Name: 번역 상 암 연구를위한 인체 조직에 대한 작업 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 번역 상 암 연구를 위한 인체 조직 처리 방법으로 고품질 데이터를 추출하는 기술입니다. 이 방법은 종양 돌연변이와 면역 세포 아형 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 존 G. 마리 스텔라 케네디 기념 재단 (보조금 # 0727033)과 흑색 종 연구 얼라이언스의 자선 기부금에 의해 지원되었다. 저자는 박사 이그나시오 Wistuba 박사 빅터 Prieto의 MD 앤더슨 암 센터의 부서뿐만 아니라, 조직 분포 및 수집을 조정 및 중개 연구를 용이하게하기 위해 텍사스 MD 앤더슨 암 센터 기관 조직 은행 (ITB)의 대학 감사드립니다 병리학 및 흑색 종 달 총 프로그램. 마지막으로, 저자는 흑색 종에 의해 영향을받는 모든 환자와 가족을 인정하고 싶습니다.

윤리 문 :이 프로토콜은 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에 의해 승인됩니다. 1. 표본 조달 <ol><li> 잉여 종양 및 관련 정상 조직 10-12에서 연구 조직 샘플을 수집합니다. 젖은 얼음에 보관 검체는자가 분해를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 병리학 적 진단을 용이하게하기 위해 모든 조직, 의료 기기 및 필요한 검사에 대한 병리학 부서 수술 중 제거 이물질을 보냅니다. </li><li> 적용 할 수있는 연구 조직 은행의 정책 및 절차에 따라 연구에 할당 된 조직을 처리합니다. 참고 : Biospecimen 컬렉션 병리학의 조정을 포함, 병리학 &#39;조수, histotechnologists 및 조직 조달 전문가. </li></ol> 2. 병리학 품질 보증 (QA) <ol><li> 완료하고 초기 품질 보증 조치로 환자 기록을 확인하고 진단 PA를 검토 병리학에 문의tient 레코드 (병리학 리포트, 조직 슬라이드 등) 및 조직 샘플. 등이 biorepository 모범 사례 10-12에 따른다 등 종양의 비율, 괴사, 조직 종양 인터페이스, 같은 관심의 형태 학적 특성에 대한 판사의 조직 샘플. </li><li> 초기 검토 후, biospecimen의 숙박의 전체 길이 중 biorepository 데이터와 연구 샘플의주기적인 검토를 수행. </li><li> 샘플 및 기타 병리학 적 조사 결과로부터 링크와 주석 및 biorepository 독점 소프트웨어 시스템을 통해 연구원이 데이터를 제공한다. 주 : QA 프로세스 biorepository 동작 임상 기술적 측면 모두의 무결성을 보장한다. </li><li> 확인하고 임상 사용을 위해 샘플을 특징 짓는 유전 및 분자 테스트를 수행합니다. </li><li> 수집 및 실험실 실험 샘플을 사용하고 연구자의 의견을 기반으로 데이터를 분석 할 수 있습니다. 선로바코드 기술을 사용하여 샘​​플. 이 전자 추적 시스템은 biorespository 모범 사례 10-12에서 주장한다. </li></ol> 3. 표본 / 조직 처리 <ol><li> 항상 그것의 자연 환경으로부터 조직 샘플의 추출에 의해 유도 된 변화를 제한하기 위해, 가능한 한 빨리 신선한 조직 젖은 얼음 표본, 및 프로세스를 저장한다. 종양 정상적인 프로세스 정합 및 종양 조직 샘플을 별도의 교차 오염을 방지하기 위해. 주 : 연구 프로토콜에 근거는 biospecimen 처리 매체의 하나 이상의 유형에 시험편의 컬렉션을 포함 할 수있다. </li><li> 프로세스를 시작하기 전에, 멸균 페트리 배양 접시, 메스뿐만 아니라, 조직 처리 용 바늘 또는 집게를 준비한다. 튜브가 준비 표지 및 샘플 처리 (그림 2)의 시간을 제한하기 위해 배치되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이러한 환자 이름, 번호, 치료, 날짜 등 모든 관련 조직 정보,수술 및 연구에 적합한 수있는 바와 같이, 다른 관련 정보는, 기관 조직 데이터베이스에 용이하게 접근해야한다. 제한된 환자 정보는 종이 또는 스프레드 시트 형태로 실험실에서 개최한다. 참고 :. 