신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 신생아 산모 분리를 거친 수컷 C 57 black six 마우스의 전립선 내 생식기 주위 기계적 민감도 및 비만 세포 활성화를 측정하여 초기 생활 스트레스가 비뇨 생식기 시스템에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이는 20일 연속으로 조기 생활 스트레스를 유발하기 위해 C 57 블랙 여섯 마리의 새끼 고양이에 대해 먼저 신생아 모성 분리를 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 일련의 Von Fre 모노필라멘트를 생식기 주위 영역에 적용하여 생식기 주위의 기계적 민감도를 측정하는 것입니다.

다음으로, 산성화된 톨루이딘 블루 염색은 마우스 전립선의 저온 유지 절편에서 수행됩니다. 비만 세포 활성화를 정량화하기 위해. 결과는 신생아 산모 분리가 생식기 주위 기계적 민감도와 인공 비만 세포 활성화를 증가시킨다는 것을 우리의 행동 및 조직학적 분석을 기반으로 합니다.

실험적 자가면역 전립선염과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 초기 발달 과정에서 스트레스 노출을 통합하여 만성 전립선염 환자에서 관찰되는 것과 유사하게 나중에 증상을 촉진한다는 것입니다. 이 방법은 초기 생활 스트레스가 행동에 미치는 영향과 같은 만성 골반 통증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 변경된 통증 상태에 대한 조직학적 증거를 제공할 수 있습니다. 이 방법은 만성 전립선염에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 간질성 방광염, 통증성 방광 증후군, 외음부통, 섬유근육통 또는 편두통과 같은 다른 기능적 통증 증후군에도 적용할 수 있습니다.

불안 및 우울증과 같은 다른 일반적인 심리적 동반 질환에도 적용될 수 있습니다.출산 다음 날, 집 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 2차 용기에 아기를 넣습니다. 가정용 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손으로 한 줌의 침구를 문지른 다음 가정용 케이지 침구의 1-2cm 깊이를 깨끗하고 적절하게 라벨이 붙은 2리터 유리 스피커로 옮깁니다. 또한, 네슬릿 또는 주름진 종이와 같이 가정용 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 재료의 약 절반에서 유리 스피커에 개별적으로 다음 한 마리의 모든 새끼를 준비된 비커에 넣고 즉시 비커를 섭씨 33도, 습도 50%에서 180분 동안 놓습니다.

분리 된 잠복기 동안 2 차 용기에서 댐을 제거하고 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다. 홈 케이지를 사육장 내의 적절한 수용 위치로 되돌립니다. 분리 기간이 끝나면 가정용 케이지를 회수하고 댐을 제거하여 깨끗한 보조 용기에 넣습니다.

그런 다음 인큐베이터에서 비커를 제거하고 깨끗한 장갑을 낀 손 사이에 한 줌의 침구를 떨어뜨려 강아지를 다루는 동안 가정용 케이지의 냄새를 유지합니다. 비커에서 가정용 케이지로 강아지를 개별적으로 부드럽게 옮기고 비커에 남아 있는 농축 및 침구는 모두 가정용 케이지로 되돌립니다. 모든 새끼가 반환되면 댐을 보조 컨테이너에서 가정용 케이지로 옮기고 사육장 내의 적절한 수용 위치로 되돌립니다.

신생아 산모 분리를 겪는 각 새끼에 대해 출생 후 21일까지 매일 이 전체 절차를 반복합니다. 그런 다음 새끼를 젖을 떼고 실험 기간 동안 대조군 쥐와 동일한 조건에서 수용합니다. 55cm 높이의 높은 철망 상단 테이블 아래에 흡수성 언더패드를 배치하여 테스트 영역을 준비합니다.

테이블은 조사자가 쥐를 놀라게 하지 않고 아래쪽에서 접근할 수 있도록 충분한 공간을 제공해야 합니다. 최대 12 마리의 8 주 된 마우스를 철망 테이블 상단의 투명한 천공 플라스틱 챔버 아래에 개별적으로 놓습니다. 쥐가 탈출하지 못하도록 챔버 위에 무거운 물체를 올려 놓습니다.

3점 22g 폰 프레임 모노필라멘트의 바닥을 잡고 수축된 모노필라멘트를 노출시킵니다. 모노필라멘트가 수직 방향이 되도록 프로브를 배치합니다. 쥐가 깨어 있을 때 움직이지 않고 체중이 뒷발 사이에 고르게 분산됩니다.

필라멘트에서 약간의 구부러짐이 관찰될 때까지 정중선을 피하면서 음낭의 왼쪽 또는 오른쪽에 적용합니다. 10초 동안 또는 동물이 모노필라멘트를 향해 빠르게 경련하거나 점프하거나 핥거나 무는 행동과 같은 긍정적인 반응을 보일 때까지 모노필라멘트를 제자리에 유지합니다. 10초 모노필라멘트 적용 동안 마우스가 움직이지 않거나 긍정적인 반응을 보이지 않으면 동일한 크기의 필라멘트를 사용하여 모든 마우스에 대해 음성 반응을 기록한 다음 다음 적절한 모노필라멘트로 전환합니다.

