상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

본 실험의 전반적인 목표는 형광 및 전자 현미경을 통해 온전하고 수화된 세포의 세포막 내 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptors, EGFR)의 분포와 화학량론을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저, 중앙의 윈도우 영역을 가로지르는 50 nanometer 두께의 질화규소 막이 형성된 마이크로칩 상에서 cos seven과 같이 EGFR을 발현하는 세포를 배양합니다. 그 다음, 수용체에 결합하여 EGFR의 구조적 변화를 유도함으로써 이량체화 및 활성화를 일으키는 비오틴화된 상피세포 성장인자를 처리하여 세포를 배양합니다.

다음으로, 수용체를 고정하기 위해 세포를 고정하고, EGF 활성화 수용체에 결합하는 stripped Hagen 접합 양자점을 처리하여 배양한 후 세포를 이미지화합니다. 마지막으로, glutaraldehyde를 이용해 두 번째 고정을 수행함으로써 stripped habit 접합 양자점을 EGFR과 가교 결합시키고 전자 현미경 관찰을 위해 시료를 안정화합니다. 결과로는 형광 양자점 이미징을 통한 적색 형광 방출과 주사 투과 전자 현미경을 통한 EGFR 분포 및 화학 양론적 상태 또는 클러스터링을 확인할 수 있습니다.

이 방법은 온전한 세포 내 막 수용체의 기본 기하학적 구조와 분포에 관한 독특한 정보를 제공하며, 정상 세포 및 암세포에서 상피 성장 인자 수용체의 활성화를 통찰하는 데 활용될 수 있습니다. 또한 이온 통로와 같은 다른 막 수용체를 연구하는 데에도 적용 가능합니다. 화학 흄 후드 내에서 작업을 시작하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 질화규소 막 마이크로칩의 초기 준비 단계를 수행하고 아세톤에 담근 후, 마이크로칩을 에탄올이 담긴 비커로 즉시 옮겨 2분간 대기하십시오. 그런 다음 칩을 에탄올에서 꺼내 클린룸 전용 티슈 위에 놓으십시오.

칩이 건조되면, 이전에 페트리 접시에 넣어둔 유리 슬라이드로 칩을 옮깁니다. 그다음 접시에 덮개를 덮습니다. 이어서 마이크로칩이 놓인 유리 슬라이드를 플라스마 세척기에 넣습니다.

질화규소 막의 표면을 친수성으로 만들기 위해 5분간 표준 세척 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 층류 후드 아래에서 유리판으로부터 마이크로칩을 옮깁니다. 클린룸 전용 티슈 위로 칩을 밀어 옮긴 후, poly L lysine 용액 또는 PLL이 채워진 24웰 플레이트의 웰에 넣고 5분 동안 배양합니다.

그다음 마이크로칩을 하나씩 HPLC 등급의 물이 들어 있는 두 번째 웰로 옮긴 후, 물이 담긴 또 다른 웰에서 헹굽니다. 마지막으로 마이크로칩을 96 웰 플레이트의 DM이 채워진 웰에 각각 넣고, COS 7 세포 서브컬처를 사용하여 이산화탄소 배양기에 플레이트를 넣습니다. 농도가 약 5 × 10⁶인 단분산 세포 현탁액을 준비합니다.

밀리리터당 5x10⁵개의 세포를 준비합니다. 96웰 플레이트의 각 마이크로칩에 세포 현탁액 한 방울을 첨가하고, 도립 현미경 하에서 실온으로 5분 동안 배양합니다. 150 by 400 µm 창 내에 약 20~30개의 세포 밀도가 확보될 때까지 마이크로칩의 영역을 검토하기 시작합니다.

세포가 충분히 부착되면, 세포가 있는 면이 위로 향하게 하여 마이크로칩을 dm이 들어 있는 새 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 충분한 수의 세포가 부착된 상태로 남아 있으면, 세포가 위를 향하도록 마이크로칩을 serum free dmm이 들어 있는 새 웰로 옮깁니다. 그 후, 다음 단계를 위해 마이크로칩을 이산화탄소 배양기 내 37 °C에서 수 시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

96웰 플레이트를 사용하여 각 웰에 필요한 용액을 채우고, 마이크로칩 하나당 한 개의 행 또는 열을 사용합니다. 신선한 B-S-A-G-E-L-P-B-S가 들어 있는 웰에 마이크로칩을 넣어 헹구고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 세포가 EGF 표지 EGFR을 내포하기 시작하므로, 마이크로칩을 300 nM EGF biotin 용액으로 옮겨 인큐베이터에서 3분 동안 다시 배양합니다.

PBS를 사용하여 마이크로칩을 빠르게 3회 세척합니다. 그런 다음 0.1 M cate buffer(CB)를 사용하여 샘플을 세척합니다. 이어서 마이크로칩을 3% PFA로 옮겨 10분 동안 배양합니다.