만 연구 즉의 성격과 관련 biospecimen 정보를 수집, 질병 별 정보 등 기본적인 생물 의학 연구, 임상 연구, 중개 연구는 biorepository 직원은 현재 문학이 필요하다고 인정하는 데이터를 관리하는 조직을 수집해야 적절한 진단과 의미있는 연구를 보장합니다. 하지만, 여기에는 종양 등급과 암 스테이징 정보에 한정되지 않는다. </li><li> 각 유형의 분석뿐만 아니라, 절개의 위치에 대해 요구되는 조직 절편의 크기를 결정하기 위해, 미리 원하는 모든 후속 실험을 계획한다. 불가능 비록 이상적으로, 모든 분석은 조직 heterogenei을 고려하기 위해 전체 조직 절편을 대표한다타이 및 다운 스트림 분석의 한계 바이어스. 그림 2에 도시 된 바와 같이 사전에 필요한 모든 항목을 배치합니다. </li><li> 표면에 평평하게 열려있는 페트리 배양 접시에서 조직 표본을 놓습니다. 참고 : 만 확인 된 샘플을 처리하고 확인 된 건강 데이터를 검토 할 수 biorepository 직원에게 권한을 부여 할 수 있습니다. 연구자는 IRB에 의해 규제로 서명 된 정보를 동의에 의해 허용하고 만 환자 식별자에 액세스해야합니다. 모든 시편은 적절하게 표시해야하며, 최소한의 고유 한 조직 식별 번호 및 조직 유형에 포함해야한다. HIPAA 규정에 따라, 라벨의 모든 건강 정보를 포함하지 마십시오. </li><li> 그 구조 및 치수의 더 나은 이해를 얻기 위해, 모든 각도에서 샘플을 검사한다. 바늘 접시의 바닥에 샘플을 핀과 최대 규모의 가장 대표적인 축을 따라 조직을 양분로 진행합니다. </li><li> 조직의 작은 조각을 잘라 멸균 1.5 ml의 MICR에 배치RNA 안정화 용액 1ml를을 포함 ocentrifuge 튜브. 이 샘플은 프로세스의 나머지 얼음에두고 필요할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 참고 : RNA로 작업 할 때 장갑을 항상 착용해야하고, RNAse가없는 필터 팁 저하와 RNA 오염의 기회를 제한하는 데 사용되어야한다. </li><li> 페트리 배양 접시의 뚜껑을 열고 미리 라벨링 생검 카세트를 배치합니다. 3-5mm보다 더 두꺼운 조직의 조각을 잘라 카세트로 전송. 72 시간의 최소 10 %에서 카세트 중성 포르말린 (NBF)를 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 장기간 저장을 위해 70 % 에탄올에 카세트를 옮긴다. 참고 : 카세트 라벨은 연필 또는 다른 라벨을 지워집니다 처리 중 자일 렌의 사용을 권장 마커로 수행되어야한다. </li><li> 조직의 조각을 잘라 및 조직 금형에 넣습니다. 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 조직 절편을 커버하고, 즉시 동결냉동 절편을 위해 -20 ° C에서. 이러한 조직 절편은 저온 절편 위해 준비 될 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 하나 잘라 또는 조직의 많은 조각 및 MACS 완충액을 함유하는 50 ㎖ 튜브 (1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 0.5 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)) 세포 계측법 분석 후속 유동로 전송할 . 유동 세포 계측법에 필요한 경우 세포가 종양 탈퇴, 세포의 고정과 투과성으로시 손실 될 수 있으므로, 큰 샘플은 바람직 할 수있다. 일반적으로,이 섹션은 단부에서 취할 수 있고, 일단 다른 모든 부분이 처리되어있다. 남은 대표적 종양 샘플을 유동 세포 계측법에 사용될 수있다. 선택적으로,이 관은 4 ° CO 저장 / N 또는 세포 현탁액 (단계 4 참조 - 유세포 염색)로 유세포 염색 직후 분해에 사용될 수있다. </li><li> 0.5 mm X 0.5 mm의 최대 크기보다 조각 크지로 조직의 나머지 부분을 잘라 극저온로 전송액체 질소에 즉시 냉동을위한 유리 병. 미래 분석 및 공동 목적을 위해 이러한 스냅 냉동 샘플을 사용할 수있다. 참고 : 직접 접촉은 심각한 부상을 입을 수있는 액체 질소로 작업 할 때 여분의주의를 기울여야합니다. 눈은 측면 방패 또는 얼굴 가리개와 안전 안경을 보호해야합니다. 