FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

이 절차의 전반적인 목표는 재조합 또는 생물학적 소스에서 protio pathic seeding 활성을 검출하여 단백질, 응집체 및 샘플의 민감한 검출을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 질병의 동물 모델에 대한 치료적 개입에 따른 파종 활성의 변화를 어떻게 정량적으로 평가할 수 있습니까?

이 기술의 장점은 낮은 수준의 단백질 응집체에 대한 높은 특이성을 포함합니다. 절묘한 특이성, 사용 용이성 및 높은 처리량. 오늘 이 절차를 시연하는 사람은 저와 공동 저자인 Brandon Holmes가 맡게 될 것입니다.

생물학적 종자 물질을 준비하려면 일회용 유청 보트에서 냉동 뇌 조직의 무게를 측정하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 조직을 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음 냉간 균질화 완충액을 추가하여 최종 용액이 10%가 부피를 기다리고 샘플을 얼음 위의 냉장실로 옮기도록 합니다. 그런 다음 프로브 표시기를 적절한 설정으로 조정하고 프로브 바닥을 옆으로 헹굽니다.

따라서 표시기 팁이 표시된 대로 세 번 표시되어 각 용액 사이의 프로브를 닦아냅니다. 프로브가 준비되면 팁을 한 샘플의 균질화 버퍼에 담그고 총 25개의 펄스를 전달하는 초음파 처리를 시작합니다. 조직이 완전히 현탁액에 들어가면 균질산염을 스핀다운하고 supinate를 깨끗한 튜브로 옮깁니다.

미각을 방해하지 않도록 주의하세요. 수많은 다른 균질화 기술을 사용할 수 있지만, 보호 관찰은 생물학적 표본에서 소량의 protio pathic 종자를 분리하는 데 우수합니다. 기계적 해리는 조직의 일관되고 효율적인 분해와 후속 종자 추출을 가능하게 합니다.

그런 다음 앙와위를 분취하고 용해물을 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오. 멸균 상태에서 바이오센서 세포를 재생하려면 각 세포주를 따뜻한 PBS로 헹구고 트립신 EDTA로 3분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 따뜻한 배양 배지로 반응을 중단하고 즉시 세포를 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

세포를 원심 분리하여 펠릿을 신선한 배지에 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 세고 배지 13 밀리리터 당 3, 500, 000 세포의 마스터 믹스 세포 희석을 만듭니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 130 마이크로 리터의 세포를 평평한 바닥 조직 배양 처리 96 웰 플레이트의 각 웰로 천천히 옮기고 플레이트 바닥에 닿지 않고 웰 중앙에 피펫 팁을 배치하도록 주의합니다.

세포가 플레이트되면 실온에서 10분 동안 방해받지 않고 정착시킨 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 상대 습도 80% 이상에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 바이오센서 세포가 60-65% confluent가 되면 환원된 혈청, 배지, 리포좀 시약, 생물학적 종자 소스를 결합하여 형질도입 복합체를 만듭니다. 그런 다음 20마이크로리터의 형질도입 복합체를 각 개별 바이오센서 웰 측면으로 gly 피펫팅하고 처리된 세포를 수확하기 전에 24-48시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.

처리되지 않은 세포는 확산 형광만 나타냅니다. 그러나 타우 종자 물질로 처리된 세포는 세포를 수확하기 위해 1-2일 후에 세포 배양 배지를 50마이크로리터의 tryin EDTA로 교체하여 반응을 중단합니다. 150 마이크로 리터의 냉각 배양으로 5 분 후, 매체, 즉시 세포를 96 웰 라운드 바닥 플레이트로 옮기고 세포를 펠릿화하고 펠릿을 숙인하고 펠릿을 방해하지 않고 S 상등액을 흡입 한 다음 부드럽게 그러나 완전히 소생시키고 10 분 동안 2 % 파라 알데히드 50 마이크로 리터에 세포를 현탁시킵니다.

그런 다음 세포를 다시 스핀다운하고 가능한 한 빨리 200마이크로리터의 냉각된 유세포 분석 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 고정 후 플레이트를 fret 호환 유세포 분석기에 로드하고 변형 플롯에 의해 side scatter area versus forward scatter area를 생성합니다. 다음으로, cell line one이 실행 중인 상태에서 세포 집단이 왼쪽 하단 사분면에 올 때까지 측면 산란 및 순방향 산란 전압을 조정합니다.

그런 다음 polygon 도구를 사용하여 세포 집단을 보행 P 1로 정의합니다. 이제 변형 플롯을 통해 전방 산포 높이 대 전방 산포 영역을 만들고 P one 게이트를 적용합니다. 다음으로, 단일 셀을 보행 P 2로 정의하고 각각 하나의 히스토그램을 생성합니다.

C-F-P-Y-F-P 및 프렛 필터의 경우 게이트 P를 2-3개의 서로 다른 히스토그램(C-F-P-Y-F-P 및 프렛 필터에 각각 하나씩)으로 보정하여 적용합니다. 30 마이크로 리터의 세포주 1 현탁액을 200 마이크로 리터의 세포주 2 현탁액으로 스파이크합니다. 그런 다음 기기 설정 아이콘, 보정 탭, check matrix를 차례로 클릭하여 보정 테이블을 엽니다.

