사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링

다음 실험의 전반적인 목적은 분비형 리포터 단백질을 사용하여 시간이 경과함에 따라 소포체 칼슘 조절 장애를 모니터링하는 것입니다. 이는 표적 조직, 특히 간의 바이러스 벡터 매개 형질전환을 통해 달성됩니다. Gai luciferase circa 리포터를 이용한 이 예시에서는 혈액과 같은 차후 생물학적 유체를 수집하여 조직에서 방출된 circa의 양을 측정하며, 그 후 혈장 샘플에 luciferase 기질을 첨가하고 발광도를 측정하여 ER 칼슘 고갈 상태를 결정합니다.

결과는 혈장 C camp 수치의 증가로 나타나는 ER 칼슘 조절 장애를 보여주며, 생체 시료의 소량을 반복적으로 채취함으로써 장기간에 걸쳐 ER 항상성을 모니터링할 수 있습니다. 저친화성 칼슘 염료나 유전적으로 부호화된 칼슘 지표와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 최소 침습적 절차를 통해 생체 내(in vivo)에서 시간에 따른 ER 칼슘 항상성을 모니터링할 수 있다는 점입니다. 이 기술을 활용한 치료적 방안에는 두 가지 경로가 있습니다.

첫 번째는 ER 칼슘 항상성을 정상적인 생리적 상태로 유지하거나 회복시킬 수 있는 약물을 스크리닝하는 것입니다. 두 번째 접근 방식은 치료용 단백질을 수정하여 ER 칼슘 고갈에 반응하여 분비가 일어나는 치료용 AMP로 만드는 것입니다. 이러한 방법은 간에서의 ER 칼슘 조절 장애에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 뇌, 심장, 근육 또는 췌장과 같은 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 스프랏 돌리 랫(sprat dolly rat)을 마취시킨 후, 안연고를 도포하고 꼬리 집기(tail pinch)를 수행하여 마취 상태를 확인합니다. 갈비뼈 약간 아래부터 복부 중앙 부위까지의 복부 영역을 삭모하고, Betadine과 70% ethanol을 교대로 사용하여 수술 부위를 세 번 세척합니다. 그런 다음 랫을 멸균된 수술 구역에 앙와위(supine position)로 배치하고 멸균 수술 포로 덮은 뒤, a v gluc samp를 사용자 최적화 농도로 희석합니다.

본 사례에서는 mL당 7.6 × 10⁹의 바이러스 게놈을 사용하였으며, 튜브를 반전시켜 혼합했습니다. 그 후 희석된 AAV 105 µL를 멸균 접시에 취하고 30게이지 바늘을 사용하여 주사기에 바이러스를 수집합니다. 메스를 사용하여 주사를 위해 간을 노출시킬 목표 절개 부위를 표시합니다.

늑골 아래 약 2~3cm 길이로 수평 절개를 합니다. 둔성 박리를 통해 결합 조직을 피하 조직으로부터 분리합니다. 복근을 절개하여 간의 우측 내측 엽을 노출시킵니다.

다음으로, 동물을 수술 현미경 아래에 두고 간의 우측 내엽이 시야에 들어오도록 조정합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 바이러스 총 부피의 3분의 1씩을 우측 내엽 실질의 세 부위에 주입하며, 주입액 전체가 완전히 전달될 수 있도록 주입 후 바늘을 조직 내에 5~10초 동안 유지합니다. 복근과 절개 부위를 봉합하고 면봉을 사용하여 Neosporin을 도포합니다. 쥐가 의식을 회복하고 직립 자세를 유지할 수 있을 때까지 회복 챔버에 두었다가, 개별 사육 홈 케이지로 복귀시킵니다.

주사 후 4~7일 후에 수행합니다. 혈액 수집 튜브에 라벨을 붙이고 미리 무게를 달아 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 1000 units/mL 농도의 heparin 50 µL를 첨가합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 쥐를 마취시킨 후, 꼬리를 집어 진정 상태를 확인하고 멸균 가위로 꼬리 끝에서 약 1~2mm 지점을 절단합니다. 지혈을 위해 heparin이 미리 채워진 튜브에 혈액 100 µL 이상을 한 방울씩 수집합니다.

