Name: VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: 배우세요 B세포 림프종의 클론 진화 패턴을 파악하기 위한 VDJ-SEQ 방법입니다. 면역글로불린 중쇄 유전자의 심층 시퀀싱을 통해 림프종 샘플의 클론 구성을 분석하고 재발 종양의 기원과 진화를 이해할 수 있습니다.

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저자는 사려 깊은 토론을 해준 Rita Shaknovich 박사와 Elemento lab, Melnick lab, Tam lab의 구성원들에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 VDJ 염기서열분석을 수행해 주신 Weill Cornell Medical College의 Genomics Resources Core Facility에도 감사드립니다. YJ는 ASH Scholar Award의 지원을 받았습니다. WT 및 OE는 Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant의 지원을 받습니다. OE는 NSF CAREER 상, Starr Cancer Consortium 및 Hirschl Trust의 지원을 받습니다. 또한 이 프로젝트에 대한 관대한 지원에 대해 Katherine Benesch, JD, MPH에게 감사드립니다.

1. VDJ 증폭 종양 샘플에서 1.1) DNA 추출 <ol><li> 냉동 10월 임베디드 정상 또는 악성 조직의 얇은 부분 (10 ~ 20 μm의)에서 DNA를 추출합니다. <ol><li> 테 K와 (0.5 ㎎ / ㎖, 최종 농도 4 ml의 핵산 용해 버퍼 (; 0.3 M의 NaCl 0.002 M 나 2 EDTA 0.0075 M 트리스 염산, pH를 8.2)에 그라 이오 스탯 마이크로톰로 절단 포함 된 조직의 10 ~ 30 얇은 섹션 다이제스트 )와 하룻밤 37 ° C의 물을 욕조에 15 ㎖의 원심 분리 관에 0.625 % SDS. </li><li> 소화 혼합물에 포화 염화나트륨 (5 M)의 1 ML을 추가하고 15 초 동안 격렬하게 흔들어. </li><li> 실온에서 15 분 동안 1,100 XG 원심 분리기. </li><li> 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송하고 100 % 에탄올의 두 볼륨을 추가합니다. </li><li> 튜브에게 6-8 번 반전 섞는다. 4 ° C에서 60 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기는 침전 된 DNA를 수집합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 두 번 DNA 펠렛을 세척 하였다. 하기 Centr15 분 펠렛을 수집 할 때마다 5,000 XG에 ifuge. </li><li> 셰이커 하룻밤에 실온에서 100-400 μL TE 버퍼 DNA를 녹여. DNA 수율은 조직의 크기에 따라 5~200 μg의 (50-500 NG / l 사이의 최종 농도) 인 </li></ol></li><li> 포르말린 고정, 파라핀 포함 (FFPE) 정상 또는 악성 조직의 얇은 부분 (10 ~ 20 μm의)에서 DNA를 추출합니다. <ol><li> 회 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 10 분간 각각의 시간 동안 실온에서 디 paraffinize 크실렌을 1 ㎖의 파라핀 섹션을 인큐베이션. 실온에서 5 분 동안 13,000 XG에서 회전하여 조직 절편을 수집한다. </li><li> 실온에서, 10 분 잔류 크실렌을 제거하는 각각의 시간에 1 회 ml의 100 % 에탄올을 부화 섹션. 실온에서 5 분 동안 13,000 XG에서 회전하여 조직 절편을 수집한다. 파라핀은이 시점에서 완전히 용해시키고, 단지 조직 절편은 남아있다. </li><li> 객실 테에서 섹션을 공기 - 건조10 ~ 15 분 동안 mperature. </li><li> (뉴 클레아없는 물과 10 배 PCR 버퍼에서 희석) 1X PCR 버퍼와 0.5 ㎎ / ㎖ 프로 테 K 솔루션을합니다. 50 ~ 100 μL의 최종 부피에 샘플 테 K 솔루션을 추가하고 밤새 37 ° C를 품어. </li><li> 테 K. 