극저온 장갑도 튀는 직접 접촉에 의한 액체 질소 화상으로부터 보호하기 위해 착용한다. 장갑은 잘 맞지하지만 그들로 빨리해야 액체 질소 시작을 제거 할 수있을만큼 느슨하게해야한다. </li></ol> 4. 유세포 염색 <ol><li> 조직의 균질화 <ol><li> DMEM (40 ㎖)의 DNase I (50 U / ml) 및 콜라게나 제 I (2 ㎎ / ㎖)와 소화 매체를 준비한다. 페트리 접시의 뚜껑에 MACS 버퍼에 신선한 또는 O / N 저장된 종양을 배치하고 소화 매체 잠수함. 주 :. 다른 소화 방법은, 각각의 장점이 존재 (즉, 세포 표면 단백질 EXPression의, 생존). 당신이 원하는 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 방법이 있는지 확인하십시오. </li><li> 종양이 붙여 넣기 같은 질감을 가질 때까지 외부에서 바늘 접시의 바닥 및 절단에 핀 종양, 메스 중심합니다. 누수를 방지하기 위해 플라스틱 백에 50 ㎖ 튜브, 및 시일 장소 종양 믹스 옮긴다. 인큐베이터에 튜브를 전송하고, 225 RPM, 37 ℃, 1 시간에 회전. </li><li> 70μm 셀 스트레이너를 통해 종양 세포 현탁액을 필터. 250 XG, 4 ° C, 5 분 원심 분리기 세포 현탁액. 1 ML의 외과 버퍼 (500 ml의 PBS 1 ml의 0.5 M 재고 EDTA, 10 ML의 FCS 또는 FBS)에 재현 탁 세포 펠렛. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계수하고 1 × 107 세포 / ml의 농도로 다시 중단. 전송 염색에 대한 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 100 μL (10 6 세포). </li></ol></li><li> 생존 및 항체 염색법 <ol><li> 각 생존 얼룩 솔루션의 200 μL를 잘 추가하고 섞는다. Incu어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 대한​​ BATE. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. </li><li> FACS 완충액 200 μL의 표면 항원에 대한 (업체 당) 추천 / 적정 농도로 항체 혼합물을 추가합니다. 어둠 속에서, 4 ° C를 30 분에서 세포를 품어. 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. </li><li> , 외과 버퍼의 200 μL로 세척 250 XG, 4 ° C, 5 분, 그리고 대기음 뜨는에서 세포를 스핀 다운. FACS 완충액 200 μL의 세포를 재현 탁하고 수집 및 분석에 대한 흐름 cytometer로 진행합니다. 참고 : 세포 내 유동 세포 계측법 염색을 수행하는 경우, 단계 4.2.2과 4.2.3 사이의 고정과 투과성으로 단계 및 세포 내 염색을 수행합니다. 사이토 카인 염색법을 수행하는 경우, 셀은 권장 미리 활성화 선행되어야 염색, 모 넨신 및 세포 내 단백질 수송 및 분비 억제제로 활성화 중에 표기수용성 요소의 유지를 보장합니다. 고정 된 세포는 유세포에 어두운 이전에 획득을 4 ° C에서 단기 (일주일)에 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

궁극적으로, 처리의 방법은 원하는 가설에 의해 결정 (그림 1)을 수행 할 기술적 분석을 예상해야합니다. 다음 섹션에서는 조직 섹션에서 수행 할 수있는 잠재적 인 분석을 설명하는 개요 역할을한다. 그것은 결코 완전한 개요를 의미하지만, 기술을 설명하고 자신의 강점과 약점을 나열하여 가이드 샘플 처리 방법 및 다운 스트림 분석의 선택에 도움을주기위한 것입니다으로하지 않습니다. 착색 유동 세포 계측법은 갓 해부 조직 절편을 수행 될 수 있고, 또는 그의 단편을 4 ℃에서 MACS 완충액 O / N을 기억. 계측법 고도로 특이 표현형과 조직 샘플에서 추출 된 세포 집단의 분석을 용이하게하고, 하나의 셀에서 최대 17 세포 표면 마커 및 세포 내 단백질, 사이토 카인 및 단백질의 염색을 가능 흐른다. 더욱이, 특정 세포 계측기는 localizat를 결정하기 위해, 단일 세포 배율을 허용세포 내에서 단백질의 이온보다는 전적으로 양성 및 신호 강도. 마지막...

