Name: 이중 가닥 DNA Ministrings의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 학습하세요 DNA ministrings 생산 프로토콜을 통해 안전하고 효율적인 비바이럴 유전자 전달 벡터를 만드는 방법을 배우세요. 이 단순한 체온 유도 시스템은 8시간 이내에 완료 가능하며 진핵세포 유전자 전달 효율을 크게 향상시킵니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는이 작품을 자금에 대한 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 감사합니다.

미디어 및 문화 1. 준비 <ol><li> LB + 앰프를 들어 루리아 - 베르 타니 배지 (LB) 500 ml를 30 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브를 사용하여 멸균 준비한다. 필요한까지 암피실린 부록 4 ° C에서 저장 암피실린 100 ㎍ / ml의 최종 농도를 얻었다. </li><li> TB + 앰프의 경우 : 큰 (500 ㎖ 이상) 생산을 ministring의 볼륨을 준비합니다. 30 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브를 사용하여 멸균 무균 굉장 브로 쓰 (TB) 600 mL의 준비. 필요한까지 암피실린 부록 4 ° C에서 저장 암피실린 100 ㎍ / ml의 최종 농도를 얻었다. </li><li> LB 한천 + 앰프 들면 : 한천 15g / L로 보충 된 LB + 앰프 준비하여 멸균 LB 아가 플레이트를 준비한다. 나누어지는 약 15 - 거꾸로 4 ℃에서 멸균 배양 접시와 저장소에 20 ㎖ 필요한 때까지. </li><li> 에 의한 무균 W3NN [PDMS]를 질주 W3NN [PDMS]의 연속 판을 준비 LB 한천 + 앰프에 세포. 판 overni을 품어30 ° C에서 GHT, 단일 콜로니가 관찰 될 수있을 때까지. protelomerase 식을 derepressing 방지하기 위해이 온도 이상 W3NN을 배양하지 마십시오. </li><li> 무균 전송 멸균 시험관에 LB + 앰프 5 ㎖. 줄무늬 판에서 하나의 식민지로이 볼륨을 접종하여 W3NN [PDMS]의 야간 문화를 준비합니다. 230-250 rpm으로 진탕 기에서 30 ° C에서 문화 하룻밤을 품어. </li></ol> 2. 성장 단계 <ol><li> 무균 멸균 125 ㎖의 삼각 플라스크에 전송 LB + 앰프 10 ㎖와 1하게 준비 LB + 앰프에 밤새 W3NN [PDMS] 문화 100 ㎕로 접종 : 100 희석. <ol><li> 큰 볼륨의 경우, 대신 LB + 앰프로, 250 ㎖의 삼각 플라스크에 TB + 앰프의 50 ㎖로 하룻밤 문화의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 또한, 단계 2.2에서 두 번째로 &quot;대표&quot;문화로 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 막 다른 때까지 30 ° C, 250 rpm으로 진탕 배양기에서 품어600 = 0.8 : 진짜야는 광학 밀도 (OD) 또는 흡광도로 표시, 후반 로그 상 중순에 도달한다. 1-2 시간 후에, 배지를 육안으로 혼탁 나타나기 시작한다. <ol><li> 무균 전송 깨끗한 분광 광도계 큐벳에 문화 1 ㎖. </li><li> 600 nm의 파장으로 설정 - 마주 UV 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 측정한다. 세포가 빈 (LB 또는 TB)를 설정 성장했다있는 미디어 1 ㎖를 사용합니다. 선택적으로, 대신에이 단계 단계 2.1.3의 대표 문화를 사용합니다. </li><li> 배양 아직 적절한 OD에 도달하지 못한 경우, 쉐이커로 돌아가서 다시 30 분마다 체크. (600)는 0.8에 접근 더 자주 OD를 확인합니다. </li></ol></li><li> 문화 600 = 0.8로 표시 후반 로그 단계에 도달하면, 무균 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 문화를 전송합니다. </li><li> 10 분 동안 10,000 XG에 문화를 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 체육에 대한 검사상기 튜브의 하단에 llet. </li><li> 적절한 생물 학적 폐기물 용기에 해제 뜨는을 가만히 따르다. 세포 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 모든 세포가 수집 될 때까지 반복 2.4-2.5 단계를 반복합니다. </li><li> 100 ㎕를 LB + 앰프의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 대기음 마이크로 피펫 또는 볼텍스 믹서를 사용한다. 큰 ministring 생산을 위해, 신선한 LB + 앰프 미디어 1 ㎖에 50 ㎖ TB + 앰프 문화 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 3. Ministring 생산 <ol><li> 무균 42 ° C에 125 ㎖의 삼각 플라스크 및 열에서 LB + 앰프의 20 ㎖를 추가합니다. 큰 ministring 생산을 위해 42 ° C로 예열 LB + 앰프의 500 ml의를 준비합니다. </li><li> 예열 된 배지에 재 부유를 전송합니다. </li><li> 42 ° C에서 품어 600 = 1.0로 표시 과거 로그 상까지 250 rpm으로. 1 시간지나 42 ° C에서 문화의 20 ㎖를 두지 마십시오. </li><li> 37 ° C까지 온도를 줄이고 ADDI의 문화를 남겨적인 90 분. 500㎖의 내용 (90)의 추가의 유도 기간 동안 배양두고 - 120 분, 온도를 감소시키지 않는다. </li><li> 30 ° C까지 온도를 줄이고 2 시간의 추가 온도 다운 시프트 기간 동안 200 rpm으로 진탕 문화를 둡니다. 500 ml의 경우, 4 시간 또는 야간에 온도 저단 변속을 확장합니다. </li></ol> 4. 수확 Ministrings <ol><li> 무균 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 문화를 전송합니다. 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기와 펠렛을 위해 검사합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 적절한 생물 학적 폐기물 용기에 뜨는을 가만히 따르다. 모든 세포가 수집 될 때까지 반복합니다. </li><li> 나중에 추출 -80 ° C에서 액체 질소와 상점에서 상업적 추출 및 독소 제거 키트 또는 플래시 동결과 플라스미드 추출을위한 펠렛을 유지합니다. </li></ol>

