Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

다음 실험의 전반적인 목표는 통제된 실험 조건에서 쥐 메센터리에서 Ular 미세혈관 벽의 수압 전도도 또는 투수성을 반복적으로 측정할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 내강에서의 종양 및 정수압을 설정하고 풍부한 8 및 Suse 8의 화학 조성을 정밀하게 제어할 수 있도록 ular micro vessels를 캐뉼레이션함으로써 달성됩니다. 다음으로, 혈관을 폐색하고 PERFUSE 8에 매달린 적혈구는 흐름 마커 역할을 하며 트랜스 혈관 유체 교환의 지표로서 내강에서 움직이는 것을 관찰할 수 있습니다.

그런 다음 마커 적혈구의 위치와 속도는 폐색 부위를 향하거나 폐색 부위에서 멀어지도록 기록됩니다. 마지막으로, 폐색이 해제되고 추가 측정을 위해 반복되거나 혈관이 rec됩니다. 캐뉼러 및 측정은 변경된 조건에서 반복됩니다.

궁극적으로, 제어 및 테스트 조건 하에서 유압 전도도의 쌍을 이루어 측정하여 마이크로 용기를 조절하는 요인을 가장 직접적으로 조사할 수 있습니다. 침투성. 모세관 투과성의 조절을 조사하기 위한 변형된 landis 기법의 장점은 관류 단계입니다. 마이크로 관류를 사용하면 PERFUSE 8 구성, 교환 표면적 및 미세혈관 압력이 모두 직접 제어되는 조건에서 마이크로 혈관 벽의 투과성을 측정할 수 있습니다.

이 방법은 온전한 장기를 대표하는 미세 혈관에서 투과성 조절의 세포 및 분자 메커니즘에 관한 질문을 해결할 수 있으며, 분자 메커니즘의 세부 사항을 조사하는 데 자주 사용되는 배양된 내피 단층의 결과와 비교할 수 있습니다. 우리의 프로토콜을 시연하는 것은 실험실 관리자인 Joyce Clark입니다. Joyce는 연구소 관리자로 근무하는 동안 이 프로토콜의 많은 개선을 담당했습니다.

시작하려면 전자 풀러를 사용하여 여러 개의 깨끗한 보로 실리케이트 유리 모세관 튜브를 테이퍼 반으로 형성하며, 각 튜브는 공기 구동 연삭 휠과 물에 적신 0.5 미크론 연마지 및 수평 베벨에서 30도 각도로 설정된 마이크로 피펫 홀더를 사용하여 약 1cm 팁 길이를 갖습니다. 마이크로 피펫. 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 피펫을 세척 및 건조한 후 길이가 약 50미크론이고 베벨 길이 대 너비 비율이 3.1에서 3.5 사이인 마이크로 피펫을 선택합니다. 또한 날카롭게 가늘어지는 끝이 있어야 장간막의 거친 콜라겐 섬유를 관통하는 데 도움이 됩니다.

억제기를 만들려면 비스듬하지 않은 당겨진 유리 모세관을 마이크로 화염 근처에 잠시 잡고 뭉툭한 끝을 형성합니다. 반복하여 여러 개의 구속기를 만들고 먼지가 없는 상자에 보관하십시오. 그런 다음 미세 화염 아래에서 비스듬히 비스듬히 비스듬히 당겨진 모세관 튜브를 잡고 튜브 어댑터 또는 깨진 마이크로 피펫을 사용하여 팁에서 튜브를 120도에 가까운 각도로 약 4mm 부드럽게 구부려 미세 폐색을 만듭니다.

샤프트와 관련하여 팁이 화염에 밀봉되거나 파손되지 않는 것이 중요합니다. 쥐를 마취하고 텍스트 프로토콜에 따라 중성 조직과 장을 배열한 후 동물 트레이를 현미경 스테이지에 배치하여 안구를 통해 중핵이 보이도록 합니다. 포유류 링거 용액의 중력 공급 드립 라인을 지속적으로 슈퍼 퓨즈에 배치합니다.

그런 다음 거즈 패드를 사용하여 장을 제자리에 고정하고, 수분을 유지하고, 표면에서 과도한 링거를 wicker하고, 흐름을 조정하고, 폐수를 흡인하여 suse eight의 일정한 층을 유지하고, 수렴 흐름의 하류에 분지되지 않은 세그먼트와 실제 모세혈관 원위에있는 하나 또는 두 개의 분기 인 대상 flar microvessels를 식별합니다. 혈류가 활발하고 혈관 벽에 붙어 있는 흰색 세포가 없는 분지되지 않은 혈관을 찾으십시오. 소유하다. 테스트 마이크로 용기를 현미경 필드의 중앙에 배치하고 선택한 캐뉼레이션 부위 근처의 위치로 억제기를 이동합니다.

마이크로 피펫을 채우려면 퍼퓨즈 8을 추출하고 적혈구를 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 주사기로 세척하고 튜브에 기포가 없는지 확인하십시오. 테이퍼 영역에 접할 때까지 튜브를 마이크로 피펫의 큰 쪽 끝으로 전진시킵니다. 주사기 플런저를 부드럽게 빠르게 밀어 마이크로 피펫 팁을 채웁니다.

가득 차면 팁에 작은 물방울이나 물방울이 나타납니다. 튜브를 빼내는 동안 플런저를 부드럽게 밀어 마이크로 피펫 샤프트를 채웁니다. 그런 다음 샤프트의 작은 기포를 부드럽게 튕겨 제거합니다.