의학 연구는 인간 세포주 및 동물 모델 모두 연구 막대한 이득이다. 세포주 나은 시스템의 구성 요소의 제어뿐만 아니라, 적절한 유기체의 세포의 사용을 허용한다. 세포주는 응답 (1)에 영향을 미칠 수있는 다른 세포, 기질 구성 요소 및 기관의 영향을 요점을 되풀이하지 않을 수 있기 때문에, 더 대표하면서, 건강과 질병에 대한 책임을 질 수 있습니다 메커니즘을 획기적으로 단순화 된 스냅 샷을 제공, 인간 세포에 대한 작업. 반면에, 동물 모델은 인간의 질병 및 유전 적 이질성 재생 전적으로 정확하지 않지만, 대부분의 모델 동물 2,3-에서 전체 시스템의 입력을 허용함으로써 추가 통찰력을 제공. 단점은 제쳐 놓고, 두 방법은 자신의 장점을 가지고 상호 보완 적이다. 그러나, 주요 목표는 전신, 멀티 기관 시스템에서 인간의 세포와 기관, 연구 남아있다. 따라서, 중개 연구는 탁을 가지고더 나은 메커니즘을 기저 질환을 파악하기 위해, 인간의 기관 및 환자에서 추출한 조직의 연구를 촉진 장족의 발전 갖추고 있습니다. 중개 연구함으로써, 몸 전체에서 적절한 세포에서 치료 및 질환의 연구 결과와 동물 세포 일 (4) 사이 모두의 장점을 제공하는 이점을 제공한다. 중개 연구는 결함없이도 없습니다. 인간의 환자에서 수확 표본, 호스트로부터 제거시 즉시 허혈하고 그렇지 않으면 보호 될 수있는 다른 외부 요인을 실시한다. 이 스트레스 유발 분자 유전 학적 변화가 발생하고, 이후의 연구에서 편견의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 많은 노력이 가장 하류 연구 5 장기 및 세포의 무결성을 유지하기 위해 엄격한 방법으로 조직을 추출하고 처리에 투입되었다. 방법 (을)를 선택했을 때 중요한 것은, 미래의 응용 프로그램은 밀접하게 고려되어야한다F 특정 방법은 세포 성분에 유해 할 수 있으므로, 인간의 샘플을 처리하고 다른 사람을 살려주는 동안 신호 전달 경로. 인체 조직을 포함하는 모든 연구, 규제 문제를 해결해야합니다. 터스 키기과 벨몬트 보고서 이후, 생물 의학 연구는 고유의 위험은 종종 피할 수없는 윤리적 딜레마 (6)의 결과와 관련되었다는 사실의 성장 수용이 있었다. 국가 표준의 필요성을 인식하고, 연방 정부는 벨몬트 보고서의 원칙을 유지 (명, 선행, 정의에 대한 존중)하는 수단으로 임상 시험 심사 보드 (IRBs를) 만들었습니다. 모든 기관의 IRB는 연구 참가자를 보호 할 책임이 있습니다 의사, 연구자 및 지역 사회 구성원의위원회이다. 그것은 자발적 동의는 생물 의학 연구의 모든 연구 참가자를 얻을 수 있어야하고,이 동의는 동의 FO에 설명하는 것이<html> RM. 동의서 프로세스 정보 결정은 연구에 등록 또는 가입 상태를 유지할지 여부에 제조 될 수 있도록 참가자에게 적절한 정보를 제공하는 것을 목적으로한다. 이와 관련, 동의서 문서는 좋은 가독성이 있어야 쉽게 표적 집단에 의해 (6 일 ~ 8 학년 읽기 수준) 이해 될 수있다 언어로 작성되어야한다. 강압 또는 부당한 영향의 가능성을 최소화 할 수 있어야하고, 피사체가 참여를 고려할 충분한 시간이 주어져야한다. 참가자는 처벌하지 않고 연구의 과정에서 모든 단계에서 동의를 철회 할 수있는 권리를 행사할 수 있어야합니다. 자발적인 동의서는 연구 주체의 참여를위한 필수 전제 조건이며 또한 7 법적으로 유효하다. 인간의 보호를위한 규정에 따라 과목 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), 연구 참가자는 연구의 목적을 통보해야하며, 연구에 참여 절차 참여에 대한 대안, 사회에 대한 가능성이 개인에게 연구의 모든 예측 가능한 위험과 불편 (뿐만 아니라 신체적 상해뿐만 아니라 수, 심리적, 사회적, 경제적 피해, 불편 함, 또는 불편 포함), 혜택, 피사체가 참여 할 것으로 예상되는 시간의 길이, 사람은 참여가 자발적임을 나타내는 문, 질문에 대한 또는 연구 관련 부상이나 응급 상황에 대한 답을 문의하고 참여하는 것을 거부는 정기적으로 임상 치료에 타협으로 어떤 결과 또는 혜택을 상실하지 않습니다 참가자가 다른 권리가 있음을 기밀성과에서 철수하는 오른쪽에있는 피사체의 권리에 관한 마지막으로 문을 그 / 그녀의 진단의 결과로 수신하고어떤 결과없이 언제든지 연구. 