Name: 일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 닭 배아에서 전체 망막 explant를 분리하고 전기천공으로 플라스미드 DNA를 도입하는 방법을. 이 기술은 망막 발달 및 중추신경계 연구에 재현성 높은 결과를 제공합니다.

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이 연구는 Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond 및 St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 &quot;비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드&quot;의 권장 사항에 따라 수행된다. 1. 계란 취급과 눈 모음 <ol><li> 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다. 참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이어집니다. 확장 된 저장 시간은 사망률과 이상 발생시 모두 증가. </li><li> 부드러운은 24 시간 당 5 배의 주파수에서 락으로 37.5 ° C 계란 60 % 가습 계란 인큐베이터를 품어. </li><li> 원하는 배아 나이에 계란 인큐베이터에서 배양 알을 제거합니다. 주 : 닭 배아의 연령은 인큐베이션 시간으로 결정되고, 배아 일 (E) 또는 단계로 표시된다 (세인트을), 햄버거 해밀턴 (12)에 의해 설명 된 발달 단계의 일련의 제조 방법. </li><li> 층류 후드에서 선택한 알을 놓습니다. 배아의 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 달걀 껍질을 닦습니다. 참고 : 멸균 솔루션을 무균 상태에서 모든 절차를 실시 <url> https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> 및 악기. </li><li> 계란을 개방 균열 단단히 하드 표면에 계란의 측면을 누릅니다. 100mm 페트리 접시의 콘텐츠를 배치합니다. 마르지 않도록 조직 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 35mm 페트리 접시에 배아를 전송할 작은 스푼을 사용한다. </li><li> 층류 후드에서 양안 스테레오 비젼 해부 현미경에 배아 조직을 포함하는 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 미세 집게로 목을 곤란하게하여 배아를 참살하고 시신을 버리십시오. </li><li> 번째 절개를 만들기 위해 미세 집게를 사용하여눈에 복부 거친 입,. 절개 부위부터 전체 눈 주변 조직을 오픈 찢어. 시신경을 조이고 눈 소켓에서 그대로 눈을 제거합니다. 제어 또는 처리 중 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아로부터 좌측 및 우측 눈 모두 모아서. </li><li> 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 새로운 35mm 페트리 접시에 눈을 전송할 작은 스푼을 사용한다. </li></ol> 전체 망막의 Explants 2. 준비 <ol><li> 공막 anlage을 포함하여 눈 주위의 모든 조직을 제거하는 미세 집게를 사용합니다. 주 : 조직은 쉽게 색소 상피 손상 (도 1A-B)와 유리체 및 망막에 렌즈를두고 분리된다. </li><li> 신경 망막 (그림 1C)을 손상시키지 않고 눈의 지느러미 부분에 색소 상피 세포에 작은 절개를 끼지 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 색소 상피의 starti을 열고 눈물 미세 집게를 사용하여절개 부위에 겨 렌즈와 유리체 (도 1D)에 연결된 전체 망막을 떠나. 색소 상피 세포의 제거를 용이하게 따뜻한 (37 ℃)에서 1X PBS 주시. 색소 상피 세포는 눈의 전방 영역, 동공 주위 모양체 따라, 특히 분리하기가 어려울 수 있고, 맥락막 열창 따라 참고. 따라서, 색소 상피 세포의 일부가 망막 신경 (도 1E-F)에 남아있을 수있다. </li></ol> 전체 망막의 Explants 3. 치료 <ol start="1"><li> 전체 망막 외식의 전기 참고 : 전체 망막 외식의 일렉트로는 2 단계 후 직접 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다. </li><li> 1.5 ml의 일회용 플라스틱 큐벳을 잘라 (12.5 mm X 12.5 mm X 45mM) (또는 미세 블레이드 톱을 사용하여 바닥에서) 약 8mm를 300 ~ 400 μL 솔루션을 보유 할 수있는 작은 용기. </li><li> 0.1 μg의 / μL의 최종 농도 1xDPBS 선택의 DNA 플라스미드를 희석. </li><li> ST20 15 V에 electroporator 및 설정 매개 변수를 켜십시오 - ST25 (E3-E4) 망막 및 ST26 20 V - ST27 (E5) 망막. 1 초 간격으로 50 밀리 초 펄스 길이의 5 펄스 펄스 반복을 설정합니다. 양손 곳에 전극을 유지하는 데 필요한 것 같이 바닥에 발 페달에 의해 제어 될 수있는 펄스 발생기를 사용한다. </li><li> 두 개의 패들 형 (평면, 원형 DIAM을. 4mm) 연결 백금 전극 (그림 2A)를 펄스 발생기의 출력 소켓에. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 백금 전극 대학 워크샵에 의해 만들어졌다. 전극은 0.1 mm의 백금 판 &quot;rondelles&quot;(: 950 편 / 5 구리 백금 등급)에서 만들어졌다. 연결 0.8 mm 위스콘신재는 플라스틱 배관을 이용하여 절연 하였다. </li><li> 조심스럽게 망막 절편에 맞는 팁 개방 크기를 취득 잘라 끝 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳 (또는 이에 상응하는 작은 용기) 단계 2.3에서 전체 망막 절편을 전송합니다. 망막은 플라스틱에 부착 떨어져 눈물 경향이 피펫 팁을 사용하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 찢어지지 않도록 망막을 만지지 않도록 망막 절편 돌보는 주변 전체 1X PBS를 제거하기 위해 100 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 전체 망막 절편을 충당하기 위해 큐벳에 100 μL 플라스미드 솔루션을 추가합니다. 