Name: 신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 신생기 모자 분리를 이용한 전립선 비만 세포 활성화 및 회음부 기계적 감수성 평가 방법을 C57BL/6 수컷 마우스에서. 이 기법은 만성 골반통 증후군 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술 지원을 해준 Janelle Ryals, Rachel Supple 및 Frank Wang에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 NIH 보조금 R03 DK080182(JAC), R01 DK099611(JAC), R01 DK103872(JAC), COBRE(Center of Biomedical Research Excellence) 보조금 P20 GM104936(JAC), Kansas Institutional Development Award(IDeA) P20 GM103418의 창업 자금 및 핵심 지원, Kansas IDDRC P30 HD002528의 핵심 지원, The Madison and Lila Self Fellowship Program(ANP)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 캔자스 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 지정된 지침에 따라 NIH 가이드 라인을 준수합니다. 1. 신생아 모자 분리 (NMS) <ol><li> 쓰레기 출생 매일 임신 댐을 모니터링합니다. 참고 : 태어난 쓰레기가 P0으로 간주되는 날. </li><li> (P1)에서 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다. </li><li> 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러. </li><li> 적절하게 2 패 유리 비커를 표시, 깨끗한로 홈 케이지 침구 1-2cm의 깊이를 추가합니다. 유리 비커에 홈 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 소재, 예를 들어, nestlet, 주름 종이의 약 절반을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 같은 비커에, 개별적으로, 하나의 쓰레기에서 새끼를 모두 넣습니다. </li><li> 즉시 배치인큐베이터에서 비커는 180 분 동안 33 O C와 50 %의 습도에서 개최. </li><li> 차 컨테이너에서 댐을 제거하고 홈 케이지에 그녀를 돌려줍니다. 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 홈 케이지를 돌려줍니다. </li><li> , NMS를 받고 각 쓰레기 / 댐 깨끗한 장갑 및 보조 용기를 사용하여 각 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 그들은 제거로 180 분간 분리 기간의 끝에서와 같은 순서로 자신의 홈 케이지로 돌려 담가. </li><li> 이전에 하루에 분리 된 첫 번째 쓰레기의 홈 케이지를 검색합니다. 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다. </li><li> 인큐베이터에서 첫 번째 비커를 제거하고 새끼를 처리하는 동안 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러. </li><li> 조심스럽게 집 케이지에 비커에서, 개별적으로, 새끼를 이동합니다. </li><li> 에 비커에 남아있는 우라늄 농축과 침구를 돌려줍니다홈 케이지. </li><li> 홈 케이지에 차 컨테이너에서 댐을 돌아 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 돌아갑니다. </li><li> 물을 비이커를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 분리 절차를 통해 각각의 쓰레기에 대해 동일한 비커를 사용합니다. </li><li> 그들은 배양기에 넣고, 같은 순서로 NMS를 받고 각각의 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 각각의 쓰레기 겪고 NMS (P21)를 통해 매일 매일이 전체 절차를 반복합니다. </li><li> 음식과 물을 완벽하게 깨끗한 케이지에서 함께 동성의 한배 새끼를 배치하여 P22에 NMS와 순진한 새끼를 유아. 순진한 새끼가 태어나 NMS 마우스와 같은 조건에서 보관하지만 일반 축산 작업 이외의 추가 처리를 받게 될 수 없습니다. </li></ol> 2. Perigenital 기계 감도 <ol><li> 프레이 장치 설치 <ol><li> 테스트 룸에 마우스를 가져오고 그들이 30 적응 할 수 있도록분은 자신의 홈 케이지에 남아있다. </li><li> 연구자는 마우스, 높이 약 55cm를 깜짝 놀랄없이 아래쪽에서 접근 할 수 있도록 충분한 공간을 제공하는 높은 와이어 메쉬 탑 테이블 (79cm X 28cm) 아래에 흡수 underpad을 배치하여 테스트 영역을 준비합니다. </li><li> 분명,이 뚫린 플라스틱 챔버에서, 개별적으로, 12 마우스에 철망 테이블 상단에 (11cm X 5cm X 3.5 cm)를 놓습니다. 