<ol><li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6%2C+interleukin+12%2C+and+interferon+%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li>
<li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li>
<li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle%3A+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li>
<li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li>
<li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li>
<li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+ministrings%3A+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li>
<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal-size+vector+%28MIDGE%29+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li>
<li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li>
<li>López-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+%28MIDGE%29+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li>
<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li>
<li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PY54%2C+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li>
<li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154(2012).</li>
<li>Xu, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transcriptional+regulatory+elements+for+constructing+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.</a> Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).</li>
<li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induced+by+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).</li>
<li>Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li>
<li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li>
<li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다 선언합니다.

우리는 전형적인 박테리아 증식 및 조작에 사용되는 것을 제외하고 특별한 장치를 필요로하지 않는 단일 단계 열 - 유도 된 프로토콜을 사용하여 DNA의 LCC ministrings 생산 여기 간단한 시스템을 설명한다. DNA의 ministrings는 원핵 생물의 유전 적 요소가없는 비틀림이없는 안정적인 선형 DNA의 발현 카세트입니다. 이들은 진핵 시스템에서의 유전자의 발현 효율을 향해 유전자 전달, 리포터 유전자의 발현뿐만 아니라, 평가에 대한 종래의 방법 대신에 사용될 수있다. DNA의 ministrings는 생체 적합성 및 선형 DNA 벡터 우수한 안전성 프로파일을 &quot;미니&quot;벡터의 형질 감염 효율 향상의 이점을 결합한다. 생체 내 생산 플랫폼 우리 강력한 한 단계가 빠르게 쉽게 여러 비용 체외 처리를 필요로하지 않고 임의의 유전자 전달 애플리케이션 DNA의 ministrings를 생성한다. 몇 가지 중요한 단계가 있습니다최적의 ministring 생산 (그림 2, 3)를 확인합니다. 열 유도 생산을 ministring에 가장 중요한 단계입니다. 