FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

이 절차의 전반적인 목적은 재조합 또는 생물학적 기원의 단백질 병성 시딩 활성을 검출하여, 단백질, 응집체 및 시료를 민감하게 검출하는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 질병 동물 모델에서 치료적 개입 이후의 시딩 활성 변화를 어떻게 정량적으로 평가할 수 있을 것인가와 같은 질문입니다.

이 기술의 장점은 낮은 수준의 단백질 응집체에 대한 높은 특이성입니다. 또한 매우 뛰어난 특이성과 사용 편의성, 그리고 높은 처리량을 자랑합니다. 오늘 이 실험 절차의 시연은 저와 공동 저자인 Brandon Holmes가 진행하겠습니다.

생물학적 시드 물질을 준비하려면 먼저 일회용 웨이 보트(whey boat)에 냉동 뇌 조직의 무게를 잽니다. 그다음 조직을 원심분리 튜브(conical tube)로 옮기고, 최종 용액의 부피가 10%가 되도록 얼음처럼 차가운 균질화 완충액을 추가한 후 샘플을 얼음이 담긴 저온실로 옮깁니다. 이어서 프로브의 표시기를 적절한 설정으로 조절하고 프로브의 측면과 바닥을 헹굽니다.

안내된 대로 지시약 팁을 세 번 세척하며, 각 용액 사이마다 프로브를 닦아냅니다. 프로브가 준비되면, 팁을 한 샘플의 균질화 완충액에 담그고 총 25회의 펄스를 전달하여 초음파 처리를 시작합니다. 조직이 완전히 현탁되면, 균질액을 원심 분리하여 상층액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다.

구개부에 무리가 가지 않도록 주의하십시오. 다양한 다른 균질화 기술을 사용할 수 있지만, 생물학적 시료에서 소량의 Protio pathic 종자를 분리하는 데는 프로베이션(probation) 방식이 더 우수합니다. 기계적 해리를 통해 조직을 일관되고 효율적으로 분해하여 이후 종자를 추출할 수 있습니다.

그 다음 상층액을 분주하고 용해물을 -80 °C에서 보관하십시오. 멸균 조건에서 바이오센서 세포를 재배양하려면, 각 세포주를 따뜻한 PBS로 세척한 후 trypsin EDTA로 3분간 배양하십시오. 세포가 탈착되면 따뜻한 배양 배지로 반응을 중단시키고 즉시 세포를 원심분리관으로 옮기십시오.

세포 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 신선한 배지에 현탁합니다. 그런 다음 세포 수를 측정하고, 배지 13 milliliters당 3,500,000개의 세포가 포함되도록 마스터 믹스 세포 희석액을 조제합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 세포 130 microliters를 조직 배양 처리된 평저 96웰 플레이트의 각 웰에 천천히 분주하며, 이때 피펫 팁이 플레이트 바닥에 닿지 않도록 웰의 중앙에 위치시켜 주의 깊게 처리합니다.

세포를 플레이팅한 후, 상온에서 10분 동안 그대로 두어 안정화시킨 다음, 37 °C, 5% carbon dioxide 및 80% 이상의 relative humidity 조건의 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 바이오센서 세포의 밀도가 60~65% confluent 상태가 되면, reduced serum medium, liposome reagent, biological seed source를 혼합하여 transduction complexes를 제조합니다. 그 다음, 각 바이오센서 well의 벽면을 따라 20 µL의 transduction complex를 조심스럽게 피펫팅하여 넣고, 수확 전까지 처리된 세포를 배양기에 넣어 24~48시간 동안 추가로 배양합니다.

처리되지 않은 세포는 확산된 형광만을 나타냅니다. 그러나 tau seed 물질을 처리한 세포는 밝은 응집체를 나타냅니다. 1~2일 후 세포를 수확하기 위해, 세포 배양액을 50 µL의 trypsin EDTA로 교체하여 반응을 중단시킵니다. 냉각된 배양액 150 µL로 5분간 처리한 후, 세포를 즉시 96-well round bottom plate로 옮겨 세포를 펠렛화하고, 펠렛이 흐트러지지 않게 상층액을 흡입하여 제거한 다음, 2% paraformaldehyde 50 µL에 세포를 부드럽지만 철저하게 재현탁하여 10분간 방치합니다.

그런 다음 세포를 다시 원심 분리하고, 가능한 한 빨리 냉각된 유세포 분석 버퍼 200 µL에 펠릿을 재부유합니다. 고정 후, 플레이트를 fret 호환 유세포 분석기에 로드하고 변이 플롯에 따라 side scatter area 대 forward scatter area 그래프를 생성합니다. 다음으로, 셀 라인 1을 실행하면서 세포군이 왼쪽 하단 사분면에 위치할 때까지 side scatter 및 forward scatter 전압을 조정합니다.

그 다음 다각형 도구를 사용하여 세포 집단을 P1 게이트로 정의합니다. 이제 전방 산란광 높이(forward scatter height) 대 전방 산란광 면적(forward scatter area)의 이변량 플롯(bivariant plot)을 만들고 P1 게이트를 적용합니다. 다음으로 단일 세포를 P2 게이트로 정의하고 각각 하나의 히스토그램을 생성합니다.