탈출 마우스를 방지하기 위해 챔버 위에 무거운 물체를 놓습니다. </li><li> 움츠림 역치 평가 이전 화면에 추가로 30 분 동안 마우스를 적응. </li></ol></li><li> Perigenital 기계 감도 평가 <ol><li> 경사 본 프레이 모노 필라멘트 (43)의 표준 세트를 사용하는 업 - 다운 방법을 수행. 다음과 같은 모노 필라멘트를 사용하여 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g 및 4.74 g의. <ol><li> 3.22 G 모노 필라멘트의 기초를 잡고 후퇴 모노 노출필라멘트. 참고 : 일부 모델은 후퇴 모노 필라멘트가 없을 수 있습니다. </li><li> 모노 필라멘트가 수직 배향되도록 프로브를 놓다 및 마우스, 경보 움직이며, 그 체중이 뒷발에 고르게 분배 될 때 약간까지, 정중선을 피하고, 음낭 좌우 양측에 적용 벤드는 필라멘트에서 관찰된다. </li><li> 10 초 동안이나 동물이 긍정적 인 반응을 보일 때까지 자리에 모노 필라멘트를 잡습니다. 참고 : 긍정적 인 반응은 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 모노 필라멘트 지향 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 간주됩니다. 이러한 행동을 표시하지 않고, 10 초 모노 필라멘트의인가 마우스 이동, 모노 필라멘트는 최소 1 분 길이의 휴지 기간 다음 재시험되어야한다면. 마우스 이동도도 10 초 모노 필라멘트인가에 나열된 전술 한 동작이 나타나는 경우, 부정 응답 여겨진다. </li><html><li> 실험실 노트북 또는 노트북에, 음 또는 양 중, 응답을 기록하고 3.22 g의 모노 필라멘트를 사용하여 나머지 쥐 모두에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 다시 다음 적절한 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 모두 테스트합니다. 주 : 마우스 3.22 g 모노 필라멘트로 부정 응답을 나타내 경우 동일한 방법으로 3.61 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. 마우스 3.22 g 모노 필라멘트에 양성 반응을 나타내 경우 2.83 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. </li></ol></li><li> 제 양성 반응이 관찰 된 후에 추가의 애플리케이션을위한 4, 적절한 다음 크거나 작은 각 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 시험 계속. </li><li> 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다. </li><li> Chaplan 등. (43)에 기재된 바와 같이 50 % g 움츠림 역치를 계산하는 로그 단위 시험 시리즈인가 최종 본 프레이 모노 필라멘트의 값을 사용한다. </li></ol></li></ol>제목 &quot;&gt; 3. 산성화 톨루이딘 블루 비만 세포 염색 <ol><li> 조직 처리 <ol><li> intracardially 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 45 관류 된 마우스로부터 전립선 조직 44 해부. 후위 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 한 후 4 ° CO / N에 1X PBS의 30 % 자당에 cryoprotect. </li><li> 헵탄의 작은 (30 ml)에 목욕을 준비하고 드라이 아이스에 놓습니다. </li><li> 1X PBS에서 전립선 조직을 씻어 빛 의무 닦아 사용하여 건조. </li><li> 이 동결 될 때까지 차가운 헵탄으로 전립선 조직을 삽입합니다. </li><li> 냉동 될 때까지 즉시 드라이 아이스에 장착 매체와 장소를 포함하는 cryomold에 냉동 전립선 조직을 배치합니다. </li><li> 스토어는 -20 ° C에서 cryomolds. </li><li> 가로 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm의 두께 저온부로 전립선 조직을 잘라. </li><li> 긍정적으로 충전 된 현미경 슬라이드에, 조직의 길이에 걸쳐 12 비 직렬 저온부 - 8 놓습니다. </li><li> 저장소 추가 처리 할 때까지 -20 ° C에서 슬라이드를 마쳤다. </li></ol></li><li> 산성화 된 톨루이딘 블루 준비 <ol><li> 1 % 스톡 용액을 제조 할 때까지 용액에 100 ml의 70 % 에탄올과 와류에 톨루이딘 블루 O 1 g을 넣고. 