생산을 ministring의 전체 부족으로 인해 protelomerase 표현의 억압이 LCC의 ministring에 전구체 플라스미드의 변환을 방지 열 유도 (30 ° C로 유지 셀), 부족 가능성이 높습니다. 열 유도 프로토콜에 따라, 약 75 %의 생산 효율을 기대한다. 세포가 로그 상에있는 동안 열 유도에 최적입니다. ( &quot;자란&quot;도 3)를 고정상으로 세포를 사용할 때 PE를 ministring에서 통계적으로 유의 한 차이가 없다하더라도, 우리는 전체 플라스미드 수율은 거의 50 %의 감소를 관찰했다. 수율은 사용 된 플라스미드 추출 프로토콜에 의존 할 것이다. 세포를 로그 상에있는 동안 최적 ministring 생산 열 유도를 발생시킨다. 가난한 ministring 생산은 대부분 장기간 온도 업 시프트 또는 insufficie의 결과가 될 것입니다NT 온도 시프트. 이 E.이 활성화로 장기간 온도 업 시프트는 권장하지 않습니다 protelomerase 활성을 저해하고, 플라스미드 안정성을 방해 할 수있는 대장균 열 충격 응답 (15). 따라서, 온도 시프트 타이밍 ministring 효율적인 생산을위한 또 다른 중요한 단계이다. 30 ℃에서 추가 배양 시간없이 ministring 생산 효율이 매우 불량한 것으로 밝혀졌다 ( &quot;조기 제거&quot;,도 3). 이것은 전화 발현과 활성에 필요한 시간에 기인 할 수있다. 원래 프로 파지 PY54 인코딩 전화의 protelomerase는 일반적으로 최적 30 ° C는 전화 활동에 더 최적화 될 수 있음을 나타내는, 약 28 ° C (12)을 성장 르시 니아를 감염. DNA의 minivector 생산 시스템은 고품질의 세균 서열이없는 DNA의 minivectors를 생성하는 생체 플랫폼을 이용한다. 프로토콜에 대한 수정 난 할 수있다성장 단계에서 세포 증식 (대신 LB의 TB)을 촉진하거나, 생산 및 변환 효율 ministring 높이기 위해 플라스미드 단백질의 생산을 최적화하기 위해 성장 배지를 변경 nclude. 더 큰 문화 볼륨 (200 ㎖ 이상), 온도 하향 변속 및 30 ° C에서 배양을 위해 PE를 ministring에 심각한 부정적인 영향없이 야간 연장 될 수있다. 우리는 예를 들어 500 ml의 문화에 대한 우리의 프로토콜의 수정을 포함하고있다. DNA의 ministrings 정제 원핵 주쇄의 시험 관내 효소 분해를 통해 급송된다. 엔도 뉴 클레아 제 대상 사이트의 숫자가 있습니다 (예를 들어, PI-SceI 제한 효소, PvuI, SCAI) 개방 선을 노출 절단 할 수 전구체 플라스미드의 원핵 백본 볼 수는 원핵 백본의 체외 저하를 허용, 종료한다. 다른 벡터 종 ministrings의 분리는 음이온 교환막 크로마토 그래피 (16)를 통해 달성 될 수있다. LCC DNA 벡터 생산 시스템과 관련된 하나의 전류 제한은 다른 LCC 및 CCC에서 제품의 ministring DNA 정제에 대한 필요성이다. 쉽게 표준 플라스미드 분리 방법을 사용하여 정제이지만, 분리 공정은 여전히​​ 대규모 환경에서 불리 할 수​​있다. ministring의 분리는 시간이 많이 소요 ministring 및 LCC 원핵 세포 골격의 크기가 너무 비슷한 경우 AGE를 사용 할 수 있습니다. 선택적으로, 음이온 교환막 크로마토 그래피 CCC 벡터 종 (16)로부터의 ministrings 나은 분리를 제공 할 수있다. 고온도에서 E. 열충격 반응을 활성화 온도로 업 시프트는 다른 전위 제한 될 수있다 음의 재조합 단백질에 영향을 미치는 대장균은 17 산출 결과적으로 변환 ministring에 플라스미드의 요금을 줄일 수 있습니다. 우리는 생산 플랫폼의 최적화 회피 및 / 또는 열 충격 (18) 등의 영향을 완화하기 위해 다른 곳에서보고한다. 우리또한 현재 제거하거나 생체 내에서 LCC에게 원핵 백본 오염을 감소시키는 방법을 최적화한다. LCC의 DNA의 ministring 염색체 통합 숙주 염색체을 방해하고 아폽토시스로 세포 주제. 뿐만 아니라이 같은 종양과 인접 유전자의 침묵함으로써 안전성을 향상시키는 등의 삽입 성 돌연변이 유발의 부정적 영향을 감소 않는다; 치사 효과도 관련된 부작용 및 통합의 손상없이 노킹 인 유전자 대체 연구에 적합한 방법이 될 수있다. DNA의 ministring 벡터는 생체 내에서 주어진 목표로 치료 단백질, RNA, 항체 또는 항원에 대한 유전자의 전달과 표현으로 적용되거나 오작동 또는 비 기능적인 대립 유전자를 대체 할 수 있습니다. 간단한 단계의 열 - 유도 생체 생산 시스템은 DNA의 ministring 벡터 쉽게 임상 또는 산업용으로 제조 할 수있다.