그런 다음 마이크로 피펫을 측면 포트가 있는 피펫 홀더에 넣어 수압계에 유체를 지속적으로 연결할 수 있습니다. 유압 드라이브 및 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 홀더가 마이크로 피펫 테이퍼의 가장자리가 장이나 트레이에 닿지 않도록 약간의 수평 각도로 설정되어 있는지 확인하십시오. 주사기 또는 물이 채워진 고무 전구를 사용하여 압력계의 물기둥에있는 유체의 높이를 장간막 위의 약 40cm로 변경하여 마이크로 피펫의 유체에 적용되는 정수압을 조정합니다.

채워진 마이크로 피펫을 현미경 아래에 배치하기 전에 조직을 잡을 수 있을 만큼 충분한 힘을 가하여 마이크로 혈관 근처의 조직에 구속기를 부드럽게 누르고, 억제기를 약간 뒤로 당겨 미세 혈관과 일직선으로 조직을 늘려 장간막 콜라겐 섬유의 응력이 혈관과 정렬되도록 합니다. 마이크로 피펫을 용기에 맞추고 접안렌즈를 통해 볼 수 있도록 내립니다. 선택한 캐뉼레이션 부위의 바로 상류에 팁을 놓고 조직 위로 내려 혈관 내부의 흐름을 부분적으로 방해하지만 막지는 않도록 합니다.

유압 드라이브를 사용하여 피펫 팁을 용기 내강으로 천천히 밀어 넣어 용기를 캐뉼레이트하고 용기의 반대쪽을 통해 팁을 밀지 않도록 주의하십시오. 마이크로 피펫이 내강으로 들어가면 퍼퓨즈 8은 혈관 내강에서 혈액을 빠르게 씻어내어 순환계로 들어갑니다. 적혈구가 혈관 내강에서 부드럽게 진동할 때까지 압력계를 조정하여 관류 압력을 낮춥니다.

이것은 마이크로 혈관 세그먼트의 말단에서 정수압 마이크로 용기 압력 또는 PC를 측정하는 균형 압력을 결정합니다. 이 균형 압력 이상으로 혈관 관류를 유지하여 마이크로 폐색을 수행합니다. 비디오와 오디오를 사용하여 현미경 필드의 아래쪽 가장자리 근처에 있는 관류된 혈관 위에 차단제를 놓습니다.

I piece red에서 볼 수 있듯이 블록 사이트의 위치를 구두로 기록합니다. 블록 사이트는 57이며 차단제의 끝이 마이크로 용기 바로 위에 배치됩니다. 마이크로 매니퓰레이터의 미세 Z 컨트롤을 사용하여 용기의 흐름이 막힐 때까지 차단기를 부드럽게 내립니다.

오디오를 사용하여 압력계 압력을 기록하십시오. 압력은 50입니다. 그런 다음 3초에서 10초 동안 오클루전을 적용하고 놓습니다.

자유 관류를 복원하려면 블록 부위를 5-10미크론 단계로 피펫 팁 쪽으로 혈관 위로 이동시키고, 각 위치에서 3-5회 이하의 폐색을 수행하여 블록 부위의 혈관 벽 손상을 방지합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 이 시간 과정은 수압 전도도의 변화를 측정하거나 4개의 관류 8로 성공적으로 캐뉼레이션된 쥐 모양의 마이크로 용기를 LP.In 측정합니다.

일정한 압력에서 LP의 크기는 마이크로 용기의 변화를 측정하는 데 사용되었습니다. 1%BSA를 대조군으로 관류했을 때의 벽 투과성 대 염증제인 Brady Kinin 또는 bk의 10몰 대구치. 여기에서 볼 수 있듯이 BK는 10-15분 이내에 제어 수준으로 복귀한 LP의 일시적인 증가를 일으켰습니다.

1%BSA 10 나노몰로 기준선 수준을 재설정한 후. BK는 1 마이크로 몰 pH 장면, 1 인산염 또는 S 1 P와 함께 재관류되었으며, 결과는 S 1 P가 bk에 대한 반응을 현저하게 약화시켰다는 것을 나타냅니다. 일부 실험 설계의 경우 거대분자와 lp에 대한 용질 반사 계수를 모두 추정하는 것이 중요합니다.

이는 각 개별 마이크로 용기의 여러 압력에서 JV를 측정하여 가장 잘 수행됩니다. 이 실험은 미세 혈관을 둘러싼 조직에 알부민이 없을 때 PERFUSE 8에서 LP와 5% 알부민의 유효 발암압을 모두 추정했습니다. S에 대한 JV는 세 가지 다른 압력에서 측정되고 플롯되었습니다. 여기.

LP는 S에 대한 JV와 압력 사이의 관계의 기울기이고, 압력 축의 절편은 용기 벽을 가로지르는 유효 종양 압력 차이입니다. 면역형광 표지 및 컨포칼 현미경 또는 투과 전자 현미경과 같은 다른 기술과 결합하면 micro profusion은 알려진 투과성의 혈관을 사용하여 미세혈관 내피 및 기능에 대한 강력한 분석을 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 통제된 실험 조건에서 쥐 중간보류에 있는 미세혈관의 수압 전도도 또는 투수성을 반복적으로 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

현재 사용 가능한 쥐 모델에서도 이 접근 방식을 사용할 수 있지만, 저는 CRISPR Cas nine 기술로 제공될 새로운 유전자 변형 쥐에 사용할 수 있는 가능성에 특히 관심이 있으며 이러한 방식으로 확장되기를 바랍니다.