변량 플롯을 통해 CFP 면적에 대한 프렛 영역을 생성하고 게이트 P 2를 적용합니다. 그런 다음 cell line 1과 cell line 2가 실행 중인 상태에서 사분면 아이콘을 클릭하고 형광 음성 및 양성 모집단이 아래쪽 두 사분면으로 분리되도록 사분면을 그립니다. 이제 LL 3 및 LR 3 게이트에 대한 프렛의 중앙값 형광 강도 또는 MFI를 표시하는 통계 테이블을 만들고 프렛 신호의 MFI가 LL 3과 LR 3 사이에서 거의 같아질 때까지 보상 매트릭스에서 프렛 매개변수를 조정합니다.

다음으로, 사분면이 있는 변량 플롯으로 YFP 영역 대 CFP 영역을 만듭니다. YFP 신호의 MFI가 사분면 간에 거의 같아질 때까지 보상 행렬에서 YFP 파라미터를 조정합니다. 이전에 보여진 것과 유사합니다.

1차 형광 스필오버는 프렛 검출 채널로 방출되는 CFP에서 발생하며, 이는 모든 게이트가 설정되고 CFP 신호가 보상된 경우 단색 포지티브 대조군 셀을 사용하여 형광 보상을 통해 보정할 수 있습니다. 관심 있는 well을 강조 표시하고 플레이트의 나머지 부분을 실행하여 데이터를 분석합니다. 먼저, 흐름 분석을 설정하는 것과 동일한 매개변수를 사용하여 셀과 단일 셀을 정의합니다.

다음으로, cell line three를 사용하여 YFP 단일 양성 세포를 변이 플롯에 의한 프렛 대 YFP 플롯으로 플롯합니다. 프렛 포지티브 세포 집단의 경사면을 따라 멀어지는 다각형 게이트를 그려 프렛 필터로의 YFP 스필오버를 제외하는 잘못된 프렛 보행을 정의합니다. 모든 샘플에 잘못된 무서워 보행을 적용한 후, 빈 리포좀 처리된 C-F-P-Y-F-P 세포를 변량 플롯에 의해 프렛 대 CFP에 플롯하고 모집단에서 위쪽 및 왼쪽으로 확장되는 개체군의 기울기를 따라 다각형 ga를 도입합니다.

이 게이트로 이동하는 모든 이벤트는 프렛 양성으로 간주되며 세포의 비율은 치료 중에 사용된 종자 역가와 상관관계가 있습니다. 마지막으로, fret 양성 비율 및 fret 양성 세포의 형광 강도 중앙값을 포함하여 관심 있는 분석 매개변수를 기록합니다. 그런 다음 양성률과 MFI의 곱을 측정하여 통합 프렛 밀도를 수동으로 계산합니다.

타우 응집체 또는 씨앗이 없는 경우, 타우는 일관된 확산 및 프렛 음성 형광 신호로 표시되는 가용성 단량체 상태로 유지됩니다. 타우 시드(tau seed)가 바이오센서 세포에 도입된 후, 내인성 타우는 응집된 프렛 양성 상태의 프렛 정량화로 변환됩니다. 다음 유세포 분석 분석을 통해 재조합 타우의 펨토 몰 농도가 검출에 충분하다는 것을 확인할 수 있습니다. 여기.

서로 다른 나이에 희생된 타우오병증 마우스의 뇌간 조직은 대표적인 뇌 영역 역할을 하여 생후 1.5개월부터 동물 전체의 파종 활동을 일관되게 감지하는 것을 보여줍니다. 이 실험에서, 알츠하이머병 피험자로부터 균질한 뇌는 강력한 파종 활성을 보인 반면, 연령은 대조군과 일치했고 헌팅턴병 피험자는 타우, CFP 및 타우로 형질도입된 처리되지 않은 1차 신경 세포 배양물을 타우 응집체에 대한 분석 특이성을 입증하지 못했습니다. YFP 렌티바이러스 구조체는 재조합 타우 시드로 처리했을 때 확산 형광 신호를 나타냈습니다.

그러나 내인성 타우(endogenous tau)는 리포좀 매개 형질도입(transduction)이 없는 경우에도 프렛 유세포 분석(fret flow cytometry)으로 검출할 수 있는 큰 응집체를 형성합니다. 헤파린과 같은 타우 흡수를 억제하는 약물로 종자 공급원을 사전 배양하고 리포좀이 없는 상태에서 처리하면 재조합 fis 및 타우병증 마우스 뇌 샘플에 포함된 파종 활성을 차단할 수 있습니다. 일단 마스터하면.

이 기술은 3일 만에 완료할 수 있으며 매일 1-2시간의 벤치 작업만 하면 됩니다. 이 절차를 시도할 때 특정 단계에 대해 사내 최적화가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 다양한 생물학적 공급원의 protio pathic seed에서 효과적인 역가를 결정할 때.

이 비디오를 시청한 후에는 재조합 및 생물학적 소스에서 protio pathic seeding 활성을 검출하기 위해 fret 유세포 분석 실험을 설정, 실행 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.