목표는 공유 (LCC) DNA의 minivectors 간단한 고효율 원스텝 열 유도 생체 DNA ministring 생산 시스템을 사용하여 폐쇄 선형 확장 량을 생성한다. DNA의 ministrings는 DNA를 제공하는 안전하고 효과적인 비 바이러스 성 전략을 제공합니다. 이들은 DNA를 minicircles의 효율 LCC 벡터의 안전성을 결합하고, 또한 트랜 스펙 션 효율을 손상시키지 않으면 서 바이러스 유래 벡터에 안전한 대안을 제공한다. 성공하는 유전자 전달체 위해서는, DNA 벡터는 목적 숙주 세포를 선택하고 상기 인코딩 된 유전자 (들)을 표현한다. 특히 포유류 시스템에서 실제로 극복해야 할 여러 가지 세포 장벽이있다. 세망 내피 시스템에 의해 혈청 클레아 면역 검출에 의한 열화를 방지하기 위해, DNA 벡터는 타겟 시스템과 생체 면역 대응해야한다. 보호되지 않은 DNA는 빠르게 플라즈마 클레아 제에 의해 소화DNA 벡터 빠르게 표적 세포의 세포막을 횡단 할 수 있어야하므로 상기 플라스미드 막은 고밀도 지단백질 장벽 구성된다. 셀되면, 벡터는 세포질을 통과해야하며, 유전자 발현의 핵을 입력 핵 막을 통과. 비 바이러스 성 유전자 전달 방법은 세포 조직 - 타겟팅 향상에 초점을 맞춘다. 그러나, 이러한 종래 기술과 플라스미드의 사용으로 인해 빠르게 유전자 발현을 침묵 1,2- 세균 면역 원성 서열의 존재로 형질 전환 효율을 감소시킨다. 기존의 플라스미드는 일반적으로 원핵 생물 시스템의 유지 보수를 위해 항생제 내성 유전자를 수행한다. 그러나, 이러한 인간의 호스트의 잠재적 악영향을 수평 또는 천연 유전자 전달 효과를 통해 호스트 식물 발생에 대한 저항성을 부여 할 수있다. 기존의 플라스미드는 잠재적으로 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수 뉴클레오티드의의 CpG 모티프 (2)를 포함감소 또는 유전자 발현을 침묵. 이들은 단독으로 진핵 발현 카세트로 구성되기 때문에, 이러한 DNA의 minicircles 3과 DNA의 minivectors들은 그들의 소형화 및 면역 원핵 요소의 유무에 그들이 세포 및 세포 내 생체 이용률 개선 된 유전자 발현을 향상 나타내는 한 유전자 전달을위한 더 나은 대안 4. 더 표적 부위 5 생체 내 투여와 관련된 전단력에 대한 저항에 대해 감소 된 벡터 크기 요금. 단위 질량 당 벡터의 높은 카피 수는, 따라서 독성을 감소 이하 형질 전환 시약을 필요로한다. 그러나, 숙주 염색체로 랜덤 벡터 통합의 경우, 원 공유 분자 연속성을 부여, DNA의 minicircles 종래 플라스미드 모두 포함 (CCC) 경로를 폐쇄하기 때문에 엄청난 결과를 가져올 수있다 삽입 성 돌연변이를 초래할 수있다 <s&gt; 6입니다. 비교적 선형 DNA 벡터의 통합함으로써 증식하는 세포 집단에서 돌연변이 세포를 제거하고, 삽입 성 돌연변이 7 방지 세포사 경로를 염색체을 방해하고 개시한다. 최소한의 면역 학적으로 정의 된 유전자 발현 (미지) 벡터 (8)과 마이크로 선형 벡터 9 (MiLV)는 시험 관내에서 개발 LCC DNA 벡터이다. 미지 벡터는 종래의 플라스미드 DNA 벡터 (11)에 비해 생체 내에서 17 배 향상된 유전자 발현까지 발휘 한 백신 8 10 암 유전자 치료에 유망한 결과를 보여 주었다. 또한, LCC에 의한 minivector의 비틀림없는 구조 덜 형질 전환 시약 따라서 독성 7 감소 CCC 수퍼 코일 상대 비교하여 필요하다. 우리의 향상된 LCC의 DNA 벡터, DNA의 ministrings는 뛰어난 표현의 효율성과 bioavai을 증명하고있다불안정성 7. 또, DNA의 ministrings는 한 단계의 열 - 유도 생체 생산 시스템, 생체의 여러 단계를 필요로하고 미지 MiLV LCC 벡터에 합당하고 비용 효율적인 대안을 생성한다. 증명되는 DNA ministring 생산 시스템 그것을 만드는 생체 수행 간단한 열 유도 과정 모두 비용 효율적이고 쉽게 확장. 이 시스템은 예 르시 니아 enterocolitica PY54 박테리오파지 유래 텔 / PAL은 원핵 플라스미드 골격으로부터 최소 진핵 발현 카세트를 분리하는 재조합 시스템 12 protelomerase 이용한다. 우리는 열 유도 박테리오파지 λ 프로모터, CI [TS] 857 (13)의 제어하에 전화의 protelomerase을 표현하는 대장균을 대장균 세포 (W3NN)를 설계했다. 표현하면, 전화의 protelomerase는 &quot;슈퍼 순서&quot;(SS) 전구체 플라스미드에있는 사이트 내에 존재하는 친구의 표적 부위에 작용DNA의 ministring 후 (도 1)으로 정제 할 수있는 LCC 제품을 얻었다. DNA의 ministring 전구체 플라스미드 SS 사이트는 이에 한 전구체 플라스미드 동종 LCC 및 CCC에서 minivectors의 생산을 촉진 Cre 호텔 재조합 (LOX) TelN의 protelomerase (telRL) 및 FLP 재조합 효소 (FRT)를 포함하는 다른 콤비 네이즈의 대상 부위를 인코딩한다. 또한, 각 SS 사이트 핵 전좌 (14)을 개선하기 위해 게재 SV40 인핸서 (SV40e) 시퀀스에 의해 양쪽 측면된다. 우리는 SV40e의 연속 첨가가 점진적으로 형질 전환 효율 (7)에 해당 증가를 부여하는 것이 다른 곳에서 증명하고있다. 