Name: 전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 전립선암 환자의 순환 종양 세포에서 유래한 환자 유래 이종이식 모델을 생성하는 방법을. 유세포 분석을 통해 CTC를 분리하여 면역결핍 마우스에 주입하면 전립선암 연구를 위한 새로운 실험 모델을 확보할 수 있습니다.

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유세포 분석에 도움을 주신 Mount Sinai Medical Center의 유세포 분석 공유 리소스의 Jordi Ochando 박사에게 감사드립니다. 이미징 지원을 제공해 주신 마운트 시나이 메디컬 센터(Mount Sinai Medical Center)의 현미경 공유 리소스 시설(Microscopy Shared Resource Facility)의 루마나 후크(Rumana Huq) 박사에게 감사드립니다. 저자는 이 프로젝트를 지원한 TJ Martell 재단에 감사를 표합니다.

이 프로토콜은 기관 연구 윤리 보드에서 승인을 우리의 기관에서 수행과 인간의 복지에 대한 모든, 기관, 국가, 국제 지침을 준수하고 있습니다. 고급 전립선 암 환자에서 말초 혈액 1. 컬렉션 참고 : 전이성 전립선 암 환자를 선택합니다. 기록 된 환자의 동의를 얻어 격리 연령 이전 화학 요법과 호르몬 치료를 포함하여 환자의 임상 적 특징을 기록한다. 전이성 질환을 가진 환자는 잠재적으로 말초 혈액에서 CTCS의 가장 높은 농도를해야합니다. <ol><li> 동의 후 적절한 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인하에 혈액 샘플을 수집합니다. 라텍스 장갑 및 절차 전반에 걸쳐 실험실 코트를 착용 할 것. </li><li> 바늘 홀더에 25 G 나비 바늘과 튜브를 연결합니다. 의 영역을 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용하여이두와 팔뚝 사이의 전주 정맥 후 환자의 상완에 지혈대를 적용합니다. </li><li> 전주 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 수집을 시작하기 위해 바늘 홀더에 혈액 수집 튜브를 밀어 넣습니다. 혈액 응고를 방지하기 위해 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유 수집 튜브에 혈액의 약 10 ㎖를 수집한다. </li><li> 환자에서 나비 바늘을 제거하고 1 분 동안 정맥 천자의 사이트를 통해 멸균 거즈 패드에 압력을 적용합니다. 멸균 붕대로 커버 사이트. </li></ol> 단핵 세포의 분리 (2) 주 : 1 단계에서 수집 된 혈액 단핵 CTCS 이외에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) (예 : 림프구 및 단핵구)를 포함 할 것이다. <ol><li> : 1 비율 피펫 전체 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 50ml의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 혈액과는 1 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 추가합니다. 조심스럽게 피펫 혼합물 균질화한다. </li><li> 빈 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관에 저속 밀도 구배 원심 분리하여 혈액 성분을 분리하기 위해 상업적으로 준비된 솔루션 (피콜 - 페이크)의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 별개 상부층을 형성하는 단계에서 2.2 폴리스티렌 튜브에, 단계 2.1에서, 전혈 및 HBSS 혼합물을 피펫. 솔루션의 혼합을 최소화하기 위해 낮은 설정으로 설정 피펫이 효율적인 분리를 보장합니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 400 XG (25 °의 C)에서 원심 분리한다. 가장 낮은 설정으로 감속 분리 후 솔루션의 혼합을 방지합니다. 가속도가 어떤 속도로 설정 될 수있다. </li><li> 원심 분리 후, 튜브의 하단에 상단과 분리 솔루션에 플라즈마 사이의 PBMC를하고 CTCS 끼워 층의 얇은 흰색 - 회색 스트라이프를 식별합니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 50 ㎖ 폴리스티렌 튜브에 단계 2.5에서 흰색 - 회색 스트라이프에서 세포를 수집합니다. </li><li> PBMC를하고 CTCS와 C 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관에 HBSS 추가10 분 RT는 씻어 400 XG에 다시 entrifuge. </li><li> 씻어 실온에서 3 분 동안 400 XG에 다시 HBSS 원심 분리기 50 ml의 액체에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. </li><li> 상층 액을 버리고, 적혈구 용해 버퍼의 5 ㎖로 나머지 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 5 분 솔루션을 품어. </li><li> RT에서 3 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 적혈구 용해 완충액을 제거한다. </li><li> 상층 액을 제거하고 종래 항체 염색 차단 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 1 ml의 PBS 1X에 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 정렬 형광 활성 세포에 대한 CD45-FITC 항체 3. 