그것은 정상에 수레 경우 부드럽게 집게로 망막 절편을 누릅니다. 큐벳의 바닥 큐벳 및 시신경의 어느 한 쪽을 향하도록 렌즈를 위치 시키거나 집게 전극을 사용한다. </li><li> 조직을 건드리지 않고, 렌즈와 망막 (도 2A) 뒤에 부극 앞에 정극을 배치. </li><li>발 페달을 눌러 전류를 적용합니다. 성공적인 방전을 나타내는 전극에 거품이 있는지 확인합니다. </li><li> 망막을 손상시키지 않고, 큐벳 모든 플라스미드를 제거하기 위해 믹스 100 ㎕를 피펫을 사용한다. 플라스미드 믹스 3-5 번 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 사전 예열 (37 ° C) 1X PBS로 큐벳을 입력합니다. 부드럽게 큐벳의 벽에서 망막 절편을 분리 집게를 사용합니다. 전기 천공 후 망막은 때때로 큐벳의 벽에 부착하게하는 거품으로 덮여있다. </li><li> 웰 당 1ml를 예열 된 (37 ℃) 배양 배지를 함유하는 24- 웰 플레이트에 전체 망막 이식편을 전송 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용한다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO 2 세포 배양기 안에, 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. 회전 매체와 preve에 노출을 최대화하는 것이다24- 웰 플레이트의 바닥에 망막의 NT 밀착성. </li><li> 4 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 화학 시약 전체 망막 외식의 치료 주 : 전체 망막 이식편의 화학적 처리는 2 단계 후 직접 수행 될 수있다. <ol><li> 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다. </li><li> 물론 당 (37 ° C를) 배지 예열 1 ml에 포함 된 24 웰 플레이트로 단계 2.3에서 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어. </li><li> 화학 반응물 또는 비히클을 첨가하기 전에 5 % CO 2 세포 배양기 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 동안 전 배양 한 망막 이식편. </li><li> 예를 들면, 화학 용액을 제조는 Cdk1 / 2 억제제 III, 최종 단계에서 M (13)의 진행 억제제,DMSO 30 μM의 농도. </li><li> 세포 배양기에서, 전체 망막 절편을 포함, 24 웰 플레이트를 제거합니다. 0.01 % DMSO에서 300nm의는 Cdk1 / 2 억제제 III의 최종 농도 결과 망막 매체에 직접 화학 반응물 또는 비히클 (DMSO)의 10 μL를 추가한다. 수동 용액에서 화학 시약 또는 비히클의 균일 한 분포를 허용하도록, 24 웰 플레이트를 회전한다. </li><li> 소정 시간 (최대 24 시간) 5 % CO 2 인큐베이터 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. </li><li> 4 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. 고정 및 전체 망막 Eexplants의 동결 <ol><li> 세포 배양기에서 처리 된 전체 망막 절편을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다. </li><li> 1 x PBS를 1 mL의 IN / 웰 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 24 웰 플레이트에 망막 이식편을 전송할 작은 스푼을 사용한다. Incuba15 분 동안 얼음에 테. </li><li> 망막을 씻어 1 ㎖ / 잘 차가운 얼음 x PBS를 포함 된 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 1 ㎖ / x PBS를 잘 차가운 얼음 30 % 자당을 포함하는 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 1-3 시간이 망막의 배아 일에 따라 얼음 위에서 배양한다. ST20은 - ST25 (E3) 망막은, 1 시간 동안 품어, 이전 망막은 자당에 이상 배양 시간이 필요합니다. </li><li> 약 500 μL 저온 유지 동결 설치 매체를 포함하는 파라핀 필름에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 부드럽게 작은 스푼을 사용하여 동결 배지에서 망막 이식편을 이동시킴으로써만큼 수크로오스 최대한 제거한다. </li><li> 동결 배지를 함유하는 주형에 매립 망막 이식편 옮긴다. 미래의 단면을 용이하게하기 위해 눈을 놓습니다. DR에 전체 망막 이식편을 함유하는 틀 매립 넣어매체까지 Y 얼음이 얼어있다. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commu%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res+Dev+brain+re%22%5BJournal%5D)">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+US%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+eye+re%22%5BJournal%5D)">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li>
<li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li>
<li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과. 전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 노출시키기 쉽다. 이 접근법은 오보에 electroporations에 비해 일반적으로 더 높은 성공률과 망막에서 유전자 기능을 연구하기위한 신뢰할 수있는 방법을 허용한다. 전체 망막 이식편도 가능주는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 망막을 노출 할 수있다 신경 망막에서 시약의 균일 한 분포. 프로토콜 조합을 허용망막은 제 물질로 처리 한 다음 일렉트로되고먼트. 처리 및 제어 눈 모두 동일한 배아로부터 수집 될 수 있고, 독립적으로 처리 이...