전구체 플라스미드 (pDNA에 MiniString 또는 PDMS)는 녹색 형광 기자 (GFP)와 전사 융합에 대한 관심이 원하는 유전자의 삽입을 용이하게하기 위해 폴리 링커 (그림 1)가 포함되어 있습니다. DNA의 minivector 기술 수​​도진핵 시스템에서의 유전자의 발현 효율을 향해 유전자 전달, 리포터 유전자의 발현, 및 평가를위한 종래의 방법 대신에 사용된다. DNA의 ministrings는 생체 적합성 및 선형 DNA 벡터 우수한 안전성 프로파일을 &quot;미니&quot;벡터의 형질 감염 효율 향상의 이점을 결합한다. 우리 강력한 원스텝 생산 플랫폼은 신속하고 쉽게 유전자 전달 애플리케이션 DNA의 ministrings 생산 및 높은 안전성을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>E. coli W3NN</td> 미니스트링 처리를 위한 <td>메디파지</td><td></td><td>균주: Nafissi & Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td> 미니스트링 처리를 위한 <td>메디파지</td><td></td><td>부모 플라스미드: pDNA 미니스트링(pDMS)이라고도 함</td></tr> <tr><td>BD Difco 탈수 배양 배지: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated</td><td>Agar Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>초순수 Milipore 물</td><td>피셔 과학&nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>모델: Mili-Q Advantage A10 정수 시스템</td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 페트리 접시 투명 뚜껑 레이즈드 릿지 (100&nbsp; 엑스&nbsp; 15&nbsp; mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX 테스트 튜브</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계 큐벳</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>멸균 15 ml 팔콘 튜브</td><td>&nbsp; BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr> <tr><td>멸균 50 ml 원심분리기 튜브</td><td>&nbsp; FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 일회용 폴리스티렌 혈청학 피펫 10 ml</td><td>BD 팔콘</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 일회용 폴리스티렌 혈청학 피펫 25 ml</td><td>BD 팔콘</td><td>13-668-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터(100-1,000&nbsp; &뮤; l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터(20-200&nbsp; &뮤; l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 팁 (100-1,250&nbsp; &뮤; l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 팁(1-200&nbsp; &뮤; l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific 경제 버너</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td>New Brunswick Scientific&nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>멸균 에를렌마이어 플라스크 (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 삼각 플라스크 (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 삼각 플라스크 (500 ml)</td> <td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>모델: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>바닥 원심분리기</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>모델: Avanti J-E</td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>모델: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific 아날로그 보텍스 믹서&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1kb DNA 사다리</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