원액은 최대 3 주 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 교반 판의 상단에 배치 비커에 100ml의 물에 1g의 NaCl을 추가합니다. </li><li> 달성되는 1.0 - 0.5의 pH 범위까지 12 M 염산을 사용하여 NaCl 용액의 pH를 조정한다. </li><li> 톨루이딘 블루 스톡 용액 8 ml의 1 % NaCl 용액 32 ㎖에 결합하여 0.25 % 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비한다. 톨루이딘 블루 원액의 전체 통합을 보장하고 소용돌이를 사용하여 혼합 아래로 피펫합니다. 작업 솔루션은 신선한 만든 및 사용 후 폐기해야합니다. </li></ol></li><li> 전립선 저온부 염색 <ol><li> 냉동고에서 처리되는 슬라이드를 제거하고 약 30 m에서 RT로 평형을 허용있다. </li><li> 개별적으로 슬라이드 마운트 조직 섹션 완전히 잠수되는 것을 보장하기 위해 1X PBS의 충분한 양을 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 약 1 초 동안 침지하여 슬라이드 조직 절편을 씻는다. 슬라이드는 종이 타월에 공기 건조하도록 허용합니다. </li><li> 충분히 0.25 % 작업 톨루이딘 블루 솔루션을 포함하는 유리 염색 항아리에 넣어 슬라이드는 슬라이드에 장착 된 조직 절편이 완전히 침수 될 수 있도록 10 동안 배양 - 동안 15 rpm으로 설정 플랫폼 로커에 15 분. </li><li> 약 1 초 동안 1X PBS에서 딥 슬라이드 초과 톨루이딘 블루를 씻어. </li><li> 슬라이드 배수를 허용하도록 그들의 양쪽되는 방식으로 슬라이드 박스 또는 선반 슬라이드를 놓는다. </li><li> 2 시간 또는 RT에서 O / N의 최소 37 ° C의 오븐에서 슬라이드를 건조. </li><li> 알코올 노출 사이의 슬라이드는 완전히 건조 있도록 신속 알코올을 사용하여 슬라이드를 탈수. 종이 수건에 배수에 의해 건조 슬라이드차 경량으로 닦아 백업 및 가장자리가 닦습니다. <ol><li> 약 1 초 동안 95 % EtOH로에서 슬라이드를 담그고 완전히 건조 할 수 있습니다. 조직이 보라색보다 더 푸른 건조 될 때까지 10 회 -이 절차 1을 반복합니다. </li><li> 약 1 초 동안 100 %의 EtOH에 슬라이드를 담그고 완전히 말리십시오. 조직이 매체 파란색으로 어두운하지만, 보라색되지 때까지 10 배 -이 절차 1을 반복합니다. </li></ol></li><li> 3 분 동안 100 % 크실렌의 슬라이드를 배양하여 얼룩을 수정합니다. 건조하도록 허용합니다. </li><li> 글리세롤, PBS, 또는 자일 렌 계 영구 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립. 실온에서 초과 용지 및 저장을 배출합니다. </li></ol></li><li> 정량화 비만 세포 <ol><li> 20X 배율 광학 현미경을 사용하여 (그림 2)에서 톨루이딘 블루 스테인드 조직 섹션을 시각화. </li><li> 가시 영역 내에 존재하는 비만 세포의 총 수를 계산 및 비 degranulated degranulated 및 비만 세포를 구별. 40X의 MAGNIFICAT이온 일부 비만 세포에서 과립의 상태를 확인하기 위해 필요할 수있다. 참고 : 비 degranulated 비만 세포가 없거나 희미 핵 개요 및 / 또는 세포 주위에 세분화 된 압출과 밀도 metachromasia을 나타낸다. Degranulated 비만 세포는 덜 심한 metachromasia를 나타내고 세포질 내 및 셀 경계 외부 핵 및 / 또는 자유 과립 명백한 명확한 윤곽을 갖는다. </li><li> 현재 조직 절편의 전체 비 degranulated degranulated 및 비만 세포의 총 수를 지속적으로 평가. 길이 각 조직에 걸쳐, 최소 7 추가적인 별도의 섹션에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 하기 식에 따라 각 조직 / 전체 마우스 비만 세포에 degranulated (DG)의 비율을 계산한다 (DG 비만 세포 / 총 비만 세포) × 100. </li></ol></li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 성인 수컷 마우스에서 CP / CPPS 나타내는 symptomology를 유도하기 위해, NMS의 형태, 신생아 응력을 사용하는 방법을 제공한다. 성인, NMS 마우스는 상당한 perigenital 기계적 이질통뿐만 아니라 전립선 조직 비만 세포 탈과립의 증거를 표시. NMS의 사용으로, 그것은 종종 만성 골반통 12-14 환자에서보고 어릴 응력을 복제하는 것을 CP / CPPS의 전임상 모델을 개발할뿐만 아니라 비 침습적 유도를 포함하는 신규 한 접근법 더 일반적으로, 화학적으로, 사용 전립선 34,36-39의 염증을 면역 학적으로 유도하는 데 반대했다. ,에 의해 전시 된 동반 신체, 기분, 그리고 내장 질환과 유사 (데이터가 표시되지 16) 또한, 마우스의 NMS는 과민 반응을 변경된 불안 같은과 anhedonic 행동을 포함하여 동반 symptomology, 증가 배뇨 속도를 생산하고, 뒷발 것으로 나타났다 CP / CPPS의 patie국세청 <s...