망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다. OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 3 후뇌, 4 망막 신경 튜브 (2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다. 이 근접 전기 다음 심장 마비의 위험 및 배아의 나이와 위험 증가를 증가시킨다. 또한, 눈에 액세스하기 위해서는 이에 출혈, 기형 및 후속 감소 가능성에 대한 위험을 증가 배아 멤브레인을 열 필요가있다. 테스트 및 공지 표현형 결과없이 종종 새로운 DNA 플라스미드를 최적화 할 때, 이러한 한계는 심지어 숙련 된 실험자 방법의 효능 및 전력을 감소시킬 수있다. 이 프로토콜, W의 문화에 제시된 바와 같이제거 색소 상피 세포와 전체 신경 망막으로 정의 구멍 망막 이식편은 비켜 접근 방식을 보완하는 효율적인 방법이다. 화학 시약의 안구 내 주사는 비켜에서 수행하기가 비교적 쉽다. 그러나, 신경 망막 내 시약의 주입 효과적이고 정확한 농도는 완전히 제어하기 어려울 수있다. 주입 된 부피는 누설에 따라 다를 수 있으며, 주사의 정확한 위치는 눈 내부의 시약의 유통 및 유리체를 통해 확산 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 가변성 즉, 효소 억제제에 대한 투여 량 반응 곡선을 결정 결과의 해석에 중요한 의미를 가질 것이다; 효과는 적고, 효과의 시간 창이 좁 경우 특히. 오보 실험에서 또한 수행 할 때, 단일 눈 인한 혈류를 통한 전신 효과 전위 각 배아에서 사용될 수있다반대편 눈 위에. 개발 및 처리 및 제어 배아 추가 실험 변동 될 수 있습니다 사이의 개별 변동을 연구 할 때 나이 일치가 중요하다. 이러한 이유로, 닭 배아 망막 이식편에 기초한 방법 오보 EX가되는 신경 망막을 균일하게 노출 될 수 있으며, 시험 관내에서의 실험 조건을 제어, 개발되었다. 본 프로토콜은 이전 프로토콜 5-9를 기반으로 개발되었다. 스테이지로부터 망막 이식편 (세인트) ST31 20 (3 배아 일 [E])을 (E7)는 닭 배아는 배양 해부 및 일렉트로 정의 DNA 플라스미드 농도 또는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 노출시켰다. 여기에 제시된 프로토콜은 성공적 KU55933, SB 218,078 및 109,555 NSC dito 같은 DNA 손상 경로의 레귤레이터를 포함하여 여러 가지 화학 시약을 사용하여, 최근의 간행물에서 구현 된이러한는 Cdk1 / 2 10,11 III 억제제로서 sylate 및 세포주기.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (태블릿)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 디쉬</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 일회용 플라스틱 큐벳</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 억제제 III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300nM in 0.01% DMSO</td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>전극</td><td></td><td></td><td>플라티나, 맞춤형</td></tr><tr><td>전기 사각 포레이터 ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 영양소 혼합</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>냉동 매체 NEG50</td><td>Cellab, Sweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP 발현 DNA 플라스미드(pZG)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가습 인큐베이터</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체 ProLong Gold with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 필름</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 임베딩 몰드&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>포스포히스톤 3 (PH3)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>희석 1/4,000</td></tr><tr><td>플래티넘 전극 ("론델레"로 맞춤 제작)</td> <td>Sargenta</td><td>390-R (론델러)</td><td>Dia: 4mm, 0.1 mm 두께</td></tr>의 <tr><td>Platimun 전극&nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Dia : 4mm</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>로테이터 셰이커</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>작은 숟가락</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>화이트 레그혼 달걀</td><td></td><td></td><td>현지 공급 업체</td></tr><tr><td>와인 쿨러</td><td>WineMaster 24, Caso, 베를린 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 explants