불활 10 분간 95 ℃에서 시료를 가열 주 :이 단계에서, 샘플 DNA는 PCR 버퍼에 용해하고 직접 단계 1.2 및 1.3에서 사용될 수있다. DNA 수율은 조직의 크기에 따라서 0.5 내지 20 μg의 (10-200 NG / l 사이의 최종 농도)이다. </li></ol></li></ol> 1.2) DNA 품질 평가 <ol><li> PCR 튜브에서 상업적 사다리 키트에서의 마스터 믹스를 45 ㎕의 0.25 μL의 Taq DNA 중합 효소를 혼합한다. </li><li> PCR 튜브에 1.1.1.7 또는 1.1.2.5에서 준비 5 μL DNA를 추가하고 최소 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 잘 섞는다. </li><li> 95 ° C의 : DNA를 증폭하기 위해 다음과 같은 조건을 사용하여7 분; 95 ° C, 60 ° C에서 45 초, 72 ℃에서 90 초에서 45 초로 35 회 반복; 다음 10 분 동안 72 ° C와 15 ° C에서 개최. </li><li> TBE (트리스 / 붕산염 / EDTA)에서 2 % 아가 로스 겔을 제조. </li><li> 4 μL 6X 로딩 염료와 함께 20 ㎕의 PCR 반응을 혼합하고, 2 % 아가 로스 겔에 로딩. </li><li> 0.5 μg의 / ㎖에 티듐 브로마이드 용액을 아가로 오스 겔을 겔 염색 및 영상화 시스템으로 PCR 산물을 검출한다. 주 : 100, 200, 300, 400, 및 600 bp의 5의 크기의 PCR 산물을 수득 샘플 VDJ 증폭 물을 생성하는 것을 계속한다. 주의 : 에티 디움 브로마이드 강력한 돌연변이입니다. 보호 기어, 즉 장갑을 착용하여 극도의주의를 처리하고 기관의 지침에 따라 특정 용기에 폐기하십시오. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) 프레임 워크 1 지역에서 증폭 재결합 IGH VDJ 세그먼트 (IgVHFR1) <ol><li> 튜브 라벨에서 45 μL 마스터 믹스 믹스ED 상업적 체세포과 돌연변이 IGH 정량법 젤 검출 용 키트 &quot;믹스 2&quot;의 Taq DNA 폴리머 라제 0.25 μL 및 PCR 튜브에 1.1.1.7 또는 1.1.2.5로부터 제조 5 μL 샘플 DNA 등. </li><li> DNA를 증폭하기 위해 다음과 같은 조건을 사용하여 7 분 95 ° C를, 95 ° C, 60 ° C에서 45 초, 72 ℃에서 90 초에서 45 초로 35 회 반복; 다음 10 분 동안 72 ° C와 15 ° C에서 개최. </li><li> 전기 영동에 의한 2 % 아가 로스 젤에서 전체 PCR 생성물을 해결. </li><li> 0.5 μg의 / ㎖에 티듐 브로마이드 용액을 아가로 오스 겔을 겔 염색 및 이미징 시스템으로 PCR 산물을 검출한다. 앰플 리콘은 모노클 3백10부터 3백80까지 BP의 크기 범위로 예상된다. </li><li> 3백10부터 3백80까지 BP 사이 모노클 앰플 리콘을 포함하는 젤 부분을 절제. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 표준 젤 추출 키트를 사용하여 적출 젤에서 DNA를 정화. 주 : FR1 단편을 얻을 수 있었다 샘플, IGV를 충분히 할 필요가 없다HFR2 및 IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) 프레임 워크 2 지역에서 증폭 재결합 IGH VDJ 세그먼트 (IgVHFR2) <ol><li> PCR 튜브에 1.1.1.7 또는 1.1.2.5로부터 제조 젤 검출 키트 상업적 IGH 유전자 Clonality 분석의 &quot;튜브 B&quot;의 Taq DNA 중합 효소 μL 0.25, 5 μL 샘플 DNA로 표지 된 튜브에서 45 μL 마스터 믹스 믹스 . </li><li> DNA를 증폭하기 위해 다음과 같은 조건을 사용하여 7 분 95 ° C를, 95 ° C, 60 ° C에서 45 초, 72 ℃에서 90 초에서 45 초로 35 회 반복; 다음 10 분 동안 72 ° C와 15 ° C에서 둡니다. </li><li> 전기 영동에 의한 2 % 아가 로스 젤에서 전체 PCR 생성물을 해결. </li><li> 0.5 μg의 / ㎖의에 티듐 브로마이드 염색에 의해 PCR 생성물 (들)을 가시화. 단클론 앰플 리콘은 2백50부터 2백95까지 BP의 크기 범위 내에서 관찰 할 수있다. </li><li> 2백50에서 2백95까지 BP 사이 모노클 앰플 리콘을 포함하는 젤 부분을 절제. </li><li> 표준 젤 추출물을 사용하여 적출 젤에서 DNA를 정화제조 업체의 프로토콜에 따라 이온 키트. </li></ol> 1.4) 최적화 VDJ PCR <ol><li> 7 분, 60 초, 60 초 동안 60 ° C, 95 ° C, 40 사이클, 90 초간 72 ℃에서 최종 연장 95 ℃ : IgVHFR1 및 IgVHFR2가 차선 DNA를 사용하여 증폭 다음 변성 PCR 조건을 사용하여 10 분 동안 72 ℃로. </li></ol> 2. VDJ 앰플 리콘 라이브러리 준비 및 시퀀싱 2.1) 라이브러리 준비 2.1.1) 최종 수리 <ol><li> PCR 튜브에 1.3에서 VDJ PCR 제품을 전송하고 60 μL에 볼륨을 가지고 DNA 샘플 준비 키트 부유 버퍼를 추가합니다. </li><li> DNA 샘플 준비 키트에서 최종 수리 믹스의 40 μl를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 100 ℃에서 예열 된 뚜껑 예열 된 열 순환기 (30 ℃)에서 30 분간 30 ℃에서 반응을 배양한다. </li><li> 136 μL 자석 구슬 24 μl의 PCR G 믹스rade 물은 먼저 1.5 ㎖의 튜브에 다음, 1.5 ㎖의 튜브에 2.1.1.3에서 전체 최종 수리 반응 옮기고 비드 용액과 잘 혼합한다. </li><li> 2 분 동안 자기 스탠드에 배치 튜브 용액으로부터 구슬의 분리를 허용합니다. 