마우스 뇌 혈관의 정화

본 절차의 전체적인 목표는 특정 항체나 형질전환 계통 없이 일련의 저속 원심분리와 여과 과정을 통해 구조적 무결성을 유지하면서 마우스 뇌의 혈관 구획을 정제하는 것입니다. 혈액-뇌 장벽에 대한 세포적, 분자적 및 약리학적 조사를 가능하게 하는 기술을 개발하기 위해 많은 노력이 이루어져 왔습니다. 분리, 구배, 컬럼 또는 고속 원심분리 단계가 필요하지 않기 때문에, 본 절차를 통한 뇌 혈관 정제는 매우 쉽고 빠르며 비용 효율적입니다.

뇌 혈관은 tight junction에 의해 밀폐된 내피 세포, 이를 둘러싸고 있는 기저층, 혈관 평활근 세포 및 혈관주위 성상교세포 막이 유지되어 구조적으로 온전한 상태로 보존됩니다. 이 프로토콜은 뇌혈관 장벽(BBB) 혈관 구획의 기능에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 주며, 분자 조성 연구를 가능하게 합니다. 본 절차는 Martin Coen S 팀의 박사후 연구원에 의해 시연됩니다. 절차를 시작하기 전, 필터 홀더의 상단 나사 부분 하단을 절단하십시오.

그 다음 메스를 사용하여 마우스의 목부터 코까지 피부를 절개하고 피부를 뒤로 젖힙니다. PBS로 두개골을 세척하여 오염된 털을 제거한 후, 후각구 전방의 두개골에 가위를 삽입합니다. 가위를 벌려 두개골을 여러 조각으로 파쇄하고 스패튤라를 사용하여 뇌를 제거합니다.

다음으로, 측뇌실에서 맥락총을 절제하고 뇌 조직을 얼음 위에 놓인 20 mL의 B one solution이 담긴 150 mL 비커로 옮깁니다. 그런 다음 두 개의 메스를 사용하여 뇌 조직을 2 mm 크기의 조각으로 강하게 다지고, 자동 다운 호모게나이저(automated down homogenizer)를 사용하여 얼음 위에서 400 RPM으로 20회 스트로크 하여 조직을 균질화합니다. 혈관을 정제하기 위해 균질액을 50 mL 플라스틱 튜브로 옮기고 조직 슬러리를 원심분리합니다.

스윙 로터 원심분리기를 사용하면, 주로 마이엘린(myelin)으로 구성된 커다란 흰색 계면이 용기 펠릿 상단에 형성됩니다. 상층액을 버리고 20 milliliters의 차가운 B two 용액을 넣은 후, 튜브를 1분 동안 강하게 흔들어 줍니다. 두 번째 원심분리를 거치면, 마이엘린이 상층액 표면에 조밀한 흰색 층을 형성하게 됩니다.

튜브를 천천히 회전시켜 B two 용액이 벽면을 따라 흘러내리게 하여 붓고, 미엘린이 포함된 상층액을 제거합니다. 그 후 흡수지에 감싼 플라스틱 피펫을 사용하여 튜브 벽면에 남은 잔류 액체를 제거합니다. 침전물이 닿지 않도록 주의하며 튜브를 뒤집어 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 펠릿을 1 mL의 차가운 B three solution에 현탁시킨 후, 소포(vessel)가 응집되지 않도록 주의하며 B three solution 5 mL를 추가로 첨가합니다. 이제 비커 플라스크 위에 20 µm 나일론 메쉬 필터를 올리고, 차가운 B three solution 10 mL로 필터를 평형화합니다. 준비된 소포 현탁액을 필터 위에 붓고, 차가운 B three solution 40 mL를 추가로 사용하여 소포를 조심스럽게 헹굽니다.

그런 다음 깨끗한 핀셋을 사용하여 필터를 30 milliliters의 신선한 B three solution이 담긴 비커로 즉시 옮기고, 부드럽게 흔들어 필터에서 용기를 분리합니다. 비커의 내용물을 50 milliliter 플라스틱 튜브에 붓습니다. 그 후 원심분리를 거쳐, 면역 염색 전 펠릿을 1 milliliter의 얼음처럼 차가운 B three solution에 다시 현탁합니다.

혈관을 0.2 milliliter PCR 튜브로 옮기고, 튜브 바닥에 조직 침전물이 생길 때까지 얼음 위에 둡니다. 그 다음, 젤 로딩 팁을 사용하여 액체의 대부분을 흡입하여 제거합니다. 이어서, Siliconized 40 micrometer 유리 모세관을 P 200 피펫 팁에 삽입하고, 이 모세관을 사용하여 혈관을 유리 슬라이드로 옮깁니다. 혈관이 안착되면 흡수지 조각을 사용하여 액체를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 용기 위에 봉입제 한 방울을 떨어뜨리고 커버슬립을 45도 각도로 기울여 덮으며, 커버슬립이 완전히 고정될 때까지 봉입제가 유리 가장자리를 따라 퍼지게 합니다. 이 이미지에서는 신경 혈관 내피 세포 주변으로 RIN 라벨링이 연속적으로 관찰되어, 정제된 혈관에 기저판이 유지되었음을 확인할 수 있습니다. ZO one과 같은 내피 밀착 연접 구성 성분 또한 정제된 혈관에서 검출됩니다.

또한, NG two 및 smooth muscle actin 라벨링은 각각 손상되지 않은 기생충과 혈관 평활근 세포의 보존을 나타냅니다. 혈관 주변 성상교세포 막 단백질인 connection 43 및 Aquaporin four 또한 정제된 혈관 표면에서 검출되어, 정제 과정 동안 혈관 주변 성상교세포 막이 추가로 보존되었음을 보여줍니다. 그러나 분리된 혈관에서는 분산된 짧은 GFAP 양성 섬유만 관찰되어 성상교세포 세포체는 함께 정제되지 않았음을 알 수 있습니다. 극소수의 신경 섬유만이 혈관에 부착된 상태로 남아 있습니다.

마찬가지로, IBA one 및 oli two 양성 세포 또한 검출되지 않아 미세아교세포와 희소돌기아교세포가 함께 정제되지 않았음을 확인하였습니다. 뇌 조직의 균질화 전에 현재의 신경총(plexus)을 제거할 것을 강력히 권장하는데, 이는 해당 부위가 오염원이 될 가능성이 있음을 경험했기 때문이며, 청결한 구역에서 작업하고 머리카락 및 먼지 오염을 피해야 합니다. 항체는 이러한 물질들에 대해 높은 비특이적 친화력을 갖기 때문입니다.

또한 항상 핵 염색을 함께 수행하는 것이 중요합니다. 혈관 추출 전에 PBS로 심장 내 관류를 수행함으로써 정제된 혈관에서 혈구 세포를 제거할 수 있습니다. 저희는 신선하게 준비되었거나 냉동된 혈관 펠렛 모두에서 이 절차로 정제된 혈관으로부터 RNA와 단백질을 성공적으로 추출하였습니다.

또한 형광 프로브와 공초점 현미경을 사용하여 혈관의 ex vivo 내피 운반 기능을 연구하였습니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.