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에​​ 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다. 이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다. 전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵이 제거 된 눈에서 제거되었습니다. 전체 망막 이식편이어서 플라스미드 DNA 용액을 함유하는 큐벳에 넣고, 전극 (도 2A) 침지하고, 전류를인가 하였다. 배양 24 시간 후, GFP 양성 세포가 망막 손상 (도 2b)의 큰 부분에서 볼 수 있었다. 단면 처리 한 후, 단일 세포를 GFP + 쉽게 망막 apico - 기저 축 (FI 따라 검색된gure 2C). 전기 큰 ...

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

이 절차의 전반적인 목표는 닭 배아로부터 전체 망막 임플란트를 실험적으로 분리, 조작 및 배양하는 것입니다. 이는 먼저 닭 배아에서 양쪽 눈을 수집하여 페트리 접시에 담음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 미세 핀셋을 사용하여 공막과 색소 상피를 제거하는 것입니다.다음으로, 적출된 망막 전체를 평면 원형 전극을 사용하여 플라스미드 DNA 전기천공법으로 처리합니다. 마지막 단계는 24웰 플레이트에 담아 배양기 내의 배양액에서 망막 적출물을 배양하는 것입니다.마지막으로, 망막 임플란트 전체를 고정하고 동결 절편을 만든 후, 면역형광 현미경으로 분석하여 망막 뉴런을 시각화합니다. OVO 전기 수술과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 신속하고 수행하기 쉬우며 결과의 재현성이 보장된다는 것입니다. 이 방법은 배양 후, 효소 억제제나 세포 주기를 표적으로 하는 유전자 산물과 같은 특정 화학 시약이 신경 발생에 어떤 영향을 미치는지와 같이 중추 신경계 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.원하는 배아 단계의 알을 층류 후드(laminar flow hood) 내에 두고, 배아의 오염을 방지하기 위해 알껍질을 70% ethanol로 닦아냅니다. 단단한 표면에 알의 측면을 강하게 두드려 껍질을 깨뜨린 다음, 내부 내용물을 100 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 작은 스푼을 사용하여 배아를 37 degrees Celsius로 예열된 PBS가 담긴 35 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다.다음으로, 배아의 머리를 절단하고 배아 조직이 담긴 35 millimeter 페트리 접시를 층류 후드 내의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 미세 핀셋을 사용하여 눈의 복측에 있는 입을 통해 절개합니다. 절개 부위부터 시작하여 눈 전체를 둘러싸고 있는 조직을 찢어서 엽니다.다음으로, 시신경을 꼬집어 끊고 안와에서 온전한 눈을 제거합니다. 대조군 또는 처리군 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아에서 좌우 양쪽 눈을 모두 수집합니다. 미세 핀셋을 사용하여 작은 스푼으로 눈을 예열된 PBS가 담긴 새로운 35 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다.공막 경막을 포함하여 눈 주변의 모든 조직을 제거합니다. 다음으로, 신경 망막이 손상되지 않도록 주의하며 눈의 등쪽 부분에 있는 색소 상피에 작은 절개창을 냅니다. 그런 다음 절개 부위부터 색소 상피를 조심스럽게 찢어서 엽니다.수정체와 망막 전체를 유리체에 부착된 상태로 둡니다. 색소 상피를 제거하되, 눈의 전방 부위인 동공 주변의 모양체와 맥락막 틈새를 따라 제거할 때는 해당 부위에서 제거하기 어려우므로 주의하십시오. 전극 장치를 켜고, hamburger 및 Hamilton stage 20~25 망막의 경우 전압을 15V로 설정하고, stage 26~27 망막의 경우 20V로 설정하십시오.다음으로, 펄스 반복 횟수를 50밀리초의 펄스 5회로 설정하고, 펄스 간격은 1초로 설정하십시오. 양손으로 전극을 고정해야 하므로 바닥의 풋 페달로 제어할 수 있는 펄스 발생기를 사용하십시오. 맞춤 제작된 패들 모양의 백금 전극 2개를 펄스 발생기의 출력 소켓에 연결하십시오.