뜨는을 대기음, 튜브는 자기 스탠드에있는 동안 두 번 80 % 신선한 준비 EtOH로 구슬을 씻는다. </li><li> 완전히 에탄올 용액을 흡인하고 15 분 동안 실온에서 15 분 동안 공기 건조시킨 비드를 허용한다. </li><li> 17.5 μL 부유 버퍼에 자기 스탠드에 resuspend 구슬 오프 튜브를 타고. </li><li> 다시 재 부유 버퍼에서 별도의 구슬 2 분 동안 자기 스탠드 위에 놓고 튜브. 깨끗한 PCR 튜브에 재현 탁 버퍼 (최종 수리 제품이 현재 재현 탁 완충액된다) 제거한다. </li></ol> 2.1.2) - 미행 <ol><li> 최종 수리 생성물을 함유하는 PCR 튜브에 12.5 μL A-테일링 믹스를 첨가하고 잘 혼합한다. </리&gt; <li> 100 ℃에서 예열 뚜껑 예열 된 열 순환기 (37 ℃)에서 30 분 동안 37 ° C에서 PCR 튜브를 배양한다. </li></ol> 2.1.3) 어댑터 내고 <ol><li> - 미행 반응에 2.5 μL 부유 버퍼, 2.5 μL 내고 믹스, 2.5 μL DNA 어댑터 인덱스를 추가합니다. </li><li> 100 ℃에서 예열 된 뚜껑 예열 된 열 순환기 (30 ° C)에서 30 minl 30 ℃에서 반응을 배양한다. </li><li> 각 반응에 5 μL 정지 내고 버퍼를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 2.1.1.5 2.1.1.8에 단계에 따라 반응을 청소하는 42.5 μL 잘 혼합 된 자석 구슬을 섞는다. 어댑터 결찰 제품을 용출 50 μL 부유 버퍼를 추가합니다. </li><li> 50 μl를 잘 혼합 AMPure XP 비즈를 사용하여 두 번째로 어댑터 라이 게이션 생성물을 청소하고 깨끗한 PCR 튜브에 25 ㎕의 완충액에 재현 탁 생성물을 용리. </li></ol> 2.1.4) 증폭 된 DNA 단편 <ol><li> 어댑터 결찰 제품을 포함하는 PCR 튜브에 5 μL PCR 프라이머 칵테일 25 μL PCR 마스터 믹스를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 다음과 같은 조건으로 미리 프로그램 된 열 순환기에 증폭을 수행 : 30 초 동안 98 ° C; 10 초 동안 98 ° C의 10주기, 30 초, 60 ℃, 30 초, 72 ° C; 다음 5 분 동안 72 ° C와 10 ° C에서 개최. </li><li> 50 μl를 잘 혼합 된 자성 비드를 이용하여 반응을 정리하고, 30 μL에 재현 탁 버퍼 최종 생성물을 용리시킨다. </li></ol> 2.1.5) 라이브러리 확인 <ol><li> 제조사의 프로토콜에 의한 형광으로 최종 생성물을 정량화. 라이브러리 최종 농도는 2.5-20 NG / l 사이이다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 고감도 DNA 칩 분석 기기를 사용하여 최종 제품의 품질을 평가. IGVHFR1, IGVHFR2 또는 IGVHFR3 중 하나에 대한 예상 크기의 단일 밴드를 기대합니다. 너를라이브러리 생성물 xpected 크기 원고 VDJ 증폭 물을 더한 크기의 어댑터 (~ 125 염기쌍)의 크기가 동일하다. </li></ol> 2.2) VDJ-PCR 도서관 풀링 및 시퀀싱 <ol><li> 다음 식을 이용하여 각각의 라이브러리 분획의 몰 농도를 계산한다 nM 내지 = [(NG / 1,000) / BP * 660] NG 단계 2.1.5.1 측정 VDJ-PCR 라이브러리의 농도 인 109을 X 및 혈압 피크 VDJ-PCR 라이브러리의 크기는 단계 2.1.5.2 측정. </li><li> DNase의없는 물 2 nm의 (10 μL 총)에 대한 라이브러리를 희석. </li><li> 함께 1.5 ML 튜브로 희석 2 nM의 라이브러리의 10 μl를 결합합니다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 PhiX의 스파이크에 제어의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> flowcell에 오후 7시 농도에서 풀을 넣습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 한 쌍의 엔드 150 사이클 시퀀서를 사용하여 라이브러리의 시퀀스. </li></ol> 3. 데이터 분석 참고 : 써머을이 절에서 사용되는 생물 정보학 스크립트의 진은 보조 코드 파일로 찾을 수 있습니다. 3.1) 정렬 및 품질 관리 <ol><li> 지도 쌍 엔드 시퀀싱 인간 IGH의 V에 대해 읽기, 2의 격차 열린 처벌, 1의 간격 연장 페널티 NCBI에서 제공 &#39;BLASTN&#39;에 따라 적응 염기 폭발 알고리즘을 사용하여 IMGT 웹 사이트 (11)에서 다운로드 D와 J 지역 데이터베이스, 7의 단어 길이 및 10-4의 전자 임계 값. IGH (V)과 J 영역에 모두 매핑되지 않는 읽기 쌍을 폐기하십시오. </li><li> 모든 샘플에 시퀀싱 실행에서 얻은 쌍을 읽기를 통해 VJ 조합을 일치의 주파수를 얻기 위해 IGH V와 J 매핑이 나머지 읽기 쌍을 계산합니다. 