연구의 과정에서 동의를 철회 참가자의 조직 표본 뱅크해서는 안 즉시 소진해야합니다. 동의서의 하나 또는 그 이상의 요소의 면제는 실질적으로 필요한 요소 또는 필수 요소가 적용되지 않습니다 연구에 대한 변경없이 할 수없는 몇 가지 연구 프로젝트에 대한 IRB에서 얻을 수있다. 큰 관심은 데이터의 기밀성을 보장하기 위해주의해야합니다. 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA)을 사용하거나 참가자의 서면 동의없이 &quot;보호 된 건강 정보&quot;(PHI)를 공개 방지 연방법입니다. PHI 포함하지만 의료 정보 전송되거나 유지 어떠한 형태 또는 매체와 9 개인을 식별하는 데 사용될 수있는 필드들에 한정되지 않는다. 이 작품을 통해 우리는 tissu 과정에서 지켜야하는 프로토콜을 간략하게 설명하는 것을 목표로전자 처리 - 조달을 포함하고, 저장하고 조직 추출시에받는 응력으로 인해 발생할 수 편향을 최소화하기 위하여 이러한 엄격한 가이드 라인을 다음의 중요성을 강조한다. 독자가 무엇을 분석 (들)에 가장 적합한 자신의 요구에 자격을 갖춘 판단을 할 수 있도록 우리는 또한 다운 스트림 분석 또는 표본에 대해 수행 할 수있는 분석 (그림 1)에 대한 간략한 개요를 제공하기 위해 노력하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>바늘</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 일회용 메스</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>생검 카세트</td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>RNA 안정화 솔루션</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 튜브</td><td>Phoenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>StatLab Medical Products</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용기</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도 솔루션(OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase i</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m 세포 스트레이너</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 라운드 바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead 염색 용액</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

번역 상 암 연구를위한 인체 조직에 대한 작업

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

인간의 이익을 위한 의학 연구는 인간 조직과 피험자의 필요성에 의해 크게 방해를 받고 있습니다. 그러나 인간 표본에 대한 동의를 얻은 후에는 장기, 조직 및 세포의 무결성을 최고 수준으로 보장하기 위해 귀중한 샘플을 최대한 조심스럽게 다루어야 합니다. 불행히도, 조직 처리는 정의상 숙주에서 조직을 추출해야 하며, 이러한 변화는 큰 세포 스트레스를 유발하고 후속 분석에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 응력으로 인해 시편이 더 이상 회수된 현장을 대표하지 않게 될 수 있습니다. 따라서 대표성을 보장하기 위해 이러한 표본을 처리하는 동안 엄격한 프로토콜을 준수해야 합니다. 시료 처리에 최적의 기법이 사용되도록 하기 위해 원하는 분석도 고려해야 합니다. 다음은 제한된 조직 샘플에서 다운스트림 생산을 극대화하기 위해 처리된 조직에서 수행할 수 있는 조직 검색, 처리 및 다양한 분석을 위한 프로토콜입니다.