CB로 한 번, PBS로 세 번 헹군 후, 칩을 G-L-Y-P-B-S로 옮겨 2분 동안 배양합니다. 그다음 PBS로 두 번 헹굽니다. 이제 마이크로칩을 10 nM S-T-R-Q-D에 10분 동안 넣었다가 B-S-A-P-B-S로 네 번 헹굽니다.

그 다음, 실온의 B-S-A-P-B-S가 미리 채워진 유리 바닥 35 millimeter 디쉬에 마이크로칩 하나를 담가 DIC 및 형광 현미경으로 세포를 촬영합니다. QD 6 55로 표지된 세포의 전체 영상을 얻기 위해 40 x 공기 렌즈 대물렌즈를 사용하십시오. 340에서 380 nanometers 사이에서 양자점을 들뜨게 하고 420 nanometers 이상의 방출 파장을 갖는 필터 큐브를 사용하십시오.

시료가 손상될 수 있는 강한 빛을 피하기 위해 광강도를 최소화하십시오. 모든 QD의 신호를 포착할 수 있도록 노출 시간을 최소 300 milliseconds로 설정하십시오. QD 형광이 깜빡이므로, 광강도를 최소화하는 동시에 가시적인 이미지 노이즈 없이 밝은 이미지를 얻을 수 있도록 광강도와 증폭도를 조절하십시오. 이미징 후, 마이크로칩을 B-S-A-P-B-S가 담긴 96 웰 플레이트에 다시 넣으십시오.

cb로 한 번 헹군 다음, 2% glutaraldehyde로 옮겨 10분 동안 추가로 배양합니다. 세척 및 CB 단계에서는 B-S-A-P-B-S를 사용하여 마이크로칩을 세 번 세척하고, 마이크로칩마다 새로운 96-well plate의 B-S-A-P-B-S가 미리 채워진 웰에 보관합니다. 4개의 웰이 있는 한 행을 HPLC grade water로 채웁니다.

텍스트 프로토콜에 따라 ESEM 설정을 완료한 후, 냉각 용기에서 96-웰 플레이트를 꺼내 개방된 ESEM 스테이지 가까이에 배치하여 pre-COOL ESEM STEM 스테이지에 샘플을 로드합니다. 그 옆에 클린룸 티슈를 놓습니다. HPLC 등급의 물이 채워진 웰에 마이크로칩을 1초씩 네 번 담가 빠르게 헹굽니다.

마이크로칩의 뒷면을 티슈로 가볍게 닦아낸 후, 3 µL의 냉각된 HPLC grade water가 들어있는 미리 냉각된 스테이지 위에 놓습니다. 시료 표면을 적시고 시료를 스테이지에 고정합니다. 그 다음, 시료 근처의 스테이지 위에 3 µL의 물방울 세 개를 추가로 떨어뜨리고 시료 챔버를 닫습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 관심 세포를 확인한 후, 해당 세포의 STEM 개요 이미지를 기록하고, 세포 경계가 보이는 세포의 주변부 영역으로 이동하여 50,000 X 배율로 확대합니다. 개별 QD가 보이는 이미지를 기록하며, 픽셀 체류 시간은 20~30 µs로 설정합니다. 여기에 제시된 것은 완전히 수화된 온전한 COS 7 세포에서 QD 655로 표지된 세포막 결합 EGFR입니다. DIC 이미지는 세포의 막 지형을 보여주며, 이에 대응하는 형광 이미지는 3분간의 EGF biotin 배양 후 세포 전체 표면에 걸친 EGFR의 분포를 보여줍니다.

이 저배율 ESEM STEM 이미지는 세포에서 인접 세포로 뻗어 나가는 사상위족(filopodia)과 같은 미세 구조와 더 얇은 세포 영역 내부의 일부 구조를 보여줍니다. 핵을 포함한 두꺼운 세포 중앙 영역은 사용된 에너지의 전자들이 시료를 투과할 수 없기 때문에 하얗게 보입니다. 고해상도.

더 얇은 주변부 영역의 ESEM STEM 이미지를 보면 이미지를 대각선으로 가로지르는 막 접힘 부위에 QD 라벨이 표시되어 있습니다. 이 막 구조는 여러 지점에서 주변 막 영역보다 EGFR 밀도가 더 높으며, 두 개의 라벨이 서로 가까이 위치해 있습니다. 거리가 20 및 24 nanometers인 두 가지 사례가 화살표 머리로 표시되어 있습니다.

이 라벨 쌍들은 EGF Fers에 속하는 것으로 해석됩니다. 이 이미지는 EGFR 밀도와 형광 신호가 더 낮은 영역을 기록한 것입니다. 그럼에도 불구하고, 이곳에서도 이량체 형태의 EGFR이 발견되었으며, 10개 또는 11개의 EEG로 구성된 두 개의 클러스터가 존재했습니다.

숙달되면 시료 준비를 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 이는 전자 현미경에 일반적으로 사용되는 기법보다 훨씬 빠릅니다. 이후 essem STEM 이미징을 통해 반나절 만에 최대 100장의 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다.