이 IGH의 V 및 J 유전자에 모두 매핑 된 경우 읽기 쌍을 카운트하고 VJ 특정 조합에 대응하는 수의 대립 유전자에 추가. </li><li> 높은에서 3.1.2에서 얻은 각각의 재결합 VDJ 영역의 수를 순위가장 낮은 EST. VDJ 영역은 가장 높은 계수가 큰 재정렬 조합으로서 정의된다 판독 갖는다. </li><li> 3.1.3에서 식별 도메인 주요한 재 배열 35 % 미만을 커버 정렬 순서를 버린다. </li></ol> 3.2) SHM 프로필 확인 <ol><li> 이 단계 3.1.3에서 읽는 걸쳐 모든 SHM 패턴을 계산합니다. 서브 클론 각 SHM 패턴을 정의합니다. </li><li> 다른 고유 SHM 패턴에 대응되는 서브 클론의 수, 및 개별 서브 클론에 매핑되는 읽기 횟수를 카운트. </li></ol> 결과 3.3) 그래픽 표현 <ol><li> 제조사의 프로토콜에 따라 R 패키지 &quot;영장류&quot;에서 접합 방법을 사용하여 이웃 대응 SHM 패턴을 사용하여 서브 클론에 계통 학적 분석을 수행한다. V의 배선 서열에 뿌리 서브 클론의 계통을 다시 각각의 고유 한 정렬으로부터의 거리 행렬을 계산각 쌍 샘플 세트에 대한 질문에 J 조합. </li><li> 문자 벡터로서 각 서브 클론의 염기 서열을 사용하여 두 선형 사이의 거리 (D)의 X, Y에 의해 주어진다 수학적 진단 Levenshtein 거리 측정 값을 이용하여 해당 재발 샘플 모두 주요 VJ 재 배열에서 모든 서브 클론 간의 근사 스트링 거리를 계산 (I, J) (D)의 X, Y (I, J) = 1을 난 J ≠ 0, 그렇지 않으면 다음 서열 i와 j 뉴클레오티드에 대응하는 문자열의 길이를 통해이 기능을 요약하면한다. </li><li> 그래픽으로 다음 두 가지 방법으로 서브 클론 거리 및 해당 서브 클론 카운트의 결과를 표시 매트릭스 : <ol><li> R 패키지를 사용하여 &quot;질량&quot;제조 업체의 프로토콜에 따른 서브 클론 거리 행렬에 다차원 스케일링을 적용하고 두 차원 원칙을 생성하기 위해 다음 로그와 함께 플롯지도, 좌표원의 반지름으로 subclonal 카운트. </li><li> 정점의 주요 VJ 재 배열에서 발생하는 각각의 별개의 서브 클론에 해당하는 Levenshtein 거리에 따라 무향 그래프를 구축합니다. 참고 한 후, 이들 두 꼭지점 사이의 에지가 존재하는 두 개의 별개의 클론 사이의 거리가 동일한 경우. 거리가 1보다 큰 경우, 그것들을 연결하는 어떤 에지는 없다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 Kamada 가와이 레이아웃 &quot;iGraph&quot;R 패키지 tkplot 함수를 사용 3.3.3.2의 그래프를 그린다. 정점의 반경은 매핑 클론의 총 개수의 제곱 루트에 비례하고 음영 하나가 진단 (청) 또는 재발 (적색) 샘플에 속하는 클론의 비율을 표시하는 적색 및 청색 범위를 사용 . </li></ol></li></ol> 3.4) 이질성 (엔트로피) 측정 <ol><li> 의 번호와 서브 클론 수를 검사각각의 주요 VJ 재 배열에서 발생하는 체세포과 돌연변이의 개별 패턴 샘플 세트 페어링. </li><li> 표준 히스토그램 엔트로피 기반 추정을 사용하여 각 샘플의 고유 클론의 수를 조정 경험적​​ 엔트로피 잔류 경험적 엔트로피를 계산한다. </li></ol>

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

때문에 인간 B 세포 IGH 유전자좌 VDJ 재 배열 및 SHM에서 부호화 순서 정보의 반복 거의 무제한, 높은 처리량 깊은 시퀀싱하여 전체 IGH 레퍼토리 검사 클론 서술하는 효율적이고 광범위한 방법 입증 및 서브 클론 B 세포 집단. 더욱이, 이러한 전략은 질환의 다양한 단계를 따라 수집 된 환자 샘플의 클론과 서브 클론 구조를 비교하여 B 세포 종양 발생, 경감 및 재발 클론 진화 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. 기본 샘플 DNA에서 재 배열 된 VDJ 서열의 증폭을 용이하게 시판되는 프라이머를 사용하여 실험실 환경에서 수행되지만, 증폭 효율이 샘플 DNA의 품질에 크게 의존한다. 특히, FFPE 시료에서 추출한 DNA는 낮은 증폭 효율을 발휘하고, 종종 작은 FR3 단편으로부터 성공적으로 증폭 될 수있다샘플을 후속 분석을 위해 그들을 적합하지 않다. 여기에 설명 된 우리의 연구는 하나 또는 여러 개의 주요 클론은 전체 종양을 지배와 클론 질환으로 B 세포 림프종의 clonality을 이해하기 위해 설계 되었기 때문...