여기에 표시된 전극은 0.1 millimeter 백금 판으로 제작되었으며, 0.8 millimeter 연결선은 절연 처리되었습니다. 플라스틱 튜브를 사용하여, 끝부분을 잘라낸 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫으로 전체 망막 이식편을 조심스럽게 비커로 옮깁니다. 망막이 플라스틱에 달라붙어 찢어질 수 있으므로 피펫 팁 사용은 피하십시오.다음으로, 100 µL 피펫을 사용하여 망막 외식편 주변의 PBS를 조심스럽게 모두 제거합니다. 이때 망막이 찢어지지 않도록 망막에 닿지 않게 주의하십시오. 희석된 플라스미드 용액 100 µL를 QVE에 첨가하고, 망막 외식편 전체가 용액으로 덮였는지 확인합니다.망막 절편이 위로 떠오르면 핀셋으로 부드럽게 눌러줍니다. 핀셋 전극을 사용하여 수정체가 vete의 한쪽 면을 향하게 배치하고 시신경이 vete의 바닥을 향하도록 유도합니다. 다음으로, 조직에 닿지 않도록 주의하며 양극 전극은 수정체 앞에, 음극 전극은 망막 뒤에 배치합니다.풋 페달을 눌러 전류를 가한 후, 전극에서 기포가 발생하는지 확인하여 방전이 성공적으로 이루어졌는지 점검하십시오. 100 µL 파이펫을 사용하여 망막이 손상되지 않도록 주의하며 qve에서 모든 플라스미드 혼합물을 제거하십시오. 플라스미드 혼합물은 플라스미드를 제거한 후 3~5회 재사용할 수 있습니다.미리 데운 PBS로 vete를 채웁니다. 핀셋을 사용하여 vete 벽면에서 망막 절편을 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 망막 절편 전체를 1 mL의 미리 데운 배지가 담긴 24-웰 플레이트로 옮깁니다.웰당 하나의 망막 절편만 배양합니다. 망막 절편을 37 °C, 5% CO2 조건에서 50 RPM의 일정한 속도로 회전하는 로테이터 쉐이커(rotator shaker)에서 배양합니다. 회전을 통해 배지에 대한 노출을 최대화하고 망막이 24웰 플레이트 바닥에 부착되는 것을 방지합니다.24시간 배양 후, 전기천공법을 통해 넓은 망막 영역에서 플라스미드가 도입되고 리포터 유전자가 발현됨에 따라, 온전한 망막의 상당 부분에서 GFP 양성 세포가 관찰되었습니다. 절편 제작 후, 망막의 ACO 기저축을 따라 단일 GFP 양성 세포들이 쉽게 검출되었습니다. 전체 망막 절편은 약 24시간 더 배양할 수 있습니다.배양 시간은 발달 지연, 형태학적 기형, 세포 사멸, 그리고 최종적으로는 망막의 붕괴를 초래할 수 있습니다. 24시간 동안 배양한 전체 망막 절편의 섹션을 phospho histone three로 면역 염색하였으며, 이는 빨간색 채널에 표시됩니다. phospho histone three는 G2/M기 후기의 세포를 표지합니다. pH3 양성 세포는 망막의 정단측에서 발견되었으며, 이는 정상적인 망막 발달과 일치하는 결과입니다.여기서 보여주는 바와 같이, 이러한 발달은 CDK1/2 억제제를 첨가함으로써 차단될 수 있으며, 이미징 전 4시간 동안 억제제로 배양하면 망막 발달 후 pH3 양성 세포의 수가 유의미하게 감소했습니다. 이 기술은 새로운 DNA 플라스미드로부터의 유전자 발현을 조사하고, DNA 손상 경로 및 세포 주기 조절제를 포함한 화학 시약으로 망막 절편을 처리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 절차에 이어, 결과를 추가로 확인하기 위해 in ovo 전기천공법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

우리는 닭 배아의 망막에서 콘 광수용체의 1 차적인 배양을 얻고 높은 함량 검열을 위한 그것의 사용을 얻는 방법을 기술합니다.

닭 배아망막에서 콘 세포 상호 작용에 로드를 연구하는 원뿔 농축 배양

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

이 프로토콜 논문은 렌즈 발달 중 단백질의 in situ 기능 및 발현을 연구하기 위한 도구로서 RCAS(A) 레트로바이러스의 배아 닭 수정체 미세 주입 방법론을 설명합니다.

재조합 RCAS(A) 레트로바이러스를 배아 닭 수정체에 미세주입

배우세요 닭 배아에서 전체 망막 explant를 분리하고 전기천공으로 플라스미드 DNA를 도입하는 방법을. 이 기술은 망막 발달 및 중추신경계 연구에 재현성 높은 결과를 제공합니다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

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