Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

다음 실험의 전반적인 목표는 제어된 실험 조건 하에서 쥐 장간막 내 ular 미세혈관 벽의 수압 전도도 또는 수 투과성을 반복적으로 측정할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 ular 미세혈관을 캐뉼라 삽입하여 내강의 삼투압과 정수압을 설정하고, 유입액(profuse eight)과 유출액(Suses eight)의 화학적 조성을 정밀하게 제어함으로써 달성됩니다. 그다음, 혈관을 폐쇄하고 유입액에 현탁된 적혈구를 흐름 표지자로 사용하여, 이것이 내강 내에서 이동하는 것을 관찰함으로써 혈관횡단 유체 교환의 지표로 활용할 수 있습니다.

그다음 마커 적혈구의 위치와 속도를 폐쇄 부위 방향 또는 폐쇄 부위에서 멀어지는 방향으로 기록합니다. 마지막으로, 폐쇄를 해제하고 추가 측정을 위해 이를 반복하거나, 혈관을 다시 캐뉼라 삽관하여 변경된 조건에서 측정을 반복합니다.

최종적으로, 대조군과 실험 조건 하에서 수력 전도도의 쌍 측정(paired measurements)을 수행하여 미세혈관 투과성을 조절하는 요인들을 가장 직접적으로 조사할 수 있습니다. 모세혈관 투과성 조절을 조사하기 위한 수정된 Landis 기법의 장점은 관류 단계에 있습니다. 미세 관류를 통해 관류액의 조성, 교환 표면적 및 미세혈관 압력이 모두 직접적으로 제어되는 조건에서 미세혈관 벽의 투과성을 측정할 수 있습니다.

본 방법은 온전한 장기를 대표하는 미세 혈관의 투과성 조절에 관한 세포 및 분자 기전상의 의문점을 해결할 수 있으며, 분자 기전의 세부 사항을 조사하기 위해 흔히 사용되는 배양된 내피세포 단층의 결과와 비교 분석하는 자료를 제공할 수 있습니다. 저희 프로토콜의 시연을 맡은 분은 실험실 관리자인 Joyce Clark입니다. Joyce는 이곳의 실험실 관리자로 재직하는 동안 본 프로토콜의 많은 개선 사항을 담당해 왔습니다.

시작을 위해, 공압식 연삭 휠과 물에 적신 0.5 micron 연마지, 그리고 수평 베벨로부터 30도 각도로 설정된 마이크로 피펫 홀더를 사용하여 전자 풀러로 여러 개의 깨끗한 붕규산 유리 모세관을 끝부분 길이가 약 1cm인 테이퍼진 절반 형태로 만듭니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 피펫을 세척하고 건조한 후, 개구부 길이가 약 50 microns이며 베벨의 길이 대 너비 비율이 3.1에서 3.5 사이인 마이크로 피펫을 선택합니다. 또한 장간막의 단단한 콜라겐 섬유를 관통하는 데 도움이 되도록 끝부분이 날카롭게 테이퍼져 있어야 합니다.

리스트레이너(restrainer)를 제작하려면, 베벨이 없는 풀드 글라스 모세관의 끝부분을 마이크로 플레임에 짧게 가열하여 뭉툭한 끝을 만듭니다. 이 과정을 반복하여 여러 개의 리스트레이너를 제작하고 먼지가 없는 상자에 보관합니다. 그다음, 베벨이 없는 풀드 모세관 튜브를 마이크로 플레임 아래에서 비스듬히 잡고, 튜브 어댑터나 부러진 마이크로 피펫을 사용하여 팁에서 약 4 mm 떨어진 지점을 120도에 가까운 각도로 조심스럽게 구부려 마이크로 오클루드(micro occlude)를 제작합니다.

샤프트와 관련하여, 팁이 화염에 의해 밀봉되거나 파손되지 않는 것이 중요합니다. 쥐를 마취하고 텍스트 프로토콜에 따라 장간막 조직과 장을 배치한 후, 접안렌즈를 통해 장간막이 보이도록 동물 트레이를 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 포유류 링거액의 중력 급식 드립 라인을 배치하여 지속적으로 관류하십시오.

그 다음 장간막에 거즈 패드를 사용하여 장을 제자리에 고정하고, 수분을 유지하며 표면의 과잉 링거액을 흡수하도록 합니다. 흐름을 조절하고 유출액을 흡인하여 일정한 층의 수액을 유지한 후, 표적 평면 미세혈관을 확인합니다. 이 혈관들은 수렴 흐름의 하류에 위치하며 진성 모세혈관에서 원위부로 한두 번 분지된 분지되지 않은 구간입니다. 혈류가 빠르고 혈관 벽에 백혈구가 부착되지 않은 분지되지 않은 혈관을 찾습니다. 테스트할 미세혈관을 현미경 시야의 중앙에 위치시키고, 선택한 캐뉼라 삽입 부위 근처로 고정 장치를 이동시킵니다.

마이크로 피펫을 채우기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 주사기에 Perfuse Eight 및 세척된 적혈구를 흡입하고, 튜브 내에 기포가 없는지 확인하십시오. 튜브를 마이크로 피펫의 넓은 끝부분으로 밀어 넣어 테이퍼(tapered) 영역에 닿을 때까지 진입시킵니다. 주사기 플런저를 부드럽고 빠르게 밀어 마이크로 피펫 팁을 채웁니다.

액체가 가득 차면 팁 끝에 작은 흐름이나 방울이 나타납니다. 튜빙을 뽑는 동안 플런저를 부드럽게 밀어 마이크로 피펫 샤프트를 채웁니다. 그다음, 샤프트를 가볍게 튕겨 내부의 작은 기포들을 제거합니다.