만성 골반통 자체가 질병이 아니라, 과민성 대장 증후군 (IBS)으로 진단 환자가 경험 지속적인 자발 및 / 또는 유발 통증, 간질 성 방광염 / 통증 방광 증후군 (IC / PBS), vulvodynia와 연관된 기간, 만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS). 이러한 증후군은 종종 면역계, 중추 신경계, 말초 신경계 내에서 부전 이러한 질환 (1)의 유지 보수 및 진행에 기여하는 것으로되어 있지만, 그들이, 연관된 병리 또는 식별 근본적인 원인이 없다고 많은 특성을 동반하고 공유되고 -3. 만성 골반 통증 환자의 증상을 제시 할 가능성이 추가, 비 골반 관련 hypothalamic-의 변경된 기능과 관련되어 불안, 우울증과 공황 장애 4-6, 포함 기능 통증 질환 및 기분 장애를, pituitary-부신 (HPA) 축 7-10. 초기 생활 스트레스 나 외상에 노출 HPA 이상과 관련된 만성 통증 증후군 (10, 11)과 같은 개발을위한 중요한 위험 인자, 기능 골반 통증 장애 환자의 상당 부분 집합은 학대 나 방치 등의 부작용 어린 시절의 사건을 경험 한보고한다 12-14. preweaning 기간 동안 일정 시간 동안 자신의 댐에서 새끼를 제거하는 것을 포함 신생아 산모의 분리 (NMS)의 설치류 모델은 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 지난 20 년간 사용되어왔다. 일반적으로, NMS 직접 시상 하부 내에서 유전자 발현에 영향을 미칠뿐만 아니라, 변연 구조 15-18 하류 조절을 방해하여, HPA 축의 활성화 및 결과적인 불안 같은 행동을 증가시키는 것으로 나타났다. 적절한 HPA 축 작동 중단 증가 대장 19-22에 기여하는 것으로 나타났다 </sup&gt; 및 질 (16) 감도는 NMS 설치류 모델이 표시되지만 산후 방광 염증 23-25의 장기적인 효과의 광범위한 특성에도 불구하고, 초기 생명 응력의 영향은 크게 비뇨 기관에서 배우지왔다. 따라서, 다음의 연구는 마우스에서 NMS을 수행하고 나중에 CP / CPPS위한 전임상 모델로서 남성 NMS 마우스의 사용을 확인하는 전립선 perigenital 기계적 감도 및 비만 세포 침윤 / 활성화를 평가하는 방법을 설명한다. 진단 만성 골반 통증 질환의 모든 중, CP / CPPS는 요통이나 류마티스의 두 번 아마도 약 14 % (26)의 평생 유병률과 4,400달러 (추정 연간 환자 비용에도 불구하고 가장 잘 인식과 특징 증후군이다 관절염 27). 회음부, 항문이, 전립선, 음경, 고환, 및 / 또는 복부 (28)는, 하이를 경험에 CP / CPPS 보고서 통증 환자gher 대조군 (29)보다 심리적 스트레스의 정도, 그리고 나의 증상이 일반적으로 현재는 동반 만성 골반 통증이나 기분 장애 5,29-31으로 진단된다. 재발 성 감염, 누설 상피, 신경성 염증 및자가 면역 모두 기저 전위 / CPPS 2,32,33 CP의 요인뿐만 아니라, 비만 세포 활성 및 탈과립 (34)로 추측되고있다. 또한 증가하고, 비만 세포 활성화 마커 CP / CPPS 남성로부터 발현 전립선 분비물 비만 세포 트립 타제 및 신경 성장 인자 (NGF) 레벨 (34)이 증가하였고, 이후 연구 트립 타 아제를 확인하고 (CPA3)를 카르복시 CP / CPPS 환자 (35)의 소변. 발병 및 CP / CPPS의 유지 보수에 비만 세포의 잠재적 인 역할은 지금까지이 증후군에 대한 동물 연구의 주요 초점이되고있다. 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델이 CP를 연구하는 데 사용 / CPPS는 실험자가 면역 전립선 염이다 (EAP) 모델 겐34,36-39 사용 종과 변형에 따라 전립선 염증의 변화도 초래 완전 프로 인트 보조제, 전립선 항원의 피하 주사에 의해 erated. 비만 세포의 침윤 및 활성화 / 탈과립은 EAP 34,35,40의 다음 유도를 증가하는 것으로 나타났다. 비만 세포 (34) 또는 트립 타제 수용체 PAR2 (35) 중 하나에 결함이 형질 전환 마우스는 야생형 EAP 마우스와 달리 EAP 다음 전립선 전술 감도를 개발하지 않습니다. 이 전임상 모델은 인간의 CP / CPPS의 많은 특징을 복제하는 동안, 유도 프로토콜 직접적인 염증, 감염, 또는 전립선의 손상을 포함하지 않는 종종 다양한 원인을 가지고 있으며, 인간의 상태를 나타내는 아니다. 인간의 CP / CPPS의 개발에 초기 생활 스트레스의 영향은 크게 uninvestigated 갔다; 그러나, 후진타오, 등. (41)에 의해 연구는 나를 시연N 어린 시절 신체적, 감정적 인의 역사를보고, 및 / 또는 성적 학대는 CP / CPPS을 암시하는 증상을 경험 훨씬 더 많은 것으로 나타났다 사람들. 또한, 그들은 고통과 소변 점수가 모두 신체적, 정서적 학대의 역사를 가진 환자에서 증가 된 것으로 나타났다. 우리는 이전에 암컷 C57BL / 6 마우스에서 NMS 같은 패러다임에 질 과민증 비정상적인 유전자 발현을 생산하고 있음을 증명하고있다 양쪽 성기 및 역기능 HPA 축 (16)의 출력 암시 방광. 보다 명확 어릴 응력 노출 12-14과 연계되는 것으로 도시되었다 IC / PBS 및 기분 장애를 포함하는 다른 동반 질환 (42), 제시하는 CP / CPPS 환자의 높은 유병률과 결합이 증거는, 사용에 대한 근거를 제공한다 NMS 모델 생쥐에서 CP / CPPS을 알아보고자 하였다.