염색 단핵 세포 (FACS) <ol><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 (단계 2.11)에서 실행 가능한 (트리 판 블루 음성) 세포의 수를 정량화. (10 % FBS와 PBS 1X)에 1 × 106 세포 / ㎖ 현탁액을 준비하고 1 시간 동안 얼음에 놓습니다. </li><li> 정량 배포두 튜브에 이전 단계에서 세포 현탁액. 제어 및 CD45 염색 등의 레이블 튜브. </li><li> 250 : 제어 튜브에서, (1)의 희석 IgG1κ-FITC (2.5 μg의 / ㎖)을 추가한다. CD45 염색 튜브에서, (1)의 희석 CD45 FITC (2.5 μg의 / ㎖) 차 항체 컨쥬 게이트를 추가한다 (250)와 30 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양한다. CD45 항원 라벨링은 조혈 세포를 배제하기 위해 사용된다. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기, 상층 액을 버린다. </li><li> 멸균 1 X PBS로 각 펠렛을 일시 중단에 의해 두 번 세포를 씻으은 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 원심 분리 한 다음 10 % FBS와 보충. </li><li> 10 μg / ml의 농도 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 함유하는 PBS의 1 배의 1 ml의 용액 중에 세포를 재현 탁. </li><li> 12mm X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 35 μm의 여과기 캡을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> 전립선 CTCS 4. 분리하여FACS 참고 : 라이브 CD45 부정적인 CTCS를 수집하는 사이토 흐름을 활용합니다. <ol><li> 레이블 튜브에서 세포를 사용하여 설정 보상 컨트롤 &quot;제어.&quot; </li><li> 파편과 적절한 앞​​으로 산란과 측면 산란 매개 변수를 사용하여 세포의 클러스터를 제외 게이트를 만듭니다. </li><li> 표지 된 튜브에서 세포 현탁액을 이용하여 FITC 게이트 확립 &quot;CD45-FITC를.&quot; </li><li> 태평양 블루 채널을 사용하여 게이트 가능한 (DAPI 음성) 세포. </li><li> 10 % FBS가 보충 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 2 ㎖를 함유하는 멸균 15 ml의 폴리스티렌 튜브에 원추형 CD45 네가티브 인구를 수집한다. </li><li> 10 % FBS가 보충 된 RPMI 500 μL - 3 분 동안 원심 분리기 (400)에서 정렬 XG 전립선 종양 세포 현탁액을, 다음 200에서 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 이종 이식 성장의 마우스 및 모니터링에 CTCS 5. 주입 노트 :기관 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 준수하여 모든 동물 절차를 실시한다. 이 프로토콜은 모든 관련 규제 및 제도 기관, 규정 및 지침에 따라 준수에 우리의 동물 관리위원회의 승인을 특정 동물을 사용 의정서에 따라 우리 기관에서 진행되고있다. <ol><li> 얼음에 1 비율 및 장소 : 1에서 세포 외 기질로 분류 전립선 종양 세포 현탁액을 섞는다. </li><li> 산소 / 분 1 L의 5 % (v / v)로 흡입 이소 플루 란을 공급 챔버 내에 피하 주입하기 전에 마우스를 마취. 마우스 각막과 발가락 반사의 손실을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 25 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용하여, 8~10주 세 남자 면역 결핍 마우스의 양쪽 상단 측면에 전립선 종양 세포와 세포 외 기질 세포 현탁액의 피하 250 μl를 주입. 주입 부피는 I 인 250 μL없이 CTC 농도 주입mportant 값. 마우스에 최대 SQ 정부는 더 이상 1 ml를하지 않습니다. &#160;</li><li> 피하 결절 밀도의 성장을위한 마우스 주사 부위의 주간 촉진을 수행함으로써 일주일에 두 번 마우스의 무게를 측정하여 마우스를 모니터링합니다. </li><li> 종양의 크기가 분자 분석 및 직렬 통로 충분한 종양 조직을 위해 0.5 cm 및 최대 직경 미만 1cm 때 경추 탈구 수확 피하 인간 전립선 암을 이종 이식 한 다음 이산화탄소 질식에 의해 쥐 안락사. 더 종양에​​도 불구하고 고통 또는 15 %의 체중 감소의 징후와 쥐를 안락사는 만져서입니다. </li></ol>