젖은 면봉을 사용하여 꼬리에 STIC 파우더를 도포합니다. 채혈 사이마다 에탄올 패드로 가위와 비드를 닦아 멸균합니다. 혈액 튜브는 4°C에서 보관하십시오.

이후의 샘플을 수집하는 경우, 수집 튜브의 무게를 측정하고 혈액과 heparin의 비율이 2:1이 되도록 heparin 양을 조절하십시오. 이 단계는 각 샘플 내 heparin의 양을 표준화하기 위한 것입니다. 튜브를 2000 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리하십시오.

플라즈마 상층액을 새 튜브로 옮기고, 루시페라아제 분석에서 thaa garin을 양성 대조군으로 투여하기 위해 4 °C에서 최대 72시간 동안 또는 장기 보관을 위해 -80 °C에서 보관합니다. 에탄올로 희석하여 최종 농도를 2.5 mg/mL로 맞춥니다. 그런 다음 하복부에 1 mg/kg의 용량으로 복강 내 주사합니다.

위에서 설명한 대로 주사 24시간 후에 첫 번째 혈액 샘플을 채취하십시오. 발광도를 측정하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 selen ezine 작동 기질을 준비하고 빛이 차단된 실온에서 30분 동안 배양하십시오.

그동안 모든 샘플을 얼음 위에서 해동하고, 생체 발광 모니터링이 가능하며 기질 주입기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 10 µL의 혈장을 불투명 벽 플레이트로 옮깁니다. 기질로 라인을 프라이밍합니다. 웰에 100 µL의 기질을 주입합니다.

중속으로 5초 동안 흔든 후, in vitro 시료의 빛 방출량을 측정합니다. re 단계에서는 0.5초 동안 빛 방출량을 적분하고, in vivo 시료의 경우 er 칼슘 항상성을 평가하기 위한 read 단계에서 5초 동안 적분합니다. Gluc SAR Camp 방법을 사용하여, 이 사례의 Gluc Noag와 같이 지속적으로 분비되는 리포터와 같은 여러 대조군을 포함할 수 있습니다.

실험 조건에 반응하여 GLUC SAR camp와 Gluc noag의 세포 외 수준이 모두 증가하는 것은 모호한 결과로 간주됩니다. 그러나 Gluc noag의 반응 없이 gluc SAR camp 분비만 증가하는 것은 ER 칼슘 의존적 사건임을 뒷받침합니다. 새로운 패러다임에서 SAR camp 방출에 대한 ER 칼슘의 기여도를 확인하기 위해 ER 칼슘 저장소의 약리학적 조절제를 활용할 수 있습니다.

예를 들어, 여기서 시연된 바와 같이 ER 칼슘을 안정화하는 INE 수용체 길항제인 dantrolene은 thic argon에 반응하는 SAR camp의 방출을 억제합니다. gluc 기반 SAR camp를 사용하는 in vitro 연구의 경우, 처리에 의해 유도된 반응은 시간 경과에 따라 평가하는 것이 가장 적절합니다. 대조군 대비 플레이트 내의 상대적 반응 변화를 추적해야 하며, 기질의 분해로 인해 원시 값(raw values)이 변할 수 있으므로 여러 플레이트 간의 원시 수치를 직접 비교하는 것은 권장되지 않습니다. in vivo 연구의 경우, 각 동물을 자체 전처치 대조군으로 하여 동물별로 데이터를 독립적으로 평가해야 합니다.

이는 동물 간의 트랜스진 전달 및 발현의 가변성을 고려하기 위해 필요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 간 질환 설치류 모델에서 ER 칼슘 조절을 조사하기 위해 sircam 기술을 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 바이러스 벡터를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.