<html> 아래에 표시된 결과는 처리 흑색 종 종양에 대한 광범위한 면역 표현형 유동 세포 계측법 게이팅 전략을 도시한다. 염색의 날, 조직 샘플은 225 RPM의 회전하에 37 ℃에서, 소화 I 콜라게나 제 및 60 분간의 DNase I 인큐베이션 균질화 하였다. 소화 후, 세포 현탁액은 파편을 제거하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 통해 여과하고, 세포를 면역 세포 계측법 표현형에 대한 항체의 형광 표지 된 흐름으로 염색 하였다. MACS 버퍼에 4 ° C에서 조직 저장 O / N에서 여러 마커 게이팅 전략과 염색 (그림 3) 아래에 표시됨. 도시 된 바와 같이, 4 ° C에서 MACS 버퍼에 설명 저장 O / N로 처리 표본 극히 제한 사망률을 보여줍니다. 또한,이 도면은 전술 한 바와 같이 그 처리 조직 흑색 종 종양 면역 세포 서브 세트의 다색 광범위한 표현형 허용 보여준다. S / ftp_upload / 53189 / 53189fig1...

중개 암 연구는 인간 조직 추출에 의존합니다. 체외 분석을 위한 추출 방법을 최적화하기 위해 많은 작업이 진행되었습니다. 여기에서는 제한된 샘플에서 최대한의 데이터 출력을 허용하는 조직 처리 방법에 대해 설명합니다.

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

이 절차의 전반적인 목표는 조직 샘플에서 추출되는 데이터의 질과 양을 극대화하는 것입니다. 이 방법은 어떤 돌연변이가 존재하는지, 어떤 경로가 활성화되는지, 그리고 어떤 면역 세포 하위 유형이 인간 종양에 침윤하는지와 같은 중개 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단 한 번의 인간 조직 외과적 절제로부터 방대한 양의 데이터를 생성할 수 있다는 점입니다.검체 처리 전 가장 중요한 단계 중 하나는 프로토콜 본문에 설명된 바와 같이 병리학적 평가를 통해 시료의 품질을 보장하고 생존 가능한 종양의 존재를 검증하는 것입니다. 환자 성명, 번호, 치료 내용 및 수술 날짜와 같이 검체 또는 조직에 관한 모든 관련 정보는 기관 조직 데이터베이스에서 즉시 확인할 수 있어야 합니다. 신선 조직 검체는 항상 젖은 얼음 위에 보관해야 하며, 조직 시료를 천연 환경에서 추출함으로써 유발되는 변화를 제한하기 위해 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 정상 대조군 조직과 종양 조직 시료는 각각 분리하여 처리해야 합니다.교차 오염을 방지하기 위해 멸균된 페트리 배양 접시, 메스, 그리고 조직 처리를 위한 바늘 또는 핀셋을 준비하십시오. 시료 처리 시간을 단축하기 위해, 여기에서 보여주는 것과 같이 필요한 모든 품목을 미리 배치하십시오. 조직 표본을 열려 있는 페트리 배양 접시의 바닥면에 평평하게 놓으십시오.샘플의 구조와 크기를 더 잘 이해하기 위해 모든 각도에서 샘플을 관찰하십시오. 바늘을 사용하여 샘플을 접시 바닥에 고정한 후, 조직의 가장 크고 대표적인 축을 따라 이분하십시오. 조직의 작은 조각을 절취하여 1 mL의 RNA 안정화 용액이 들어 있는 멸균된 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 넣으십시오.이 샘플을 공정의 나머지 단계 동안 얼음 위에 두고, 필요할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 페트리 배양 접시 뚜껑 위에 라벨을 미리 부착하여 열어둔 생검 카세트를 놓습니다. 조직을 3~5mm 이하의 두께로 절단하여 카세트로 옮깁니다.카세트를 10% 중성 완충 포르말린에 최소 72시간 동안 담가 둡니다. 실온에서 조직 조각을 잘라 조직 몰드에 넣습니다. 조직 절편을 OCT 화합물로 덮고, 동결 절편 제작 준비가 될 때까지 -20 °C에서 즉시 냉동 보관합니다.