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<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 원고 CTCS에서 전립선 암 PDX 모델 생성 방법을 설명한다. PDX의 생성을위한 CTCS의 사용 기존의 방법에 비해 여러 가지 잠재적 모델 중요한 이점을 갖는다. 첫째, 말초 혈액에서 CTCS의 접근 컬렉션 다른 질병 단계에서 동일 환자에서 실험 모델의 생성을 가능하게한다. 둘째, 채혈은 종양 세포의 수집을위한 수술을 필요로 기존 방법에 비해 종양 세포를 분리하기 위해 안전하고 저렴한 방법을 나타낸다. CTC 농축 여러 방법이 많은 인해 자금과 자원의 한계로 모든 실험실에 액세스 할 수 없습니다 그러나 기술되었다. 우리는 외과, 많은 실험실, 편리 저렴하고 접근 방법의 사용에 활용할 수있는 우리의 실험실에서 분석을 개발하기 위해 노력했다. 이러한 방법의 잠재적 인 제한은높은 종양 환자에게 부담이 프로토콜의 사용을 제한 할 수 희귀 세포의 검출 감도가 불충분. 상피 세포의 물리적 또는 생물학적 특성을 사용하는 기술은 여러 가지 추가 이상...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

환자 유래의 이종 이식은 암 연구에 사용되는 점점 더 인기를 실험 모델입니다. 이들은 생체 생물학적 경로, 전임상 약효 평가, 및 개인화 된 암 치료를위한 1,2- 아바타의 생성 특성에 사용될 수있다. 이전에, 다른 연구 그룹은 주입 또는 면역 저하 된 마우스 (1)에 단일 종양 세포 현탁액 또는 전체 종양 이식편을 주입함으로써 어느 PDX 모델을 개발 하였다. 이 PDX 모델은 신선한 고형 종양의 수술 수집, 악성 복수 또는 비용이 많이 드는 둘과 인성 사망률의 증가 위험에 환자를 노출하는 수술을받은 환자에서 흉막 삼출이 필요합니다. 암 연구 분야에서 최근의 발전은 상당한 종양 세포 순환의 검출, 분리 및 특성화되었다. 이들 종양 세포가 일차 종양 덩어리에서 탈출하고 순환을 입력그들은 전이 및 재발에 중요한 역할을하는 경우, 암의 가장 흔한 원인은 관련 사망률 3. 여러 고형암 유형에서 CTCS의 평가 및 특성 진단, 예후, 잔류 병 (3)를 모니터링하기위한 임상 정보를 제공하고 있습니다. 어느 물성, 바이오 마커의 발현 또는 CTCS의 기능적 특성에 의존하는 현재 사용되는 방법의 다양한 효율적 CTCS 4 분리하는데 사용될 수있다. 기존 거시적 CTC 분리 방법은 표면 분자에 대해 밀도 구배 원심 분리, 필터 기공 물리적 여과 및 분리를 포함한다. 가장 널리 사용되는 CTC 분리 방법론 CTCS 항체 기반의 캡처에 기초한다. 두 세포 표면 마커의 양성 및 음성 선택은 말초 혈액으로부터 CTCS를 분리하는데 이용 될 수있다. 말초 순환에 CTCS에 대한 긍정적 인 선택은 일반적으로 상피 마커 (예를 들어,는 EpCAM)를 사용하는CTCS하지만 조혈하지 세포에서 발현 다시. 이 방법의 단점은 전이 가능성이있는 CTCS 자주 상피 - 투 - 중간 엽 3 상피 표면 마커를 downregulates 전이 (EMT),받은 것입니다. 전이성 잠재력 CTCS를 분리하기 위해, 조혈 표면 마커 CD45을 채용 음성 선별 방법은, 백혈구의 정상 세포 집단 5 ​​사용될 수 고갈. 전립선 암은 가장 일반적으로 암 진단 및 남성 6의 암 관련 사망의 주된 원인이다. 종양 진행 및 공격성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않으며, 따라서 생성 및 전립선 암의 분자 이질성 요점을 되풀이 실험 모델의 특성은 중요한 관심사이다. 전립선 암 PDX 모델왔다 immunocom에 인간 전립선 암 세포의 생착에 의해 이전에 생성 된약속 마우스 7,8. 그러나, 이러한 모델의 생성은 주로 병의 무통 성질에 기인 마우스에 면역이 전립선 암의 생착 낮은 속도에 의해 방해되어왔다. 최근 CTCS 유방암 9, 폐암 및 전립선 암 10 11 PDX 모델을 생성하는 데 사용되어왔다. 이러한 개념 증명 연구는 수술 시료 채취의 필요성 PDX 모델 독립적 발생의 가능성을 소개했다. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 소설의 실험 모델의 생성하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &micro; m 세포 여과기</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리스티렌 원뿔형 튜브</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 캡이 있는 12mm x 75mm 폴리스티렌 튜브</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>BD Vacutainer 라벤더 혈액 수집 튜브, EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 날개 혈액 수집 세트, 푸시 버튼 수축 바늘 23 게이지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 일회용 바늘 홀더,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 라텍스 지혈</td>대 라텍스 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>또는 비 라텍스 장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알코올 면봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 × 2 면 거즈 패드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>접착 붕대</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25g 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