이중 가닥 dna ministrings의 생산

Production of Double-stranded DNA Ministrings

우리는 생체 내에서 간단한 플랫폼을 통해 생성 된 비 바이러스 성 유전자 전달 벡터의 대안으로 선형 공유 폐쇄 (LCC) DNA의 minivectors을 구축 하였다. DNA의 ministrings이 높아진 안전성 프로파일을 보유하고 효율적으로 표적 세포에 DNA화물을 제공합니다. 기존의 DNA 벡터는 항생제 내성 유전자의 CpG 모티프 및 호스트 면역 반응의 자극으로 이어질 수 복제의 세균 기원을 포함 바람직하지 않은 원핵 시퀀스를 수행한다. 종래의 DNA 벡터의 생체 이용율은 또한 그들의 큰 분자 크기에 노출된다. 그들의 원형 성격도 삽입 성 돌연변이 유발로 이어지는 염색체 통합을 부여 할 수 있습니다. 세균 서열은 관심 (GOI) 필요한 진핵 발현 요소의 유전자를 떠나는 DNA의 minivectors로부터 절단된다. 우리의 LCC의 DNA의 minivectors, 또는 DNA의 ministrings는, 면역 원성 세균 서열의 결여이다; 따라서 일을 개선EIR 생체 이용률 및 GOI 식입니다. 염색체 내에 통합 벡터의 경우, LCC에 DNA의 ministring는 치명적함으로써 증식 세포 집단에서 위험한 돌연변이를 분리, 숙주 염색체를 중단한다. 바람직 벡터 통합 이벤트의 가능성을 제거하면서 결과적으로, DNA에 ministrings &#39;는 minicircle&#39;DNA의 이점을 제공한다. 기존의 플라스미드 및 동종 원형 공유 폐쇄 (CCC) 대응과 비교, DNA의 ministrings 우수한 생체 이용률, 형질 전환 효율 및 세포질 반응 속도를 보여 - 그들은 이렇게 표적 세포의 효율적인 형질 전환을위한 양이온 성 계면 활성제의 낮은 금액을 필요로한다. 우리가 사용하는 간단한 신속하고 확장 성이 대장균에서의 DNA ministrings 생산 용 생체 시스템에서 유도 한 단계를 구성하고있다.