<table><tbody><tr><td>임산부 C57BL/6 암컷 마우스&nbsp;</td><td>찰스 리버</td><td>027</td><td>시간 측정 또는 시간 제한이 없는 임산부는 가정 출산을 위해 매일 모니터링해야 합니다.</td></tr><tr><td>2L 유리 비커</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10002L</td><td>각 NMS 깔짚은 21일의 분리 기간 동안 동일한 비커에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>VWR 강제 공기 인큐베이터, 기본</td><td>VWR International</td><td>414005-124</td><td>인큐베이터는 33°C에서 개최되어야 합니다. C 및 50% 습도.</td></tr><tr><td>터치 테스트 감각 평가기, 20개들이 키트 (터치 평가용 Semmes-Weinstein von Frey 감각계)</td><td>Stoelting</td><td>58011</td><td>생식기 주변 민감도 평가를 위해 다음 모노필라멘트를 사용해야 합니다: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, 4.74 g.</td></tr><tr><td>동물 우리 (12 마리, 6 마리의 쥐)</td><td>IITC</td><td>435</td><td>쥐가 탈출하는 것을 방지하기 위해 개별 아크릴 동물 울타리 위에 무거운 물체를 올려 놓으십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>생쥐와 쥐를 위한 메쉬 스탠드 (12마리, 6마리의 쥐)</td><td>IITC</td><td>410</td><td>편안한 접근을 위해 안정적인 테이블 위에 스탠드를 놓습니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>은 10x PBS 스톡을 1x PBS로 희석합니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>비만 세포 염색을 준비하기 위해 마우스와 후위 조직을 심내 관류하려면 4% 파라포름알데히드 용액이 필요합니다.</td></tr><tr><td>자당</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>S5016</td><td>: 4 °C에서 30 % 자당 용액의 Cryoprotect 고정 조직; 하룻밤 사이에 C.</td></tr><tr><td>헵탄</td><td>시그마-알드리치(Heptane Sigma-Aldrich</td>) <td>246654</td><td>드라이아이스에서 헵탄을 식혀 조직을 얼립니다.</td></tr><tr><td>표준 Cryomold&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>4557</td><td>냉동 절편 전 전립선 조직 동결을 돕기 위해</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>12 x 125 ml</td></tr><tr><td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td>75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>생물학적 염색 위원회의 인증을 받았습니다. 비만 세포의 변색 염색제로 사용하기에 적합합니다.</td></tr><tr><td>에탄올, 앱솔루트(200프루프)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>분자생물학 등급, Fisher 생물시약; 비만 세포 시각화 전에 염색된 동결 절편을 탈수하기 위해 95% 및 100% 용액이 필요합니다.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>산성화 NaCl 용액은 저온 절편을 염색하기 전에 신선하게 만들어야 합니다.</td></tr><tr><td>GeneMate 멸균 50 ml 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>C-3394</td><td>일회용 튜브는 툴리딘 블루 요소를 혼합하거나 슬라이드를 1xPBS에 담그는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>10 슬라이드용 코플린 염색 접시, 접지 유리 커버 포함</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-815</td><td>최대 10개의 표준 3 x 1인치를 담을 수 있습니다. (75 x 25mm)가 연달아 미끄러집니다. 톨루이딘 블루 작업 용액, 95% EtOH, 100% EtOH 및 자일렌에 대해서는 별도의 접시를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>자일렌(조직학적)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P</td><td>탈수가 완료되면 조직은 자일렌으로 제거됩니다.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 박스, 100자리</td><td>VWR International</td><td>82003</td><td>박스는 슬라이드의 보관 및 운송에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 현미경 슬라이드 박스</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-400</td><td>이 슬라이드 박스는 일반적으로 극저온 상태 내부에 들어갈 수 있을 만큼 작습니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>글리세롤은 전통적인 장착 매체입니다.</td></tr><tr><td>마운팅 미디어, Richard-Allan Scientific</td><td>VWR International</td><td>4111</td><td>마운팅 미디어는 커버슬립을 슬라이드에 단단히 접착합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경, 직사각형, No. 1</td><td>VWR International</td><td>48393-106</td><td>샘플을 보호하기 위해 탈수 및 세척된 조직 위에 커버슬립을 놓습니다.</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>우리 연구실에서 사용하는 고급 자동 연구 현미경 Eclipse 90i는 중단되었으며 Eclipse Ni-E를 대체했습니다. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS)은 14 %의 평생 유병률이 50 세 미만의 사람에 대한 가장 일반적인 비뇨기과 진단이다, 그러나 그것은 적어도 이해하고 연구 만성 골반 통증 질환이다. 만성 골반 통증 보고서 환자의 중요한 부분 집합은 현저하게 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축의 기능 및 규제에 영향을 미칠 수있는 생애 초기 스트레스 또는 학대를 경험 한. 표시되었습니다 비만 세포의 활성화는, 부분적으로 HPA 축 다운 스트림 활성화에 의해 조절된다, 모두 소변으로 증가 CP / CPPS 환자의 전립선 분비물을 표현한다. 신생아 산모의 분리 (NMS)는 HPA 축과 내장 감도의 변화를 포함한 설치류 모델에서 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 여기에서 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스에서 CP / CPPS의 전임상 모델로 NMS를 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 방법을 설명perigenital 기계적 이질통 및 비만 세포 활성화의 증거를 조직 학적 평가, NMS를 행하는. 우리는 또한 초기의 심리적 스트레스가 마우스에서 남성 비뇨 생식기 시스템에 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공한다.

