Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

다음 실험의 전반적인 목표는 세포를 손상시키지 않고 매우 효율적으로 침투할 수 있는 이량체, 형광 tat 또는 df tat 시약을 사용하여 거대분자를 살아있는 세포에 전달하는 것입니다. 이것은 먼저 전달 대리인을 생성하고 정제함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 DFTA.

Dfta는 관심 있는 거대분자 화물이 있는 상태에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포와 함께 배양되며, df tat은 세포내 소포 내부의 화물 흡수를 유도합니다. 소포는 초기 엔도솜으로 성숙하여 최종적으로 DF tat이 세포의 세포질 공간으로 화물을 방출할 수 있는 후기 엔도솜 단계에 도달합니다. 다음으로, detta와 관심 화물의 전달 효율을 평가하기 위해 형광 현미경으로 세포를 이미지화합니다.

결과는 DF TT가 높은 효율로 세포에 들어갈 수 있고 관찰 가능한 세포 독성이 없음을 보여주며, DF tat은 형광 현미경으로 관찰할 수 있는 바와 같이 다양한 크기의 거대분자를 세포의 세포질 공간으로 전달할 수 있습니다. 기존의 고체 전달 접근법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전달 물질이 세포 생리학에 관찰할 수 있는 부정적인 영향이 없이 높은 전달 효율을 가지고 있다는 것입니다. 또한 간단한 공동 배양 단계만 필요하기 때문에 사용이 간편합니다.

먼저 표준 50 밀리리터 SPPS 용기에 500 밀리그램의 R 아미드, MBHA 수지 및 디메틸 포름 아미드 또는 DMF를 1 시간 동안 FTA 합성으로 팽창시키고 반응을 거품에 충분한 질소 가스를 사용하여 실온에서 반응을 수행합니다. 각 아미노산 결합 반응에 대한 텍스트 프로토콜에 나열된 각 FM 보호 아미노산 1.2밀리몰을 사용하여 링크 아미드 MBHA 수지에서 FTA를 합성합니다. 또한 DMF에 용해된 HBTU 44g과 DIEA 51ml를 추가하면 4시간 커플링 후 4시간 동안 각 아미노산 커플링 반응을 수행합니다.

DMF로 수지를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 FD 보호 단계를 수행합니다. FTA의 선형 펩타이드 사슬이 합성될 때까지 반복합니다. 다음으로, DCM에서 1%tri Fluor acetic acid 또는 TFA 및 2%tri isopropyl cy 또는 TIS로 구성된 용액 20ml로 수지를 5분 동안 배양하여 MTT 보호 그룹을 제거합니다.

MTT 보호 그룹을 제거하면 노란색이 나타납니다. 노란색이 관찰되지 않을 때까지 이 작업을 반복합니다.그 사이에 DCM과 DMF로 수지를 세척합니다. DCM에 1%TFA가 포함된 추가 용액을 수지에 추가하여 MTT가 제거되지 않고 용액이 깨끗하게 유지되도록 합니다.

다음으로, T-M-R-H-B-T-u와 DIEA를 DMF에 용해시키고 이 혼합물을 수지에 첨가한다. 건조 질소를 사용하여 밤새 반응을 수행하여 fm d 보호 및 아미노산 접합 후 교반을 제공합니다. DCM으로 수지를 세척하고 건조시켜 수지에서 펩타이드를 완전히 절단합니다.

92.5% TFA, 2.5% 물, 2.5% TIS 및 2.5% 에탄 디 티올을 함유한 용액을 실온에서 3시간 동안 펩티딜 수지에 첨가하여 수지로부터 전체적인 깊은 보호 및 절단을 달성합니다. 제조된 용액을 40ml의 에일 에테르로 배출하여 차가운 무수 에틸 에테르를 사용하여 조잡한 펩타이드 생성물을 침전시킵니다. 이것을 섭씨 4도에서 4, 000G에서 20-25분 동안 회전시킵니다.

이 단계를 반복하여 침전물을 차가운 무수 에틸 에테르 reus로 세척 할 수 있습니다. 침전물을 물에 현탁시키고 동결 건조한 다음 0.1% 수성 TFA ACEDONITE 시험에서 얻은 생성물을 reus로 재현탁합니다. 분석용 C 18 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 분석을 수행할 수 있습니다.

