일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

이 절차의 전반적인 목표는 닭 배아로부터 전체 망막 임플란트를 실험적으로 분리, 조작 및 배양하는 것입니다. 이는 먼저 닭 배아에서 양쪽 눈을 수집하여 페트리 접시에 담음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 미세 핀셋을 사용하여 공막과 색소 상피를 제거하는 것입니다.

다음으로, 적출된 망막 전체를 평면 원형 전극을 사용하여 플라스미드 DNA 전기천공법으로 처리합니다. 마지막 단계는 24웰 플레이트에 담아 배양기 내의 배양액에서 망막 적출물을 배양하는 것입니다.

마지막으로, 망막 임플란트 전체를 고정하고 동결 절편을 만든 후, 면역형광 현미경으로 분석하여 망막 뉴런을 시각화합니다. OVO 전기 수술과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 신속하고 수행하기 쉬우며 결과의 재현성이 보장된다는 것입니다. 이 방법은 배양 후, 효소 억제제나 세포 주기를 표적으로 하는 유전자 산물과 같은 특정 화학 시약이 신경 발생에 어떤 영향을 미치는지와 같이 중추 신경계 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

원하는 배아 단계의 알을 층류 후드(laminar flow hood) 내에 두고, 배아의 오염을 방지하기 위해 알껍질을 70% ethanol로 닦아냅니다. 단단한 표면에 알의 측면을 강하게 두드려 껍질을 깨뜨린 다음, 내부 내용물을 100 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 작은 스푼을 사용하여 배아를 37 degrees Celsius로 예열된 PBS가 담긴 35 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다.

다음으로, 배아의 머리를 절단하고 배아 조직이 담긴 35 millimeter 페트리 접시를 층류 후드 내의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 미세 핀셋을 사용하여 눈의 복측에 있는 입을 통해 절개합니다. 절개 부위부터 시작하여 눈 전체를 둘러싸고 있는 조직을 찢어서 엽니다.

다음으로, 시신경을 꼬집어 끊고 안와에서 온전한 눈을 제거합니다. 대조군 또는 처리군 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아에서 좌우 양쪽 눈을 모두 수집합니다. 미세 핀셋을 사용하여 작은 스푼으로 눈을 예열된 PBS가 담긴 새로운 35 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다.

공막 경막을 포함하여 눈 주변의 모든 조직을 제거합니다. 다음으로, 신경 망막이 손상되지 않도록 주의하며 눈의 등쪽 부분에 있는 색소 상피에 작은 절개창을 냅니다. 그런 다음 절개 부위부터 색소 상피를 조심스럽게 찢어서 엽니다.

수정체와 망막 전체를 유리체에 부착된 상태로 둡니다. 색소 상피를 제거하되, 눈의 전방 부위인 동공 주변의 모양체와 맥락막 틈새를 따라 제거할 때는 해당 부위에서 제거하기 어려우므로 주의하십시오. 전극 장치를 켜고, hamburger 및 Hamilton stage 20~25 망막의 경우 전압을 15V로 설정하고, stage 26~27 망막의 경우 20V로 설정하십시오.

다음으로, 펄스 반복 횟수를 50밀리초의 펄스 5회로 설정하고, 펄스 간격은 1초로 설정하십시오. 양손으로 전극을 고정해야 하므로 바닥의 풋 페달로 제어할 수 있는 펄스 발생기를 사용하십시오. 맞춤 제작된 패들 모양의 백금 전극 2개를 펄스 발생기의 출력 소켓에 연결하십시오.

여기에 표시된 전극은 0.1 millimeter 백금 판으로 제작되었으며, 0.8 millimeter 연결선은 절연 처리되었습니다. 플라스틱 튜브를 사용하여, 끝부분을 잘라낸 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫으로 전체 망막 이식편을 조심스럽게 비커로 옮깁니다. 망막이 플라스틱에 달라붙어 찢어질 수 있으므로 피펫 팁 사용은 피하십시오.

다음으로, 100 µL 피펫을 사용하여 망막 외식편 주변의 PBS를 조심스럽게 모두 제거합니다. 이때 망막이 찢어지지 않도록 망막에 닿지 않게 주의하십시오. 희석된 플라스미드 용액 100 µL를 QVE에 첨가하고, 망막 외식편 전체가 용액으로 덮였는지 확인합니다.

망막 절편이 위로 떠오르면 핀셋으로 부드럽게 눌러줍니다. 핀셋 전극을 사용하여 수정체가 vete의 한쪽 면을 향하게 배치하고 시신경이 vete의 바닥을 향하도록 유도합니다. 다음으로, 조직에 닿지 않도록 주의하며 양극 전극은 수정체 앞에, 음극 전극은 망막 뒤에 배치합니다.

풋 페달을 눌러 전류를 가한 후, 전극에서 기포가 발생하는지 확인하여 방전이 성공적으로 이루어졌는지 점검하십시오. 100 µL 파이펫을 사용하여 망막이 손상되지 않도록 주의하며 qve에서 모든 플라스미드 혼합물을 제거하십시오. 플라스미드 혼합물은 플라스미드를 제거한 후 3~5회 재사용할 수 있습니다.

미리 데운 PBS로 vete를 채웁니다. 핀셋을 사용하여 vete 벽면에서 망막 절편을 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 망막 절편 전체를 1 mL의 미리 데운 배지가 담긴 24-웰 플레이트로 옮깁니다.

웰당 하나의 망막 절편만 배양합니다. 망막 절편을 37 °C, 5% CO2 조건에서 50 RPM의 일정한 속도로 회전하는 로테이터 쉐이커(rotator shaker)에서 배양합니다. 회전을 통해 배지에 대한 노출을 최대화하고 망막이 24웰 플레이트 바닥에 부착되는 것을 방지합니다.

24시간 배양 후, 전기천공법을 통해 넓은 망막 영역에서 플라스미드가 도입되고 리포터 유전자가 발현됨에 따라, 온전한 망막의 상당 부분에서 GFP 양성 세포가 관찰되었습니다. 절편 제작 후, 망막의 ACO 기저축을 따라 단일 GFP 양성 세포들이 쉽게 검출되었습니다. 전체 망막 절편은 약 24시간 더 배양할 수 있습니다.

배양 시간은 발달 지연, 형태학적 기형, 세포 사멸, 그리고 최종적으로는 망막의 붕괴를 초래할 수 있습니다. 24시간 동안 배양한 전체 망막 절편의 섹션을 phospho histone three로 면역 염색하였으며, 이는 빨간색 채널에 표시됩니다. phospho histone three는 G2/M기 후기의 세포를 표지합니다. pH3 양성 세포는 망막의 정단측에서 발견되었으며, 이는 정상적인 망막 발달과 일치하는 결과입니다.

여기서 보여주는 바와 같이, 이러한 발달은 CDK1/2 억제제를 첨가함으로써 차단될 수 있으며, 이미징 전 4시간 동안 억제제로 배양하면 망막 발달 후 pH3 양성 세포의 수가 유의미하게 감소했습니다. 이 기술은 새로운 DNA 플라스미드로부터의 유전자 발현을 조사하고, DNA 손상 경로 및 세포 주기 조절제를 포함한 화학 시약으로 망막 절편을 처리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 절차에 이어, 결과를 추가로 확인하기 위해 in ovo 전기천공법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.