전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 전립선암을 생성하는 것입니다. 환자는 순환 종양 세포에서 유래한 이종 이식편. 이것은 먼저 진행성 전립선암 환자로부터 말초 혈액을 수집함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계로, 순환하는 종양 세포를 포함하는 혈액 단핵 세포 구획을 격리합니다. 다음으로, 단핵 세포를 CD 45 ZI 항체로 염색합니다.유세포 분석을 사용하여 순환 종양 세포를 선택하기 위해 세포를 면역이 저하된 마우스에 주입합니다. 결과는 전립선암 환자의 말초 혈액에서 유세포 분석으로 분리된 순환 종양 세포의 주입을 기반으로 한 전립선암 이종이식편의 생성을 보여줍니다.

이 방법은 전립선암의 분자 특성화 및 새로운 바이오마커 개발에 사용할 수 있는 새로운 실험 모델을 생성함으로써 전립선암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 학생인 Williams와 Mount Sinai의 종양학과 연구원인 Omada가 말초 혈액에 순환 종양 세포의 수가 많을 가능성이 있는 전이성 전립선암 환자로부터 전혈을 수집하는 것입니다. 10 밀리리터 혈청 피펫을 사용하여 전혈을 행크의 균형 소금 용액과 함께 50 밀리리터 폴리스티렌 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

일대일 비율로 혼합물을 부드럽게 피펫팅하여 균질화합니다. 다음으로, 15밀리리터의 FI 콜 팩 용액을 빈 50밀리리터 폴리스티렌 원뿔형 튜브에 추가합니다. 희석된 전혈 20ml를 용액 상단의 가장 낮은 설정으로 부드럽게 피펫팅하여 뚜렷한 상층을 형성합니다.

그런 다음 400Gs에서 30분 동안 튜브를 원심분리합니다. 실온에서 원심분리기의 감속을 가장 낮은 설정으로 설정하여 분리 후 용액이 혼합되는 것을 방지하십시오. 원심분리 후 혈장 최상층과 분리 용액 사이에 끼어 있는 말초 혈액 단핵 세포와 순환 종양 세포의 얇고 흰색인 회색 줄무늬를 식별합니다.

튜브 바닥에서 흰색 회색 줄무늬의 세포를 조심스럽게 모아 50ml 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 Hank's를 추가합니다. 총 부피 10 밀리리터를 위해 분리된 세포에 소금 용액의 균형을 맞춥니다.

혼합물을 실온에서 400 Gs에서 10 분 동안 다시 원심 분리하십시오. 세포를 씻기 위해서는 상등액을 제거하고이 세척을 반복하십시오. 한 번 더 단계를 밟습니다.

두 번째 세척 후에는 상층액을 버리십시오. 남은 펠릿을 5ml의 적혈구 용해 완충액에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 용액을 배양합니다. 다음으로, 실온에서 400Gs에서 3분 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 버려 용해 완충액을 제거합니다.

마지막으로, 염색하기 전에 10% 소 태아 혈청이 보충된 PBS 1ml에 펠릿을 재현탁시킵니다. 혈구, 세포분석기 또는 자동 세포 계수기에서 표준 trian blue exclusion 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 정량화합니다. 그런 다음 10% FBS를 사용하여 PBS에서 1밀리리터당 100만 개의 세포로 세포를 희석하고 1시간 동안 얼음 위에 놓습니다.

비특이적 결합을 차단하려면 세포 현탁액을 두 개의 별도 튜브로 분배합니다. 대조 세포용 튜브 하나와 대조 튜브의 CD 45 염색 세포용 튜브 하나를 라벨링합니다. 1에서 250의 희석으로 IgG 1 Kappa Zi를 최종 농도 10 밀리리터당 10 나노그램에 첨가합니다.

CD 45 염색 튜브에서. CD 45 ZI 접합 1차 항체를 밀리리터당 10나노그램의 동일한 농도로 첨가하고 30분 동안 얼음에서 세포 현탁액을 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 3분 동안 400Gs로 세포를 원심분리한 다음 스내팅을 버립니다.

10% FBS가 보충된 멸균 PBS에 각 펠릿을 현탁시켜 세포를 두 번 세척한 다음 섭씨 4도에서 3분 동안 400Gs에서 원심분리합니다. Resus를 세척한 후 1밀리리터당 10마이크로그램의 dappy stain이 포함된 PBS 1ml 용액에 세포를 현탁시킵니다. 세포 덩어리나 파편을 제거하기 위해 35마이크로미터 스트레이너 캡을 통해 최종 용액을 12mm x 75mm 폴리스티렌 튜브로 필터링합니다.

그런 다음 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 CD 45 양성 세포와 죽은 세포를 현탁액에서 제외하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 제거합니다. 분류된 전립선 종양 세포 현탁액과 세포외 기질 단백질을 1:1 비율로 혼합하고 혼합물을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 기관 지침에 따라 8-10주 된 남성 면역 결핍 구강을 분당 1리터의 산소에 5%를 흡입한 이소 불소를 사용하여 마취합니다.

마우스의 각막 및 발가락 반사 상실을 확인하여 적절한 마취를 보장합니다. 250 게이지 바늘과 1 밀리리터 주사기를 사용하여 250 마이크로 리터의 세포 현탁액을 뽑습니다. 그런 다음 피하 결절 밀도의 성장을 위해 마우스 주사 부위의 주간 촉진을 수행하여 종양을 모니터링하기 위해 세포외 기질 세포 현탁액의 전체 부피를 마우스의 양쪽 상부 측면에 피하

이 프로토콜에서 사용되는 음성 선택 방법에 따라 DAPI 염색을 사용하여 죽은 세포를 배제해야 합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 나머지 생존 가능한 세포에서 CD 45 음성 세포의 비율은 가변적이며 환자의 종양 부담에 따라 다르지만 CD 45 양성 세포에서 쉽게 분리됩니다. 적절한 게이팅을 사용하면 전립선 종양 세포 현탁액을 이식한 후 마우스의 양쪽 측면에서 피하 결절 밀도가 보일 수 있습니다.

각 결절 밀도는 이종 이식편의 성장을 나타내며 마우스의 등쪽 근육 조직에서 돌출되고 질감이 더 단단하기 때문에 건강한 조직과 구별되는 것으로 평가할 수 있습니다. 순환 종양 세포에서 생성된 환자 유래 이종 이식 모델은 hemat, toin 및 eosin 염색으로 볼 수 있듯이 인간 전립선 종양을 재현하고 안드로겐 수용체 및 전립선 특이막 항원과 같은 전립선 특이적 세포 마커에 대한 면역조직화학에 의해 이종이식을 생성한 후 이종 이식편을 생성합니다. 유전자 또는 단백질 발현 프로파일링과 같은 다른 프로토콜은 전립선암의 공격성에 기여하는 세포 및 분자 메커니즘을 탐구하기 위해 수행할 수 있습니다.