PDX(Patient derived xenograft) 모델은 암 연구에서 인기를 얻고 있으며 전임상 약물 평가, 바이오마커 식별, 생물학적 연구 및 맞춤형 의학 전략에 사용됩니다. 순환 종양 세포(CTC)는 종양 전이에 중요한 역할을 하며 여러 유형의 종양 환자로부터 분리되었습니다. 최근에는 유방암 및 전립선암의 PDX 실험 모델을 생성하기 위해 CTC가 사용되고 있습니다. 이 원고는 우리 그룹에서 개발한 CTC에서 전립선암 PDX 모델을 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 기존 PDX 모델에 비해 이 방법의 장점으로는 수술 샘플 수집으로부터 독립성을 가지며 다양한 질병 단계에서 실험 모델을 생성할 수 있다는 점이 있습니다. 전이성 질환 환자로부터 수집한 말초 혈액 샘플에서 CTC를 농축하기 위해 적혈구 용해 및 CD45 양성 단핵 세포의 유세포 분석 고갈에 이은 밀도 구배 원심분리를 사용합니다. 그런 다음 CTC를 면역이 저하된 마우스에 주입합니다. 이후에 생성된 이종이식편은 기능 연구에 사용하거나 분자 특성화를 위해 수확할 수 있습니다. 이 방법의 주요 한계는 CTC 농축에 사용되는 음성 선택 방법입니다. 이러한 한계에도 불구하고 CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암 연구에 적용할 수 있는 새로운 실험 모델을 제공할 수 있습니다.

이 프로토콜은 절연 CD45 네가티브 전립선 암에서 CTCS PDX 모델의 생성을 초래할 것이다. 우리의 프로토콜에서 사용되는 음성 선별 방법에 따라 그 DAPI 염색을 이용하여 사균을 배제 할 필요가있다. 유동 세포 계측법에 의해 검출 CD45 음성 세포의 비율은 가변적이며 환자 (도 1a)의 종양 부담에 따라 달라진다. 흰색 화살표 (도 1b)로 표시된 바와 같이 (세포 핵을 식별) CD45 및 DAPI를 사용하여 정렬되지 않은 세포의 면역 형광 염색, CD45 음성 세포를 보여준다. 도 1C에서, 피하 결절 밀도 마우스의 양쪽 측면에 알 수있다. 각 결절 밀도는 이종 이식의 성장을 나타내며,이 마우스의 등 근육에서 돌출과 질감에서 확고한 같이 건강한 조직에서 별개로 감상 할 수 있습니다. 주입 및 이종 이식 개발 사이의 시간 간격은 patie의 CTC 부담에 따라 크게 달라질 수 있습니다NT 샘플, 이식 된 세포의 수와 CTCS의 ...