하나 또는 여러 개의 조직 조각을 잘라 max buffer가 들어 있는 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 조직은 즉시 사용하거나, 유세포 분석을 위해 4 °C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. 나머지 조직은 최대 0.5 millimeters by 0.5 millimeters 이하의 크기로 자른 후 냉동 보관용 튜브(cryogenic vials)로 옮깁니다.장기 보관을 위해 조직을 액체 질소에 즉시 급속 냉동하십시오. 이 절차를 시작하려면 DM EMD NS one과 collagenase를 사용하여 소화 배지를 준비하십시오. 신선하거나 max buffer에 담아 하룻밤 동안 보관한 종양을 페트리 접시 뚜껑에 놓고 소화 배지에 잠기게 하십시오.바늘을 사용하여 종양을 디쉬 바닥에 고정하고, 종양이 페이스트와 같은 질감이 될 때까지 메스로 바깥쪽에서 중심 방향으로 자릅니다. 종양 혼합물을 50 milliliter 튜브로 옮기고 누출을 방지하기 위해 튜브를 밀봉합니다. 튜브를 인큐베이터로 옮겨 37 degrees Celsius에서 225 RPM으로 1시간 동안 교반합니다.1시간 후, 종양 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너로 여과한 다음, 250 ×g, 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 세포 펠렛을 1 mL의 FACS 버퍼로 재현탁합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 세포 농도가 1 × 10⁷ cells/mL가 되도록 재현탁합니다.96-웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 100 µL 또는 10⁶ 개의 세포를 분주합니다. 각 웰에 200 µL의 생존능 염색 용액을 첨가하고 혼합한 후, 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 250 ×g, 4 °C 조건에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킵니다.상층액을 흡입하여 제거합니다. 표면 항원에 대해 권장되는 적정 농도로 희석한 항체 혼합물 200 µL를 FACS 버퍼에 넣어 첨가합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다.세포를 250 Gs, 4°C에서 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 200 µL의 FACS 버퍼로 세척한 뒤 다시 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 200 µL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다. 이제 세포를 유세포 분석기로 분석할 준비가 되었습니다. 이 대표 결과는 시연된 방식대로 처리하고 4°C의 FACS 버퍼에 하룻밤 동안 보관한 흑색종 종양 시료의 광범위한 면역 표현형 분석을 위한 유세포 분석 게이팅 전략을 보여주며, 세포 사멸이 매우 제한적임을 나타냅니다.또한, 조직 처리 과정이 시연됩니다. 이 기술을 숙달하면 B 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, 감마 델타 T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, 비만 세포, 염기구, 중성구 및 호산구와 같은 흑색종 내 면역 세포 하위 집합의 다색 광범위 표현형 분석이 가능해집니다. 적절하게 수행될 경우, 이 기술은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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