NMS받은 마우스는 CP / CPPS를 나타내는 행동의 증거를 보여 주었다. 프레이 모노 필라멘트 8 주령 NMS 마우스의 등급 일련의 시험 할 때 (N = 4) 순진 대응에 비해 perigenital 기계적 이질통을 표시 (N = 5, 그림 2). 모노 필라멘트 지향 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 기록, 긍정적 인 행동 반응을 이끌어 낸 기계 탈퇴 임계 값에서, 이것은 상당한 감소 (학생의 t- 테스트 P &lt;0.01)로 입증된다 . NMS에 노출 된 마우스는 CP / CPPS의 조직 학적 증거를 표시. 전립선 조직의 저온 섹션은 비만 세포 (도 3A-D)에 수납 트립 타 아제 과립을 관찰로 산성화 O 톨루이딘 블루 염색 하였다. 활성화, 예를 들면, 확산 metachroma 증거를 보였다 비만 세포의 백분율SIA,...

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다.

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

다음 실험의 전반적인 목적은 신생아기 모체 분리를 겪은 C 57 black six 수컷 생쥐의 생식기 주변 기계적 민감도와 전립선 내 비만 세포 활성화를 측정함으로써, 초기 생애 스트레스가 비뇨생식계에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 C 57 black six 생쥐 새끼 무리에 대해 20일 연속으로 신생아기 모체 분리를 수행하여 초기 생애 스트레스를 유도합니다. 두 번째 단계에서는 생식기 주변 부위에 일련의 Von Frey 모노필라멘트를 적용하여 생식기 주변 기계적 민감도를 측정합니다.다음으로, 비만 세포 활성화를 정량화하기 위해 생쥐 전립선의 cryostat 절편에 대해 산성 톨루이딘 블루 염색을 수행합니다. 행동 및 조직학적 분석 결과, 신생아기 모성 분리가 생식기 주변의 기계적 민감도와 전립선 비만 세포 활성화를 증가시키는 것으로 나타났습니다.실험적 자가면역 전립선염과 같은 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 초기 발달 과정 중의 스트레스 노출을 포함한다는 점이며, 이는 만성 전립선염 환자들에게서 관찰되는 것과 유사하게 생애 후기에 증상을 촉발시킵니다. 이 방법은 초기 생애 스트레스가 행동에 미치는 영향과 같이 만성 골반 통증 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있으며, 변화된 통증 상태에 대한 조직학적 근거를 제공할 수 있습니다. 이 방법은 만성 전립선염에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 간질성 방광염, 통증성 방광 증후군, 외음부통, 섬유근육통 또는 편두통과 같은 다른 기능성 통증 증후군에도 적용될 수 있습니다.이는 불안 및 우울증과 같은 다른 일반적인 심리적 공존 질환에도 적용될 수 있습니다. 출산 다음 날, 어미 쥐를 홈 케이지에서 꺼내 깨끗한 보조 용기에 넣습니다. 깨끗한 장갑을 낀 양손 사이에 베딩 한 줌을 문질러 홈 케이지의 냄새를 유지한 다음, 홈 케이지 베딩을 1~2 cm 깊이로 깨끗하고 적절하게 라벨이 부착된 2 L 유리 비커에 옮깁니다. 또한, 네슬렛(nestlets)이나 크링클 페이퍼(crinkle paper)와 같이 홈 케이지에 있는 추가 보충 베딩 재료의 약 절반을 유리 비커에 추가합니다. 그다음, 한 배에서 태어난 모든 새끼 쥐들을 준비된 비커에 넣고 즉시 33 °C, 습도 50% 조건에서 180분 동안 둡니다.분리 배양 기간 동안, 2차 용기에서 모체(dam)를 꺼내어 홈 케이지로 돌려보냅니다. 홈 케이지를 비바리움 내의 적절한 사육 위치로 다시 옮깁니다. 분리 기간이 끝나면 홈 케이지를 회수하여 모체를 꺼낸 후, 깨끗한 2차 용기에 넣습니다.그 다음 비커를 인큐베이터에서 꺼내고, 새끼 쥐를 다루는 동안 홈 케이지의 냄새를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 양손 사이에 베딩을 한 움큼 떨어뜨립니다. 새끼 쥐를 비커에서 홈 케이지로 한 마리씩 조심스럽게 옮기고, 비커에 남아 있는 모든 풍부화 도구와 베딩을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다. 모든 새끼 쥐를 옮긴 후, 어미 쥐를 보조 용기에서 홈 케이지로 옮기고 비바리움 내의 적절한 사육 위치로 되돌려 놓습니다.생후 21일까지 매일 신생아 모체 분리를 실시하는 각 리터(litter)에 대해 이 전체 과정을 반복합니다. 그 후 새끼 쥐를 이유시키고, 실험 기간 내내 대조군 쥐와 동일한 조건에서 사육합니다. 높이 55 centimeters의 높게 설치된 와이어 메쉬 상판 테이블 아래에 흡수성 패드를 배치하여 테스트 구역을 준비합니다.테이블은 연구자가 생쥐를 놀라게 하지 않고 아래쪽에서 접근할 수 있도록 충분한 공간을 제공해야 합니다. 8주령의 생쥐를 최대 12마리까지 와이어 메쉬 테이블 위의 투명한 구멍 뚫린 플라스틱 챔버 아래에 각각 배치합니다. 