암은 클론 질환이다. 30 년 전에는 피터 C. Nowell는 암 클론 진화 모델 1을 제안 언제부터, 많은 연구는 종양 샘플에서 클론 인구를 해부하고, 종양 발생 과정 (2)를 기초 클론 확장과 진화 패턴을 재구성하기 위해 노력했다. 최근 전체 게놈 시퀀싱은 클론 이질성과 진화 3,4에 깊은 살펴보고 수사를 가능하게했다. 그러나, 다수의 세포 유형에서 취급 용이 마커의 부족으로 인해, 그것은 정확한 클론 아키텍처 진화 경로를 추정하는 것은 곤란하다. 다행히 DLBCL 등 많은 림프 악성 종양이, 유래하는 성숙 B 세포에서 자연 clonality 마커가있다. 항원 자극에 반응하여 이들의 세그먼트 큰 풀에서 함께 세그먼트를 각각 B 세포는 V의 H (가변), D (다이버 시티)을 접합하여 하나의 생산성 IGH VDJ 서열을 형성 할 수 있고, J H는 (결합). 이 홍보 중ocess 원래 서열의 작은 부분이 삭제 될 수 있고, 추가로 비 - 템플릿 뉴클레오티드 고유 VDJ 재 배열을 만들기 위해 첨가 될 수있다. 이 특정 VDJ 재배치 따라서 개인의 성숙 B 세포와 그 자손 (5) 태그,이 B 세포의 모든 자손에 상속 할 수 있습니다. 또한, SHM는 항체의 풀 팽창 및 항체 친 화성 (6)의 향상을위한 추가의 돌연변이를 도입하기 위해 후속 배 중심 (GC) 반응에서 VDJ 재조합 서열에서 일어난다. 따라서, 이러한 비교 과정을 거친 시료 림프종 및 VDJ SHM 패턴을 대조함으로써, 종양 내부의 이질성이 서술 될 수 있고, 질병의 클론 진화 경로가 추론 될 수있다. 이전 VDJ 재 배열 및 SHM은 서열 정보를 얻기 위해 PCR 제품,이어서 생거 시퀀싱 클로닝, 재결합 영역을 PCR 증폭에 의해 식별 될 수있다. 이 방법의 난VDJ 재조합 전체 레퍼토리의 매우 작은 부분을 검색하고, 주어진 샘플 내에 클론 집단의 전체 표현의 특성을 방해 낮은 처리량과 낮은 수율이야. 수정 된 접근 방식은 VDJ PCR 제품에서 NGS 색인 시퀀싱 라이브러리를 생성하고 샘플 당 50 만 재결합 VDJ 시퀀스를 얻기 위해 PE × 150의 BP 시퀀싱을 수행하여 만들어졌습니다. 또한, 사용자 정의 파이프 라인 필터 VDJ 서열은 각 읽기의 재배 열과 SHMS을 식별하고, 각 샘플의 클론 아키텍처 계통 분석을 수행하기 위해 판독, 품질 관리 (QC)를 수행 정렬하기 위해 개발되었다. 또한, 새로운 방법은 또한 다양한 질병의 단계에서 수집 된 샘플 클론 진화 패턴을 특성화하기 위해 설립되었다. 우리는 DLBCL 환자 샘플에이 기술을 적용했습니다. DLBCL 최대 1 일에 자주 재발과 비호 지킨 림프종의 공격적인 형태환자 7 IRD. 일부 5 년 8 이후에 발생하는 않지만 DLBCL 재발은 일반적으로 초기 진단 2 ~ 3 년 내에, 초기 발생합니다. 재발 환자에 대한 예후는 10 %로 인해 제한된 치료 옵션에 삼년 무 진행 생존 달성과 함께, 좋지 않습니다. 이 DLBCL 재발 9,10을 치료하는 새로운 접근 방식에 대한 긴급한 필요에 기초가된다. 그러나, DLBCL 재발과 관련된 분자 메커니즘은 아직 크게 알려져 있지 않다. 특히, DLBCL 재발 개발하는 동안 진단과 클론 진화에 클론 이질성의 역할은, 현재지지 않은 있습니다 어려운 재발을 예측할 수있는 정확하고 유용한 바이오 마커를 정의 할 수있다. 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 일치 차 진단 - 재발 DLBCL 샘플 쌍의 여러 쌍 우리의 VDJ 시퀀싱 방식을 적용했다. 재발의 두 가지 별개의 클론 진화 시나리오는 진단과 재발 SAMP의 클론 아키텍처의 비교에서 등장여러 분자 메커니즘을 제안 레는 DLBCL 재발에 관여 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof, 분자 생물학</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot; Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>단백질분해효소 K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) 용액 믹스</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM 각 뉴클레오티드</td></tr><tr><td>10x PCR Buffer&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer 및 MgCl2</td><td>Life Technonogies</td><td>4311806</td><td>50 &micro; l 5 U/&micro에서; l</td></tr><tr><td>표본 제어 크기 사다리</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 반응</td></tr><tr><td>IGH 체세포 과돌연변이 분석 v2.0 - 겔 검출</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 반응, IGVHFR1 검출</td></tr><tr><td>IGH 유전자 클론성 분석을 위한 믹스 2 - 겔 검출</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 반응, IGVHFR2 검출용 튜브 B</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro; l 5 