그런 다음 마이크로 피펫을 수두계와 지속적인 유체 연결이 가능한 사이드 포트가 있는 피펫 홀더에 배치합니다. 유압 드라이브 및 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 홀더가 약간의 수평 각도로 설정되어 마이크로 피펫 테이퍼의 끝부분이 장이나 트레이에 닿지 않도록 합니다. 주사기나 물이 채워진 고무 벌브를 사용하여 수두계 수주 내의 유체 높이를 장간막보다 약 40 centimeters of water 높게 조절함으로써 마이크로 피펫 내 유체에 가해지는 정수압을 조정합니다.

채워진 마이크로 피펫을 현미경 아래에 배치하기 전에, 미세혈관 근처의 조직 위로 리스트레이너를 살짝 눌러 조직을 고정할 수 있을 만큼의 충분한 힘을 가합니다. 그다음 리스트레이너를 약간 뒤로 당겨 미세혈관 방향으로 조직을 늘려줌으로써, 장간막 콜라겐 섬유의 응력이 혈관과 일직선이 되도록 합니다. 마이크로 피펫을 혈관과 일치시킨 후 접안렌즈를 통해 시야 내로 내립니다. 피펫 팁을 선택한 캐뉼라 삽입 부위의 바로 상류에 위치시킨 후, 혈관 내 흐름을 완전히 차단하지 않고 부분적으로만 방해하도록 조직 위로 내립니다.

유압 구동 장치를 사용하여 피펫 팁을 혈관 내강으로 천천히 밀어 넣어 혈관을 캐뉼라화하되, 팁이 혈관 반대편을 뚫고 나가지 않도록 주의하십시오. 마이크로 피펫이 내강으로 진입하면 관류액이 혈관 내강의 혈액을 빠르게 씻어내며 순환계로 들어갑니다. 혈관 내강에서 적혈구가 완만하게 진동할 때까지 마노미터를 조정하여 관류압을 낮추십시오.

이를 통해 미세혈관 분절의 말단부에서 정수압 미세혈관 압력 또는 PC를 측정하는 균형 압력을 결정합니다. 미세 폐색을 수행하려면 혈관 관류를 이 균형 압력 이상으로 유지하십시오. 비디오와 오디오를 사용하여 현미경 시야의 하단 가장자리 근처에서 관류되는 혈관 위에 차단기를 배치하십시오.

I 피스 레드에서 보이는 블록 부위의 위치를 구두로 기록하십시오. 블록 부위는 57입니다. 블로커의 팁을 미세 혈관 바로 위에 위치시킵니다. 마이크로 매니퓰레이터의 미세 Z축 조절 장치를 사용하여 혈관 내 흐름이 차단될 때까지 블로커를 천천히 내리십시오.

오디오를 사용하여 마노미터 압력을 기록하십시오. 압력은 50입니다. 그런 다음 3~10초 동안 폐쇄를 적용한 후 해제하십시오.

자유 관류를 복원하려면, 블록 지점을 피펫 팁 방향으로 혈관을 따라 5~10 micron 단계로 이동시키고, 블록 지점의 혈관벽 손상을 방지하기 위해 각 위치에서 3~5회 이하의 폐쇄를 수행하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 이 시간 경과는 수력 전도도 또는 LP의 변화를 측정합니다. 4-perfuse eights로 성공적으로 캐뉼레이션된 쥐의 ular 미세 혈관에서 수행되었습니다.

일정한 압력에서의 LP 크기를 이용하여 미세혈관의 변화를 측정하였습니다. 대조군으로 1% BSA를 주입했을 때와 염증 유발 물질인 10 molar Brady Kinin(또는 bk)을 주입했을 때의 벽 투과성을 측정하였습니다. 여기서 보시는 바와 같이, BK는 LP의 일시적인 증가를 유발하였으며, 이는 10~15분 이내에 대조군 수준으로 회복되었습니다.

1% BSA 10 nanomolar로 기저 수준을 재설정한 후, 1 micromolar pH scene one phosphate 또는 S one P와 함께 BK를 재관류하였습니다. 결과는 S one P가 bk에 대한 반응을 유의하게 감쇠시켰음을 나타냅니다. 일부 실험 설계에서는 거대 분자의 용질 반사 계수와 lp를 모두 추정하는 것이 중요합니다.

이는 각 개별 미세혈관에서 여러 압력 조건으로 JV를 측정함으로써 가장 잘 수행될 수 있습니다. 이 실험에서는 미세혈관 주변 조직에 알부민이 없는 상태에서 PERFUSE 8의 LP와 5% albumin의 유효 교질삼투압을 모두 추정하였습니다. S 대비 JV를 세 가지 서로 다른 압력에서 측정하여 여기에 그래프로 나타내었습니다.

LP는 S에 대한 JV와 압력 사이 관계의 기울기이며, 압력 축의 절편은 혈관벽을 가로지르는 유효 삼투압 차이입니다. 면역형광 표지 및 공초점 현미경, 또는 투과 전자 현미경과 같은 다른 기술과 결합될 때, 미세 관류는 투과성이 알려진 혈관을 사용하여 미세혈관 내피 및 기능에 대한 강력한 분석을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 제어된 실험 조건 하에서 쥐 장간막 내 세동맥 미세혈관의 수압 전도도 또는 수분 투과도를 반복적으로 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 접근법을 현재 사용 가능한 쥐 모델에 적용할 수 있지만, 저는 특히 CRISPR Cas9 기술을 통해 앞으로 가능해질 새로운 유전자 변형 쥐 모델에 이 방법이 적용될 가능성에 깊은 관심을 가지고 있으며, 앞으로 그렇게 확장되기를 바랍니다.