생쥐가 탈출하는 것을 방지하기 위해 챔버 위에 무거운 물체를 올려둡니다.3포인트 22g von Frey 모노필라멘트의 하단을 잡고 수축된 모노필라멘트를 노출시킵니다. 모노필라멘트가 수직 방향이 되도록 프로브를 배치합니다. 생쥐가 깨어 있고 움직임이 없으며, 체중이 뒷발 양쪽에 고르게 분산되었을 때 측정합니다.필라멘트에 약간의 굴곡이 관찰될 때까지 정중선을 피해 음낭의 왼쪽 또는 오른쪽 중 한 곳에 적용합니다. 모노필라멘트를 10초 동안 유지하거나, 동물이 급격하게 움츠러들거나 점프하는 등의 반응, 또는 모노필라멘트를 향해 핥거나 무는 행동과 같은 양성 반응을 보일 때까지 유지합니다. 모노필라멘트를 적용하는 10초 동안 마우스가 움직이지 않거나 양성 반응을 보이지 않으면 음성 반응으로 기록하고, 동일한 크기의 필라멘트로 모든 마우스를 테스트한 후 다음 단계의 적절한 모노필라멘트로 교체합니다.각 마우스에 대해 적절하게 더 크거나 작은 모노필라멘트를 사용하여 4회 추가로 테스트를 계속합니다. 첫 번째 양성 반응이 관찰된 후, 9주령 마우스의 고정된 전립선 조직을 적출하여 7 micron 두께의 동결 절편으로 제작합니다. 다음으로, 100 milliliters의 70% ethanol에 1 gram의 toluidine blue O를 첨가하고 혼합물이 완전히 용해될 때까지 볼텍싱하여 1% toluidine blue 스톡 용액을 준비합니다.스톡 용액은 실온에서 최대 3주 동안 보관하십시오. 다른 비커에, 교반기 위에 놓인 100 milliliters의 물에 1 gram의 염화나트륨을 첨가하십시오. 염 용액의 pH가 0.5에서 1.0 범위가 될 때까지 12 molar 염산으로 pH를 조절하십시오.그 다음, 8mL의 Toluidine blue 스톡 용액과 32mL의 산성 1% 염화나트륨 용액을 혼합하여 0.25% 산성화 Toluidine blue 작업 용액을 준비합니다. Toluidine blue 스톡 용액이 완전히 혼합되도록 피펫팅하고 보텍스 믹서를 사용하여 섞으며, 슬라이드 배치마다 작업 용액을 새로 준비하십시오. 조직이 완전히 잠길 만큼 충분한 양의 PBS가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 슬라이드를 각각 약 1초 동안 담가 조직 절편을 세척합니다.슬라이드를 페이퍼 타월 위에서 자연 건조합니다. 다음으로, 조직 절편이 완전히 잠길 수 있을 만큼의 0.25% toluidine blue 작업 용액이 담긴 유리 스탠딩 자에 슬라이드를 넣습니다. 15 RPM으로 설정된 플랫폼 로커 위에서 슬라이드를 10분에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 슬라이드를 PBS에 약 1초 동안 담가 과량의 toluidine blue를 씻어내고, 배수가 가능하도록 슬라이드를 세운 상태로 슬라이드 보관함에 넣습니다. 슬라이드를 37°C 오븐에서 최소 2시간 동안 건조하거나 실온에서 하룻밤 동안 건조합니다.건조 후 슬라이드를 95% ethanol에 약 1초 동안 담갔다가 절편을 완전히 건조시킵니다. 조직이 보라색보다 더 푸른색으로 건조될 때까지 이 과정을 1~10회 반복합니다. 다음으로, 슬라이드를 100% ethanol에 약 1초 동안 담근 후 절편을 완전히 건조시킵니다.조직이 보라색이 되지 않으면서 진한 파란색에서 중간 파란색이 될 때까지 이 과정을 1회에서 10회 반복합니다. 마지막으로, 슬라이드를 100% xylene에 3분 동안 담가 염색액을 고정합니다. 슬라이드를 건조시킨 후, glycerol PPS 또는 xylene 기반의 영구 마운팅 매질을 사용하여 커버슬립을 덮습니다.남은 배지를 모두 제거하고 완성된 슬라이드를 실온에서 보관하십시오. 단계별 Von Frame Monofilaments를 사용하여 테스트한 결과, 8주령의 신생아 모성 분리 쥐는 대조군과 비교했을 때 생식기 주변 기계적 이질통을 보였습니다. 이는 양성 행동 반응을 유발하는 기계적 회피 역치가 유의하게 감소한 것으로 확인되었습니다.만성 전립선염/만성 골반통 증후군의 추가적인 증거를 조직학적으로 확인할 수 있으며, 여기 제시된 전립선 조직의 동결절편은 비만세포 내의 트립타제 과립을 관찰하기 위해 산성화된 o-toluidine blue로 염색한 것입니다. 신생아 분리 쥐의 전립선 절편에서는 대조군 쥐와 비교했을 때 탈과립된 비만세포의 비율이 유의미하게 높게 관찰되었습니다. 신생아 모성 분리를 수행할 때, 이 절차 이후 어미 쥐가 새끼를 거부하는 것을 방지하기 위해 사육 케이지의 냄새를 유지하는 것이 중요합니다.동반된 기분 장애에 대한 행동학적 근거를 평가하기 위해 오픈 필드 테스트나 두 가지 선택 액체 선호도 테스트와 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신생아기 모성 분리를 겪은 생쥐에서 만성 전립선염의 행동학적 및 조직학적 근거인 생식기 주변의 기계적 민감도와 전립선 비만세포 활성화를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Medicine