U/&micro에서; l</td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) 버퍼</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50X TAE 버퍼&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 &micro; g/&마이크로; l</td></tr><tr><td>100 bp DNA 사다리</td><td>생활 기술</td><td>15628-019</td><td>1 &마이크로; g/&마이크로; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/비스 솔루션</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>1610144 500ml</td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 columns</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 고감도 분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광계</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>재현탁액 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>엔드 복구 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>A-테일링 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>연결 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>DNA 어댑터 인덱스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머 칵테일 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>젤 이미징 시스템</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq : b 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

이해 clonality 종양은 종양 및 질병 진행에 관련된 메카니즘을 이해하는 데 중요하다. 또한, 특정 미세 환경 또는 치료에 응답 종양 내에 발생 클론 조성 변화를 이해하는 것은 종양 세포를 근절보다 정교하고 효과적인 접근 방법의 설계로 이어질 수있다. 그러나 트래킹 서브 종양 클론 개체군 인해 구별 마커의 부족으로 인해 도전되고있다. 이 문제를 해결하기 위해, VDJ-SEQ 프로토콜은 VDJ 재조합 및 체세포과 돌연변이 (SHM), B 세포 림프종의 두 고유의 기능을 이용하여 확산 큰 B 세포 림프종 (DLBCL) 재발의 클론 진화 패턴을 추적하기 위해 만들어졌습니다. 이 프로토콜에서, 인덱싱 가능성을 가진 차세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리는 기본 진단 및 재발 DLBCL의 S​​AMP 쌍에서 증폭 재 배열 면역 글로불린 중쇄 (IGH) VDJ 지역에서 건설되었다레. 샘플 당 평균 이상 만 절반 이상 VDJ 서열은 VDJ 재배치와 SHM 정보를 모두 포함 시퀀싱, 후 얻었다에. 또한, 사용자 정의 생물 정보학 파이프 라인은 완전히 이러한 샘플 내 IGH-VDJ 레퍼토리의 특성에 대한 서열 정보를 이용하기 위해 개발되었다. 또한, 파이프 라인은 재건 및 진단 종양 진단 및 재발 종양 쌍 사이 클론 진화 패턴 공제 내의 클론 이질성의 시험을 가능 개별 종양 클론 구조의 비교를 허용한다. 여러 진단 - 재발 쌍에이 분석을 적용 할 때, 우리는 여러 독특한 종양 진화 패턴 DLBCL 재발로 이어질 수 있다는 키 증거를 발견. 또한,이 방법은 최소 잔존 질환의 식별, 진행 및 재발 치료 반응을 모니터링하고, 면역 repertoir 조사 등의 다른 임상 적 형태로 확장 될 수있다비 림프종 상황에서 에스.

DNA 추출을 포함 VDJ 서열 (VDJ-SEQ)의 전반적인 절차는, 처리 및 계통 발생 분석을 판독 VDJ 영역 증폭 및 정제, 서열 라이브러리 구성을 재결합,도 1에 표시된다. 일상적 5-200 μg의의 DNA로부터 검색 될 수있다 냉동 고체 조직 섹션 또는 포르말린 고정 파라핀 조직 절편에서 0.5 ~ 20 μg의 DNA를. 품질, 재 배열 패턴 및 개별 샘플 SHM 정도에 따라 다른 샘플로부터 VDJ 증폭 산물의 다양성을 얻을 수 있었다 (도 2), IGVHFR1 (3백10부터 3백80까지 BP), FR2 (2백50부터 2백95까지 BP)를 포함 FR3 (70-120 BP). 단지 FR3 VDJ 단편 PCR로부터 획득 될 수있는 샘플 인해 하류 데이터 분석 목적 서열 정보의 충분한 양을 제공하지 않는 짧은 제품에 나머지 연구에서 제외 하였다. 주요 FR1 또는 FR2 PCR 생성물 번째에 가시화 될 수있는 단지 샘플예를 아가로 스겔은 시퀀싱 라이브러리를 생성하...

이 프로토콜은 딥 시퀀싱(deep-sequencing)을 통해 림프종의 재조합된 면역글로불린 중쇄 VDJ 영역을 조사하고 VDJ 재배열 및 체세포 과돌연변이 상태를 검색하여 개별 종양의 클론 구조를 설명하는 방법을 설명합니다. 쌍을 이룬 진단과 재발 샘플 사이의 클론 구조를 비교하면 림프종 재발 클론 진화 모드가 밝혀집니다.

VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

이 절차의 전반적인 목표는 림프종 샘플의 클론 조성을 분석하여 림프종 재발의 클론 진화 패턴을 식별하는 것입니다. 이 방법은 재발성 종양이 원래의 종양으로부터 어떻게 기인하는지와 같은 림프종 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 최신 고처리량 시퀀싱 기술을 적용하여 림프종의 공통점을 더욱 포괄적으로 매핑할 수 있다는 점입니다.본 프로토콜에서는 냉동 OCT 임베딩 조직의 박절편뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE)된 정상 또는 악성 조직에서 DNA를 추출합니다. 먼저, 10~30개의 박절편을 proteinase K와 0.625% SDS가 포함된 4 mL의 핵산 용해 버퍼(nucleic lysis buffer)에 넣고 37 °C 항온수조에서 하룻밤 동안 소화시킵니다. 다음 날, 소화 혼합물에 포화 5 M 염화나트륨(sodium chloride) 1 mL를 첨가하고 15초 동안 격렬하게 흔든 후, 1,100 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.실온에서 상층액을 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 100% ethanol을 2배 부피로 첨가하고 튜브를 6~8회 반전시켜 섞은 후, 4°C에서 5,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다. 침전된 DNA를 수집하기 위해, 70% ethanol로 DNA 펠릿을 2회 세척하며, 매회 5,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.포르말린 고정 파라핀 임베딩 조직의 박절편에서 DNA를 추출하기 위해, DNA 펠릿을 100에서 400 µL의 TE 버퍼에 녹여 실온의 쉐이커에서 하룻밤 동안 반응시켜 펠릿을 수집하십시오. 먼저 파라핀 절편을 1 mL의 자일렌에 넣고 실온에서 10분씩 두 번 배양하여 탈파라핀 처리를 합니다. 실온에서 13,000 ×g로 5분간 원심분리하여 조직 절편을 수집하십시오.다음으로, 절편을 100% Ethanol 1 mL에 넣고 상온에서 10분씩 두 번 인큐베이션하여 잔류 자일렌을 제거합니다. 13,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 조직 절편을 수집합니다. 상온에서 10~15분 동안 절편을 자연 건조시킵니다.갓 조제한 protease case 용액을 샘플에 추가하여 최종 부피를 50 내지 100 µL로 맞춘 후, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 샘플을 95 °C에서 10분 동안 가열하여 proteinase K를 불활성화합니다. 이전 세그먼트에서 보여준 추출법을 통한 DNA 수득량은 조직의 크기에 따라 5 내지 200 µg입니다.다음 단계는 PCR 튜브 혼합물 내의 각 DNA 샘플 품질을 평가하는 것입니다. 상용 래더 키트의 마스터 믹스 45 µL에 TDNA polymerase 25 µL를 분주하십시오. PCR 튜브에 DNA 5 µL를 첨가하고, 피펫팅으로 최소 5회 이상 상하로 섞어 충분히 혼합합니다.프로토콜 본문에 상세히 기술된 조건에 따라 DNA를 증폭하십시오. 다음으로, PCR 반응액 20 µL와 6x 로딩 다이 4 µL를 혼합하여 2% AGROS 겔에 로딩하십시오. 전기영동이 완료되면 AGROS 겔을 Ethereum bromide로 염색하여 PCR 산물을 검출하십시오.겔 이미징 시스템을 통해 100, 200, 300, 400 및 600 base pairs 크기의 5가지 PCR 산물을 생성하는 샘플을 사용하여 VDJ 앰플리콘만을 생성합니다. 본 비디오에서는 프레임워크 영역 1 또는 IGV HFR 1로부터 재조합된 I-G-H-V-D-J 세그먼트의 증폭 과정을 시연합니다. 프레임워크 영역 2로부터 재조합된 I-G-H-B-D-J 세그먼트의 증폭은 이와 유사한 절차를 따르며, PCR 튜브 믹스 내의 프로토콜 텍스트에 기술되어 있습니다.상업용 somatic IGH HYPERMUTATION gel 검출 키트의 mix two라고 표시된 튜브에서 마스터 믹스 45 µL를 취합니다. 여기에 Taq DNA polymerase 0.25 µL와 샘플 DNA 5 µL를 첨가합니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 조건에 따라 DNA를 증폭시킵니다. 최적화되지 않은 DNA를 증폭하려면 변성(denaturing) 시간을 연장하거나 증폭 사이클 횟수를 늘려 PCR 조건을 조정할 수 있습니다. 전체 PCR 생성물을 2% agarose 겔 전기영동으로 분리합니다. 0.5 µg/mL 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 agarose 겔을 염색하여 PCR 생성물을 검출합니다.겔 이미징 시스템을 통해 310에서 380 base pairs 범위의 크기를 가진 단일클론 앰플리콘(monoclonal amplicon)이 검출될 것으로 예상됩니다. 단일클론 앰플리콘이 포함된 겔 부분을 절개하십시오. 그 후, 제조사의 프로토콜에 따라 표준 겔 추출 키트를 사용하여 절개된 겔로부터 DNA를 정제하십시오.