추가로 4개의 응용 프로그램에 적합한 다음으로 크거나 작은 모노필라멘트를 사용하여 각 마우스를 계속 테스트합니다. 첫 번째 양성 반응이 관찰된 후, 9주 된 마우스의 전립선 조직을 7미크론 두께의 극저온 절편으로 고정한 다음 냉동 절편을 절개합니다. 다음으로, 100%에탄올 100ml에 톨루이딘 블루 O 1g을 첨가하여 1% 톨루이딘 블루 스톡 용액을 준비하고 용액에 들어갈 때까지 혼합물을 와류로 만듭니다.

원액을 최대 3주 동안 실온에 보관하십시오. 다른 비커에 교반 플레이트 위에 놓인 물 100ml에 염화나트륨 1g을 추가합니다. 0.5 내지 1.0의 pH 범위에 도달할 때까지 12몰 염산을 사용하여 염 용액의 pH를 조정합니다.

그런 다음 8ml의 Udine blue stock 용액과 32ml의 산성 1% 염화나트륨 용액을 결합하여 0.25%acidified toine blue 작업 용액을 준비합니다. 오딘 블루 스톡 용액과 혼합의 완전한 통합을 보장하기 위해 위아래로 파이프를 연결하고 와류를 사용하여 슬라이드의 각 배치에 대해 작업 솔루션을 새로 준비합니다. 조직을 완전히 잠길 수 있는 충분한 양의 PBS가 들어 있는 50ml 원추형 튜브에 슬라이드를 약 1초 동안 개별적으로 담궈 조직 절편을 세척합니다.

슬라이드를 종이 타월로 자연 건조시킵니다. 그런 다음 조직 섹션이 완전히 잠길 수 있도록 0.25% 톨루이딘 블루 작업 용액이 충분히 들어 있는 유리 스탠드 병에 슬라이드를 넣습니다. 15RPM으로 설정된 플랫폼 로커에서 10-15분 동안 슬라이드를 배양합니다.

그런 다음 슬라이드를 PBS에 약 1초 동안 담그어 여분의 톨 우딘 블루를 씻어내고 슬라이드가 옆으로 눕도록 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 배수를 허용하기 위해. 슬라이드를 섭씨 37도의 오븐에서 최소 2시간 동안 또는 실온에서 밤새 건조시킵니다.

건조되면 슬라이드를 95% 에탄올에 약 1초 동안 담근 다음 섹션이 완전히 건조되도록 합니다. 조직이 자주색보다 파란색으로 더 건조될 때까지 이 절차를 1-10회 반복합니다. 그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올에 약 1초 동안 담그고 섹션이 완전히 건조되도록 합니다.

조직이 자주색이 아닌 어둡거나 중간 정도의 파란색이 될 때까지 이 절차를 1-10회 반복합니다. 마지막으로 슬라이드를 100% 자일렌에서 3분 동안 배양하여 얼룩을 고정합니다. 건조시킨 다음 덮개를 덮고 글리세롤 PPS 또는 자일렌 기반 영구 장착 매체로 슬라이드를 밀어 넣습니다.

여분의 매체를 배출하고 완성된 슬라이드를 실온에 보관하십시오. 8주 된 신생아 산모 분리인 Von Frame Monofilaments의 등급별 시리즈로 테스트한 결과, 생쥐는 순진한 마우스와 비교했을 때 생식기 주위 기계적 이질통을 보였습니다. 이는 기계적 금단 역치가 현저히 감소하여 긍정적인 행동 반응을 이끌어낸 것으로 입증됩니다.

만성 전립선염 만성 골반 통증 증후군의 추가 증거는 비만 세포 내에 있는 트립타제 과립을 관찰하기 위해 산성화된 o toluidine blue로 염색된 전립선 조직의 냉동 유지 절편입니다. 과립화된 비만 세포의 현저하게 더 높은 비율이 신생아 분리 마우스의 전립선 절편에서 관찰되었습니다. 순진한 쥐와 비교할 때 신생아 산모 분리를 수행하는 동안 댐에 의해 새끼가 거부되지 않도록 가정 케이지의 냄새를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개방장 검사 또는 두 가지 선택 액체 선호와 같은 다른 방법을 사용하여 동반 기분 장애에 대한 행동 증거를 평가할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신생아 산모 분리 후 만성 전립선염 및 생쥐의 행동 및 조직학적 증거로서 생식기 주위 기계적 민감성과 전립선 비만 세포 활성화를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.