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 순환 종양 세포로부터 환자 유래 전립선암 제노그라프트를 생성하는 것입니다. 이는 우선 진행성 전립선암 환자로부터 말초혈액을 수집함으로써 달성됩니다.두 번째 단계로, 순환 종양 세포를 포함하고 있는 혈액 단핵 세포 구획을 분리합니다. 다음으로, 단핵 세포를 CD 45 ZI 항체로 염색합니다. 유세포 분석법을 이용하여 순환 종양 세포를 선별하기 위해, 해당 세포들을 면역 결핍 마우스에 주입합니다. 결과는 전립선암 환자의 말초혈액에서 유세포 분석법으로 분리한 순환 종양 세포의 주입을 통한 전립선암 이종 이식편의 생성을 보여줍니다.이 방법은 전립선암의 분자적 특성 분석 및 새로운 바이오마커 개발에 활용될 수 있는 새로운 실험 모델을 생성함으로써 전립선암 분야의 주요 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 시연은 실험실 학생인 Williams와 이곳 Mount Sinai 종양학과의 연구원인 Omada가 진행하겠습니다. 우선 말초혈액 내 순환 종양 세포 수가 많을 가능성이 있는 전이성 전립선암 환자를 선정하여 전혈을 채취합니다. 10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 전혈을 Hank's balance salt solution과 함께 50 mL 폴리스티렌 원심분리관에 옮깁니다.1:1 비율로 혼합물을 부드럽게 피펫팅하여 균질화합니다. 다음으로, 빈 50 mL 폴리스티렌 원추형 튜브에 FI call pack 솔루션 15 mL를 넣습니다. 희석된 전혈 20 mL를 피펫의 가장 낮은 설정으로 솔루션 위에 부드럽게 분주하여 뚜렷한 상층을 형성합니다.그 후 튜브를 400 Gs에서 30분 동안 원심분리합니다. 분리 후 용액이 섞이는 것을 방지하기 위해 실온에서 원심분리기의 감속 설정을 최저로 맞춥니다. 원심분리가 끝나면, 상단의 혈장층과 분리 용액 사이에 끼어 있는 말초혈액 단핵구와 순환 종양 세포가 형성하는 얇고 흰 회색 띠를 확인합니다.튜브 바닥에서 흰색-회색 띠의 세포들을 조심스럽게 수집하여 50 milliliter 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 그 다음 플라스틱 트랜스퍼 피펫을 사용하여 분리된 세포에 Hank's Balance salt solution을 추가하여 최종 부피를 10 milliliters로 맞춥니다.혼합물을 실온에서 400 Gs로 10분 동안 다시 원심분리합니다. 세포를 세척하기 위해 상층액을 제거하고 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.두 번째 세척 후, 상층액을 제거합니다. 남은 펠릿을 5 mL의 적혈구 용혈 버퍼(red blood cell lysis buffer)에 현탁하고, 실온에서 5분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 시료를 실온에서 400 Gs로 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하여 용혈 버퍼를 없앱니다.마지막으로, 염색 전 10% fetal bovine serum이 첨가된 PBS 1 mL에 펠릿을 재현탁합니다. 헤모사이토미터 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 표준 trypan blue 배제법으로 생존 세포 수를 정량합니다. 그런 다음 10% FBS가 포함된 PBS에서 세포 농도를 1 mL당 100만 개로 희석하고, 1시간 동안 얼음에 보관합니다.비특이적 결합을 차단하기 위해, 세포 현탁액을 두 개의 별도 튜브에 나누어 담습니다. 한 튜브에는 대조군 세포를, 다른 한 튜브에는 CD 45 염색 세포를 표시합니다. 대조군 튜브에 IgG one Kappa Zi를 1:250 비율로 희석하여 최종 농도가 10 nanograms per milliliter가 되도록 첨가합니다.CD 45 염색 튜브에 10 ng/mL 농도의 CD 45 ZI 접합 1차 항체를 첨가하고 세포 현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 4°C에서 400 ×g로 3분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다.각 펠렛을 10% FBS가 첨가된 멸균 PBS에 현탁한 후, 4°C에서 400 Gs로 3분간 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다. 세척 후, 10 µg/mL의 dappy 염색액이 포함된 PBS 1 mL 용액에 세포를 재현탁합니다. 세포 덩어리나 부스러기를 제거하기 위해, 최종 용액을 35 µm 스트레이너 캡을 통해 12 mm x 75 mm 폴리스티렌 튜브에 여과합니다.그 다음, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 사용하여 현탁액에서 CD 45 양성 세포와 사멸 세포를 제외하여 제거합니다. 분류된 전립선 종양 세포 현탁액을 세포외 기질 단백질과 1:1 비율로 혼합하고 혼합물을 얼음에 둡니다. 이어서, 기관 가이드라인에 따라 1L/min의 산소와 함께 5% 흡입 iso fluorine을 사용하여 8~10주령의 수컷 면역 결핍 마우스를 마취시킵니다.마우스의 각막 및 발가락 반사 소실 여부를 확인하여 적절한 마취 상태인지 확인합니다. 25게이지 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 세포 현탁액 250 µL를 흡입합니다. 그다음, 세포외 기질 세포 현탁액 전량을 마우스의 양쪽 상단 옆구리에 피하 주사합니다. 주사 부위를 매주 촉진하여 피하 결절성 밀도의 성장을 확인함으로써 종양을 모니터링합니다.본 프로토콜에 사용된 음성 선택법에 따라, DAPI 염색을 통해 사멸 세포를 배제해야 합니다. 여기에서 보듯이, 남은 생존 세포 중 CD 45 음성 세포의 비율은 환자의 종양 부담에 따라 가변적이지만, CD 45 양성 세포와는 쉽게 분리됩니다. 적절한 게이팅을 사용하고 전립선 종양 세포 현탁액을 이식하면, 마우스의 양측 옆구리에서 피하 결절 밀도가 관찰될 것입니다.각 결절성 밀도는 제노그라프트의 성장을 나타내며, 마우스의 등쪽 근육에서 돌출되어 있고 질감이 더 단단하므로 건강한 조직과 구분하여 인식할 수 있습니다. 순환 종양 세포로부터 생성된 환자 유래 제노그라프트 모델은 헤마톡실린-에오신 염색과 안드로겐 수용체 및 전립선 특이 막 항원과 같은 전립선 특이 세포 표커에 대한 면역조직화학 분석을 통해 확인한 바와 같이 인간 전립선 종양을 재현합니다. 제노그라프트를 생성한 후, 전립선암의 공격성에 기여하는 세포 및 분자적 기전을 탐구하기 위해 유전자 또는 단백질 발현 프로파일링과 같은 다른 프로토콜을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 마우스로 압축 호르몬 펠렛의 제조뿐만 아니라, 피하 이식 수술에 대해 설명합니다. 이 전략은 호르몬 발암 및 양성 전립선 성장의 조절을 평가하기위한 비 흉선 누드 마우스의 신장 캡슐 밑에 세포 및 조직 이종 이식편의 성장과 조합 될 수있다.