DNA 추출 잔류 전구체 플라스미드 LCC 원핵 백본 및 DNA의 ministring 후에 회수한다. 전체 플라스미드 수율 및 순도는 분광 광도계를 사용하여 평가 될 수있다. 순도는 260 nm에서 1.9-2.0의 비율이 최적 파장 280nm (A260 / A280)에서의 흡광도의 비율을 이용하여 추정된다. 모든 LCC 및 CCC 제품은 아가 로스 겔 전기 영동 (AGE) (도 2)을 통해 분리 될 수있다. AGE 전에 정제 ministring에 열 유도 후 생산 ministring 결과를 시각화. ministring 생산 성적 평가 상위 플라스미드 (5.6 KB) (도 2)에 ministring (2.4 KB)의 밴드 강도를 비교하는 단계에서 이루어질 수있다. Ministring DNA는 다음과 같은 표준 플라스미드 AGE 겔 추출 프로토콜을 통해 회수 될 수있다. (3)이 반송 중에 발생할 다양한 조건 하에서 생산 효율 ministring 요약 도표프로토콜을 보내고. Ministring 생산 효율은 제조의 분석 프로그램을 이용하여 DNA 밴드 강도에 기초하여 결정 하였다. 유사한 농도계 프로그램 AGE의 결과를 분석하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1 :. 생산을 ministring의 개요 (A)는 부모 벡터는 두 SS 사이트에서 액자 리포터 유전자와 전사 융합 폴리 링커를 포함한다. 백본은 암피실린 내성에 대한 베타 - 락타 마제를 인코딩하고 또한 체외 소화 백본에 고유 한 여러 컷 사이트가 포함되어 있습니다. 주요 프로토콜의 (B) 개요. 단계 2) 성장 단계 및 3) Ministring 생산 프로토콜의 단순함을 강조하는 단계의 전체 설계도를 제공하는 다이어그램으로 표시됩니다. (C) Ministring 유도. 열 유도 부모 플라스미드의 SS 사이트에 전화 활동 다음에 전화 식을 수 있도록, 온도에 민감한 리프레을 비활성화합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> 그림 2 : 프로토콜의 편차 후 생산을 Ministring. 1 : 제어, 2 : 유발되지 않은, 3 : 자란, 4 : Overinduced, 5 : 조기 제거. DNA의 ministring는 LCC 백본 3 KB입니다, 약 2.4 킬로바이트를, 그리고 pNN9 부모 플라스미드는 5.6 KB입니다. ministring 및 LCC 백본 밴드의 밴드 강도가 낮은 ministring 수율을 나타내는, 프로토콜의 편차에 놓습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 뉴 잉글랜드 바이오 랩스에서 1킬로바이트 사다리; 제어 프로토콜 다음; 유도되지 않은, 아니 온도 업 시프트; 자란, 온도는 두린 상향 변속g 정지상; Overinduced, 확장 된 온도 업 시프트; 조기 제거, 아니 온도 다운 시프트. 플라스미드는 오메가 Biotek EZNA 플라스미드 미니 키트를 사용하여 추출 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> 그림 3 :. 생산 효율 (PE)을 ministring에 프로토콜 편차의 효과 결과는 3 시험의 평균이다. PE는 AGE 후 AlphaImager HP를 사용하여 측정 상대 밴드 강도 추정된다. 편차는 다음 단계에서 발생 제어 프로토콜 다음; 유도되지 않은 2 단계에서 어떤 온도 업 시프트; 자란, 온도 업 시프트 단계 1.6에서 고정 단계에서 시작했다; 단계 2.3에서 Overinduced, 넓은 온도 업 시프트; 초기 제거 세포를 제거하고, 추출단계 2.3에서 온도 하향 변속없이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

선형 공유 결합(LCC) DNA 미니 벡터(DNA ministring)는 높은 transfection 효율을 제공하는 비바이러스 유전자 전달 벡터이며 모든 DNA 전달 응용 분야와 관련이 있습니다. 생산 시스템은 간단하고 빠르며 in vivo에서 확장 가능합니다. 다음 프로토콜은 DNA 미니스트링 생산을 위한 시각적 단계별 지침을 제공합니다.