의학

전립선의 감염은 만성 prostatitis의 골반 통증을 중재에 기여 요소가 될 수 있습니다. 우리는 표준화 된 박테리아 inoculum, 시간이 지남에 따라 마우스에 촉각 allodynia을 측정하는 남성 마우스 및 방법론의 요도에 박테리아의 기지의 준비에 대한 절차를 설명합니다.

세균 Prostatitis의 손쥐 모델에 촉각 Allodynia 측정

Electronic von Frey 측정은 염증 사건 전후에 지속적으로 가해지는 압력 자극에 대한 설치류의 기계적 인출 임계값의 변화를 빠르고 정확하게 측정할 수 있기 때문에 고전적인 von Frey 필라멘트에 대한 효과적이고 개선된 대안입니다.

전자 폰 프레이 장치를 사용하여 생쥐의 뒷발에서 촉각 감도의 변화를 측정합니다.

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

이 프로토콜 설정 하 고 평가 하는 신생아 패 혈 증 7-하루-오래 된 쥐에 필요한 단계를 제공 합니다.

신생아 Polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

만성 심리사회적 스트레스(CGS) 패러다임은 임신 중 임상적으로 관련된 스트레스요인들을 고용하여 산모와 유아의 정신장애를 모델링합니다. 여기서는 CGS 패러다임 및 다운스트림 평가를 적용하여 이 모델의 유효성을 검사하는 단계별 절차를 제공합니다.

어머니와 유아에 있는 정신 장애에 대한 번역 관련 패러다임으로 임신에 있는 심리사회적 긴장의 Murine 모형을 이용하

산모 감염은 신경 발달 장애의 위험 요소입니다. 모체 면역 활성화(MIA)의 마우스 모델은 감염이 뇌 발달 및 기능에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다. 여기에서는 MIA에 노출된 안정적으로 회복력 있고 감수성이 있는 자손을 생산하기 위한 일반적인 지침과 절차가 제공됩니다.

자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

여기에서는 조기 생쥐 모델을 만들기 위한 간결한 프로토콜을 제시하여 조기 산후 통증 관리에 대한 연구를 촉진합니다. 이 방법은 출산 예정일 3일 전에 제왕절개를 하고, 자궁절제술을 통해 조산아 새끼를 추출하고, 대리모 댐의 생물학적 자손과 통합하는 것입니다.

통증 연구를 위한 조산쥐 모델

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

이 프로토콜은 출생 후 초기에 빈곤한 환경과 예측할 수 없는 산모의 보살핌으로 인한 초기 삶의 역경이 뇌 발달과 정신 장애의 미래 위험에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위한 동물 모델을 설명합니다.

제한된 침구와 둥지는 생쥐의 초기 삶의 역경에 대한 모델입니다.

이 논문은 초기 임신 염증이 신경발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 모체 면역 활성화(MIA) 마우스 모델을 생성하는 포괄적인 프로토콜을 제공하며, 신뢰성과 재현성을 보장하는 주요 지표를 포함합니다.

초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

학습하세요 신생기 모자 분리를 이용한 전립선 비만 세포 활성화 및 회음부 기계적 감수성 평가 방법을 C57BL/6 수컷 마우스에서. 이 기법은 만성 골반통 증후군 연구에 활용됩니다.

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

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