C-F-P-Y-F-P 및 fret 필터의 경우, 보정을 위해 C-F-P-Y-F-P 및 fret 필터 각각에 대해 두 세 개의 서로 다른 히스토그램에 게이트 P를 적용하십시오. 셀 라인 1 현탁액 30 µL를 셀 라인 2 현탁액 200 µL에 첨가합니다. 그런 다음 기기 설정 아이콘을 클릭하고 보정 탭을 선택한 뒤, 매트릭스를 체크하여 보정 표를 엽니다.

fret 영역 대 CFP 영역의 변량 플롯(variate plot)을 생성하고 게이트 P2를 적용합니다. 그런 다음 세포주 1과 세포주 2를 실행한 상태에서 쿼드런트 아이콘을 클릭하고, 형광 음성 및 양성 집단이 하단 두 쿼드런트에 의해 분리되도록 쿼드런트를 그립니다. 이제 LL3 및 LR3 게이트의 fret 중앙 형광 강도(MFI)를 표시하는 통계 표를 생성하고, LL3와 LR3 간의 fret 신호 MFI가 거의 동일해질 때까지 보정 매트릭스에서 fret 파라미터를 조정합니다.

다음으로, 사분면이 표시된 변수 플롯을 통해 YFP 면적 대비 CFP 면적 그래프를 생성합니다. 각 사분면 사이에서 YFP 신호의 MFI가 거의 동일해질 때까지 보정 행렬(compensation matrix)의 YFP 파라미터를 조정합니다. 이는 이전에 FRET 유세포 분석(FRET flow cytometry)에 대해 설명한 것과 유사한 과정입니다.

주요 형광 스필오버(spillover)는 CFP가 FRET 검출 채널로 방출될 때 발생하며, 이는 단일 색상 양성 대조군 세포를 이용한 형광 보정을 통해 교정할 수 있습니다. 모든 게이트 설정과 CFP 신호 보정이 완료되면, 분석하고자 하는 웰을 선택하고 플레이트의 나머지 부분을 실행하여 데이터를 분석합니다. 먼저, 유세포 분석 설정 시와 동일한 파라미터를 사용하여 세포 및 단일 세포를 정의합니다.

다음으로, 세포주 3을 사용하여 YFP 단일 양성 세포를 fret 대 YFP 변이 도표로 플롯합니다. YFP 스필오버가 fret 필터로 유입되는 것을 배제하기 위해, fret 양성 세포군으로 이어지는 기울기를 따라 그리고 그로부터 멀어지도록 다각형 게이트를 그려 가짜 fret 게이트(false fret gait)를 정의합니다. 모든 샘플에 가짜 fret 게이트를 적용한 후, 빈 리포좀 처리된 C-F-P-Y-F-P 세포를 fret 대 CFP 변이 도표로 플롯하고, 세포군의 기울기를 따라 위쪽과 왼쪽으로 세포군에서 멀어지도록 확장되는 다각형 게이트를 설정합니다.

이 게이트로 이동하는 모든 이벤트는 FRET 양성으로 간주되며, 세포의 백분율은 처리 시 사용된 시드 타이터(seed titer)와 상관관계를 갖게 됩니다. 마지막으로, FRET 양성 백분율과 FRET 양성 세포의 중앙값 형광 강도(MFI)를 포함하여 관심 있는 분석 파라미터를 기록합니다. 그런 다음 양성 백분율과 MFI의 곱을 측정하여 통합 FRET 밀도를 수동으로 계산합니다.

tau 응집체 또는 시드가 없는 상태에서 tau는 일관된 확산형 및 fret 음성 형광 신호로 나타나는 것과 같이 가용성 단량체 상태로 유지됩니다. 바이오센서 세포에 tau 시드를 도입하면 내인성 tau가 응집된 fret 양성 상태로 전환되어 fret 정량이 가능해집니다. 유세포 분석을 통해 재조합 tau의 펨토몰 농도로도 검출이 충분함을 확인했습니다.

다양한 연령대에서 희생된 타우병증(tauopathy) 마우스의 뇌줄기 조직은 1.5개월령의 어린 개체부터 동물 간에 일관된 시딩 활성(seeding activity) 검출을 보여주는 대표적인 뇌 영역으로 활용됩니다. 본 실험에서 알츠하이머병 환자의 뇌 균질액은 강력한 시딩 활성을 나타낸 반면, 연령이 일치하는 대조군 및 헌팅턴병 환자의 샘플에서는 이러한 활성이 나타나지 않아 타우 응집체에 대한 분석 특이성이 입증되었습니다. 타우 CFP 및 타우 YFP 렌티바이러스 구조체가 도입된 처리 전 일차 신경세포 배양물은 재조합 타우 시드 처리 시 확산된 형광 신호를 나타냈습니다.

하지만, 내인성 tau는 리포좀 매개 형질전환이 없는 상태에서도 fret 유세포 분석법으로 검출 가능한 거대 응집체를 형성합니다. 헤파린과 같이 tau 섭취를 억제하는 약물로 시드 소스를 사전 배양하고 리포좀 없이 처리하면, 재조합 fis 및 tau병증 마우스 뇌 샘플 모두에 포함된 시딩 활성을 차단할 수 있습니다. 숙달되면.

이 기술은 3일 동안 완료할 수 있으며, 매일 1~2시간의 실험대 작업만 필요합니다. 이 절차를 시도할 때, 특정 단계에서는 자체적인 최적화가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 다양한 생물학적 기원의 프로토파틱 시드(protio pathic seeds)로부터 유효 역가를 결정할 때가 이에 해당합니다.

이 영상을 시청한 후에는 재조합 및 생물학적 소스에서 유래한 단백질 병적 시딩 활성을 검출하기 위한 FRET 유세포 분석 실험의 설정, 수행 및 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.