이중 가닥 DNA Ministrings의 생산

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

이 절차의 전반적인 목표는 간단한 단일 단계 생산 시스템을 사용하여 안전한 선형 공유 결합 폐쇄 DNA 미니벡터 또는 DNA 미니스트링을 생성하는 것입니다. 따라서 이 방법은 DNA 벡터 및 유전자 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, DNA 미니스트링이라고 불리는 더 안전하고 효능이 뛰어난 유전자 전달 벡터를 어떻게 효율적으로 생산할 것인가에 대한 답을 제시합니다.이 기술의 주요 장점은 DNA 미니스트링(ministrings) 제작을 위한 효율적이고 간단한 단일 단계 인비보(in vivo) 접근 방식이라는 점입니다. 배지를 만들기 위해 LB 500 milliliters, TB 600 milliliters, 그리고 플레이트용 LB agar를 준비한 후, 121 °C에서 30분 동안 오토클레이브(autoclave) 처리합니다. 냉각 후, 각 배지에 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 암피실린(ampicillin)을 첨가합니다.액체 배지는 4°C에서 보관하십시오. 그런 다음, 15~20 mL의 LB agar plus amp를 멸균된 페트리 접시에 붓고, 냉각 후 4°C에서 뒤집어 보관하십시오. W3NN PDMS 세포를 LB agar plus ampicilin에 스트리킹하고, 단일 콜로니가 관찰될 때까지 30°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.그 다음, 스트리크 플레이트의 단일 콜로니를 이용하여 ampicillin이 첨가된 LB 배지 5 mL에 접종하여 W3NN PDMS의 하룻밤 배양액을 준비합니다. 배양액을 30 °C, 230~250 RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다. 125 mL 삼각플라스크에 ampicillin이 첨가된 LB 배지 10 mL를 넣고, W3NN PDMS 하룻밤 배양액 100 µL를 접종하여 100배 희석합니다.배양액이 육안으로 보기에 탁해지고 대수 증식기 중기에서 후기에 도달할 때까지 30 °C, 250 RPM에서 배양합니다. 그다음, 배양액 1 mL를 깨끗한 큐벳으로 옮깁니다. 그런 다음, 600 nm 파장의 UV-Vis 분광광도계와 세포 성장에 사용한 배지를 사용하여 블랭크를 설정한 후, 배양액의 빛 흡광도를 측정합니다.배양이 아직 적절한 OD에 도달하지 않았다면, 다시 진탕배양기에 넣고 30분마다 확인하십시오. 배양이 대수 증식기 중간 단계(mid-log phase)에 도달하면, 멸균된 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.투명한 상층액을 적절한 생물학적 위험 폐기물 용기에 따라내고, 100 µL의 LB plus amp를 사용하여 피펫팅하거나 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁합니다. 미니스트링(ministring) 생산을 유도하려면, 125 mL 삼각 플라스크에 20 mL의 LB plus amp를 넣고 42 °C로 가열합니다. 재현탁된 펠렛을 예열된 배지로 옮기고 42 °C, 250 RPM에서 로그 단계(log phase)를 지날 때까지, 또는 20 mL의 경우 최대 1시간 동안 배양합니다.온도를 37 °C로 낮추고, 배양물을 90분 동안 더 배양합니다. 그 다음, 온도를 30 °C로 더 낮춘 후 200 rpm으로 흔들어 2시간 동안 배양합니다. 미니스트링(ministrings)을 수확하려면 배양물을 멸균된 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다.그런 다음 10,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿이 형성되었는지 확인합니다. 마지막으로 상층액을 따라내고 상용 추출 및 엔도톡신 제거 키트를 사용하여 플라스미드를 추출합니다. DNA 추출 후, 잔류 전구체 플라스미드, LCC 원핵생물 백본 및 DNA 미니스트링이 회수되며, 여기에서 보는 바와 같이 아가로스 겔 전기영동으로 분리할 수 있습니다.ministring 정제에 앞서, 이 단계에서 ministring의 밴드 강도를 부모 플라스미드와 비교하여 ministring 생성 여부를 정성적으로 평가할 수 있습니다. 이 그림은 프로토콜 수행 중 다양한 조건에서 나타날 수 있는 ministring 생성 효율을 요약하여 보여줍니다. ministring 생성 효율은 DNA 밴드 강도를 기준으로 결정되었습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 8시간 이내에 전체 과정을 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 정확한 온도 변화 조건을 준수하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 미니스트링을 분리하거나 생산 효율을 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동 또는 엔도뉴클레아제 제한효소 처리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 기술은 진핵세포로의 유전자 전달 효율을 크게 높일 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 당사의 생산 플랫폼을 사용하여 DNA 미니스링(ministring) 생산을 최대화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 사용할 때 UV 조사기는 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 적절한 실험실 안전 장비를 착용해야 함을 잊지 마십시오.

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

이 논문은 DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포에 의해 가해지는 수용체 힘을 이미지화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 수용체 힘&gt;4.7pN을 실시간으로 매핑할 수 있으며 시간이 지남에 따라 힘을 통합할 수 있습니다.

면역 세포에 의한 일시적인 피코네톤 수용체 힘을 매핑하는 DNA 장력 프로브

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

이 비디오 아카이브 포르말린 고정 재료를 포함한 다양한 소스에서 격리 수있는 DNA의 단지 25-100 NG를 사용하여 전체 인간 게놈을 검사 전체 게놈 기와 경로 배열 CGH에 대한 하이브 리다이 제이션 프로토콜의 기술 데모입니다.

전체 게놈 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 기술의 데모

이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

학습하세요 DNA ministrings 생산 프로토콜을 통해 안전하고 효율적인 비바이럴 유전자 전달 벡터를 만드는 방법을 배우세요. 이 단순한 체온 유도 시스템은 8시간 이내에 완료 가능하며 진핵세포 유전자 전달 효율을 크게 향상시킵니다.

이중 가닥 DNA Ministrings의 생산

더 많은 동영상 탐색