 매우 효율적으로 진입하며 관찰 가능한 세포 독성이 없음을 보여줍니다. 형광 현미경으로 관찰한 바와 같이, DF tat는 다양한 크기의 거대분자를 세포의 세포질 공간으로 전달할 수 있습니다. 기존의 고체 전달 방식에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 전달체가 세포 생리에 관찰 가능한 부정적인 영향 없이 높은 전달 효율을 나타낸다는 점입니다. 또한, 간단한 공동 배양 단계만 필요하므로 사용이 용이합니다.

먼저, FTA 합성을 위해 500 mg의 R amide, MBHA resin 및 dimethylformamide(DMF)를 표준 50 mL SPPS 용기에 넣고 1시간 동안 팽윤시킵니다. 질소 가스를 소량으로 버블링하여 실온에서 반응을 진행합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 각 FM 보호 아미노산을 1.2 mmol씩 사용하여 rink amide MBHA resin 상에서 FTA를 합성합니다. 각 아미노산 커플링 반응 시, HBTU 0.44 g과 DMF에 용해된 DIEA 0.51 mL를 추가합니다. 각 아미노산 커플링 반응은 4시간 동안 수행하며, 4시간의 커플링 과정 이후에 다음 단계로 진행합니다.

수지를 DMF로 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 FD 보호 단계를 수행합니다. FTA의 선형 펩타이드 사슬이 합성될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 수지를 1% trifluoroacetic acid(TFA)와 2% triisopropylsilane(TIS)이 DCM에 포함된 용액 20 milliliters와 함께 5분 동안 배양하여 MTT 보호기를 제거합니다.

MTT 보호기가 제거되면 노란색이 나타나게 됩니다. 세척 단계 사이사이에 DCM과 DMF로 레진을 씻어내며 노란색이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오. MTT가 완전히 제거되어 용액이 투명하게 유지되는지 확인하기 위해 1% TFA가 포함된 DCM 용액을 레진에 추가로 첨가하십시오.

다음으로, DMF에 T-M-R-H-B-T-U와 DIEA를 녹인 후 이 혼합물을 레진에 첨가합니다. fm d 보호 및 아미노산 접합 후, 건조 질소를 사용하여 밤새 교반하며 반응을 진행합니다. 레진을 DCM으로 세척하고 건조시켜 레진으로부터 펩타이드를 완전히 절단합니다.

92.5% TFA, 2.5% water, 2.5% TIS 및 2.5% ethane di thiol이 포함된 용액을 펩티딜 레진에 첨가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켜 전체적인 탈보호 및 레진으로부터의 분리를 수행합니다. 준비된 용액을 40 mL의 ethyl ether에 부어 차가운 무수 ethyl ether를 이용해 조펩티드 생성물을 침전시킵니다. 이를 4 °C, 4,000 G에서 20~25분 동안 원심 분리하여 가라앉힙니다.

이 단계를 반복하여 냉각된 무수 에틸 에테르로 침전물을 세척합니다. 침전물을 물에 현탁시킨 후 동결 건조하고, 얻어진 생성물을 0.1% 수성 TFA ACEDONITE 용액에 다시 현탁합니다. 분석용 C 18 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 분석을 수행합니다.

각 펩타이드를 분석하려면 1 mL/min의 유속을 사용하고 214 nm 및 550 nm에서 검출하십시오. 다음으로, 펩타이드 정제를 위해 C 18 컬럼에서 준준비 규모 HPLC(semi preparative HPLC)를 수행합니다. 모든 분석 단계에서 4 mL/min의 유속을 사용하고 214 nm 및 550 nm에서 검출하십시오.

산화 반응을 수행하기 전에 선형 구배(linear gradients)를 사용하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 MALDI로 펩타이드의 정체성을 정확히 확인하십시오. FTA를 공기가 통하게 한 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)에 용해하십시오.

pH가 7.0에서 7.5 사이인지 확인하십시오. 펩타이드를 첨가한 후, 반응이 완전히 완료될 때까지 하룻밤 동안 반응을 진행하십시오. 역상 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하고, 이전과 같이 질량 분석법으로 분석하십시오. 정제된 DF tat를 동결 건조한 후 200 µL의 물에 재현탁하여 농도를 측정하십시오.

먼저, 정제된 DF tat의 일정량을 149 µL의 50 mM TCEP 용액에 현탁하고 샘플을 약 20분 동안 반응시킵니다. 이 단계에서 DF tat은 단량체 형태인 F tat으로 환원되며, 이를 통해 TMR fluorophore와 DF tat의 근접성으로 인해 발생하는 흡광 소광 현상을 제거합니다. 모든 용액을 석영 큐벳에 넣고 556 nm에서 흡광도를 측정합니다.

Beer-Lambert 법칙을 사용하여 용액의 농도를 결정합니다. 이는 fta의 농도에 해당합니다.

FTA의 농도를 2로 나누어 dfta의 농도를 구합니다. 5% CO2가 포함된 37 °C의 습윤한 분위기에서 세포의 밀도가 80~90%가 될 때까지 적절한 배지에서 배양하고, 200 µL의 PBS로 3회, NRL 15로 1회 세척합니다. 화물(예: enhanced green fluorescent protein)의 포함 여부에 따라 5 µM dfta와 함께 세포를 배양하고 37 °C에서 1시간 동안 유지하여 엔도솜 누출을 유도합니다.

세포의 세포막에 결합된 DF tat을 제거하기 위해 L 15 배지가 포함된 heparin으로 세포를 세 번 세척합니다. 마지막 단계로, 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하며, red fluorescent protein 또는 RFP 필터를 사용하여 DF tat의 이미지를 촬영함으로써 F TAT와 D ftt의 차이를 평가합니다. He hela 세포를 각 펩타이드와 함께 배양하여 이들의 세포 내 국소화 차이를 결정합니다.

여기서 보는 바와 같이, FTA는 점상 분포로 국소화됩니다. 이러한 분포는 펩타이드가 엔도솜 내부에 갇혀 있는 상태임을 나타냅니다. 이와 대조적으로, dfta의 형광 신호는 세포질과 핵 전체에 걸쳐 균일한 분포를 보입니다.

여러 가지 서로 다른 세포주에서 DF tat의 세포질 분포를 관찰하였습니다. 20배 확대 이미지들은 배양 접시 내 매우 높은 비율의 세포들이 DF tat의 세포질 분포를 보이며, cyt blue 핵 염색에서 나타나듯 세포 독성이 없음을 보여줍니다. 이는 dfta 매개 엔도솜 누출이 거대 단백질을 세포의 세포질로 전달하는지 결정하기 위한 것입니다. 올바르게 접힌 단백질의 전달을 검출하기 위해 EGFP가 사용되었습니다.

EGFP는 세포의 90% 이상에서 관찰 가능한 독성 없이, DF tat에서 관찰되는 것과 유사하게 세포질과 핵에 녹색 형광이 분포하는 양상을 보였습니다. 이 절차를 수행할 때, 세포가 과도하게 밀집(confluent)되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, df tap을 첨가하기 전에 FPS를 제거하기 위해 세포를 충분히 세척해야 합니다.