전립선 발암 및 양성 전립선 비대증의 평가를위한 신장 캡슐 Xenografting 및 피하 펠렛 주입

전립선암은 미국에서 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인입니다. 정소성 암 모델은 전립선암의 생물학을 이해하고 치료 요법의 효능을 평가하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 정형소 전립선암 마우스 모델을 확립하는 데 필요한 자세한 단계를 설명합니다.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

우리는 녹색 형광 단백질과 루시 페라 제 기자를 발현하는 렌티 바이러스 입자 환자 유래의 이종 이식 (PDXs)의 안정적인 표시하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주 사이트 PDXs의 성장을 추적뿐만 아니라, 생체 내 이미징 시스템에서 사용 자발 실험 전이 검출을 허용한다.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

현재 프로토콜은 외과 위암 견본에서 환자 파생된 이종이식 (PDX) 모형 및 1 차적인 암 세포주를 설치하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 약물 개발 및 암 생물학 연구에 유용한 도구를 제공합니다.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

우리는 인간 췌장암 세포의 초음파 유도 주사와 초음파 영상에 의한 생체 내 종양 성장의 후속 모니터링에 의해 최소 침습 동종 췌장암 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

초음파 유도 주사에 의한 췌장암 세포의 동종 이종이의 생성

전립선암 이질성과 치료 저항성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 주요 부모 종양 특성을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 표준화된 모델은 약물 스크리닝 및 정밀 의학 발전을 지원합니다.

환자 유래 전립선암 오가노이드의 확립 및 유지: 상세한 실험 프로토콜

배우세요 전립선암 환자의 순환 종양 세포에서 유래한 환자 유래 이종이식 모델을 생성하는 방법을. 유세포 분석을 통해 CTC를 분리하여 면역결핍 마우스에 주입하면 전립선암 연구를 위한 새로운 실험 모델을 확보할 수 있습니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

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