각 펩타이드를 분석하려면 분당 1ml의 유속과 214나노미터 및 550나노미터에서 검출을 사용합니다. 다음으로, 펩타이드 정제를 위해 C 18 컬럼에서 반분취용 HPLC를 수행합니다. 분당 4밀리리터의 유속을 사용하고 모든 실행에 대해 214나노미터 및 550나노미터에서 감지합니다.

산화 반응을 수행하기 전에 선형 그래디언트를 사용합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 MALDI에 의해 펩타이드의 정확한 신원을 확인하십시오. FTA를 폭기된 인산염 완충 식염수에 용해시킵니다.

pH가 7.0에서 7.5 사이인지 확인하십시오. 펩타이드를 첨가한 후 하룻밤 사이에 반응을 돌연변이시켜 완료될 때까지 반응할 수 있도록 합니다. 역상 HPLC를 사용하여 제품을 정제하고 이전과 같이 질량 분석법으로 순수 DF tat 및 resus를 동결 건조하고 200 마이크로 리터의 물에 현탁하여 농도를 측정합니다.

먼저 Resus는 149마이크로리터의 50밀리몰 TCEP 용액에 정제된 DF tat의 부분 표본을 현탁시켜 샘플이 약 20분 동안 반응하도록 합니다. 이 단계에서, DF tat는 TMR floor 4 및 DF tat의 근접성으로 인해 발생하는 흡광도 소멸을 제거하기 위해 단량체 대응물 F tat로 감소됩니다. 모든 용액을 석영 CVE에 추가하고 556나노미터에서 흡광도를 측정합니다.

맥주의 법칙을 사용합니다. 용액의 농도를 결정합니다. 이것은 fta의 농도에 해당합니다.

FTA의 농도를 2로 나누어 dfta의 농도를 구합니다. 5%CO2를 함유하는 섭씨 37도의 가습된 분위기에서 80-90%Conf 유창성까지 적절한 배지에서 세포를 성장시키고 200마이크로리터의 PBS로 세포를 세 번 세척하고 NRL 15로 한 번 세척합니다. 강화 녹색 형광 단백질과 같은 화물의 유무에 관계없이 5마이크로몰 df tat로 세포를 배양하고 배양 후 엔도솜 누출을 유도하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 유지합니다.

L15 배지에 헤파린을 넣어 세포를 3회 세척하여 세포의 원형질막에 결합된 DF tat을 제거합니다. 최종 단계 이미지로서, 형광 현미경을 사용하여 세포는 적색 형광 단백질 또는 RFP 필터를 사용하여 F tat과 D ftt의 차이를 평가합니다. 그는 발 뒤꿈치 세포를 각 펩타이드와 함께 배양하여 세포 국소화의 차이를 결정합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 FTA는 구두점 분포로 지역화됩니다. 이 분포는 엔도솜 내부에 갇혀 있는 펩타이드와 일치합니다. 대조적으로, dfta의 형광 신호는 세포질과 핵 전체에 걸쳐 균일한 분포를 나타냅니다.

DF tat의 세포질 분포는 여러 다른 세포주에서 관찰됩니다. 20 x 이미지는 접시에서 매우 높은 비율이 세포 독성 없이 DF tat의 세포질 분포를 나타내는 것을 보여주며, 이는 dfta 매개 엔도솜 누출이 세포의 세포질로 큰 단백질을 전달하는지 여부를 결정하기 위해 cyt blue 핵 염색이 없는 것으로 나타났습니다. EGFP는 올바르게 접힌 단백질의 전달을 감지하는 데 사용되었습니다.

EGFP는 관찰 가능한 독성이 없는 90% 이상의 세포에서 DF tat에서 관찰된 것과 유사한 세포질 및 핵 녹색 형광 분포를 나타냈습니다.이 절차를 시도하는 동안 세포가 과도하게 융합되어서는 안 된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 df tap을 추가하기 전에 FPS를 제거하기 위해 셀을 철저히 세척해야 합니다.