이 절차를 시작하려면, 정제된 V-D-J-P-C-R 생성물을 PCR 튜브에 옮기고 DNA 샘플 준비 키트의 Resus 현탁 버퍼를 추가하여 최종 부피를 60 µL로 맞춥니다. DNA 샘플 준비 키트의 엔드 리페어 믹스 40 µL를 추가하고 충분히 혼합한 후, 100 °C로 예열된 리드가 장착된 예열된 써모사이클러에서 30 °C로 30분 동안 반응물을 배양합니다. 다음으로, 1.5 mL 튜브에 마그네틱 비드 136 µL와 PCR 등급 멸균수 24 µL를 혼합하고, 엔드 리페어 반응물 전체를 해당 튜브로 옮겨 비드 용액과 잘 혼합합니다.비드가 용액에서 분리될 수 있도록 튜브를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 둡니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 갓 준비한 80% ethanol로 비드를 두 번 세척합니다. 에탄올 용액을 완전히 흡입하여 제거하고, 실온에서 15분 동안 비드를 자연 건조시킵니다.15분 후에 튜브를 자석 거치대에서 꺼내어 비드들을 17.5 µL의 Resus Suspension Buffer에 다시 현탁합니다. 튜브를 다시 자석 거치대에 2분 동안 놓아 비드와 Resus Suspension Buffer를 분리합니다. 말단 수복 생성물이 포함된 Resus Suspension Buffer를 깨끗한 PCR 튜브로 옮깁니다.다음 단계는 말단 수선 산물에 a-tail을 추가하는 것입니다. 말단 수선 산물이 들어 있는 PCR 튜브에 12.5 µL의 a-tailing mix를 넣고 충분히 섞어줍니다. 100 °C로 예열된 덮개가 있는 예열된 서모사이클러에서 PCR 튜브를 37 °C로 30분 동안 배양합니다.어댑터 결합을 위해, a-tailing 반응액에 Resus 현탁 완충액 2.5 µL, 결합 믹스 2.5 µL, 그리고 DNA 어댑터 인덱스 2.5 µL를 추가합니다. 100 °C로 예열된 리드가 장착된 예열된 서모사이클러에서 30 °C로 30분 동안 반응을 배양합니다. 30분 후, 각 반응액에 결합 정지 완충액 5 µL를 추가하고 충분히 혼합합니다.잘 섞인 마그네틱 비드 42.5 µL를 각 반응액에 첨가하고, 앞서 설명한 대로 80% ethanol로 세척합니다. 어댑터가 결합된 생성물을 용출시키기 위해 Resus suspension buffer 50 µL를 첨가합니다. 잘 섞인 ampu XP 비드 50 µL를 사용하여 어댑터가 결합된 생성물을 두 번째로 정제하고, 생성물을 25 µL의 Resus Suspension Buffer로 용출하여 깨끗한 PCR 튜브에 담습니다.VDJ 앰플리콘을 증폭하려면, 어댑터가 결합된 생성물이 들어 있는 PCR 튜브에 PCR 프라이머 칵테일 5 µL와 PCR 마스터 믹스 25 µL를 넣고 충분히 섞은 후, 프로토콜 본문에 설명된 조건에 따라 써모사이클러에서 증폭을 수행합니다. 증폭이 완료되면 잘 섞인 마그네틱 비드 50 µL를 사용하여 반응물을 정제하고, 최종 생성물을 30 µL의 Resus Buffer에 용출합니다. 이후 VTJ 앰플리콘 라이브러리는 프로토콜 본문에 설명된 대로 검증, 풀링 및 시퀀싱 과정을 거칩니다.VVG 시퀀싱 라이브러리의 복잡성이 낮기 때문에, 정확한 염기 호출(base calling)이 가능하도록 승인된 시퀀싱 샘플에 20~50% FI 스파이킹(spiking)을 추가할 것을 권장합니다. 다음의 대표적인 젤 이미지는 림프종 환자 샘플에서 추출한 DNA로부터 얻은 V-D-J-P-C-R 앰플리콘 산물을 보여줍니다. 라이브러리 구축 전후의 V-D-J-P-C-R 앰플리콘 품질은 바이오어낼라이저(bioanalyzer)로 평가되었습니다.334bp에서 459bp로의 크기 변화는 미만성 거대 B세포 림프종 재발 사례의 클론 진화를 추적하기 위한 어댑터의 추가를 나타냅니다. 진단 시점과 재발 시점의 샘플 간에 주요 중쇄 VDJ 재배열의 체세포 과돌연변이(SHM) 프로필에 대한 계통발생학적 분석이 수행되었습니다.후기 발산적 클론 진화 모드가 관찰되었습니다. 클론 진화를 시각화하기 위한 새로운 그래픽 방법이 개발되었습니다. 제시된 패턴은 후기 발산적 재발 모델과 초기 발산적 재발 모델의 다차원 척도법 플롯입니다.각 원의 반지름은 특정 SHM 프로파일에 해당하는 서브클론의 수를 나타냅니다. 파란색은 진단 시료에 해당하며, 빨간색은 재발 시료에 해당합니다. 마찬가지로, 무방향 그래프는 후기 분기 사례의 서브클론 수 분포가 초기 분기 사례와 다름을 보여줍니다.각 모서리는 한 글자의 문자열 거리 차이가 있는 두 개의 SHM 프로필에 해당하며, 색상 척도 막대는 빨간색의 진단 샘플 또는 노란색의 재발 샘플에 해당하는 특정 SHM 프로필에 매핑되는 서열의 비율을 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 샘플 간의 교차 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 림프종 종양 샘플의 특성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 접근 방식은 미세 잔존 질환을 추적하고 암에 대한 면역 감시 반응을 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

여기에서는 고전적인 Hodgkin lymphoma (CHL)의 Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) 세포로부터 고품질, 전체 exome 데이터를 생산하도록 고안된 결합 된 유동 세포 계측법 세포 분류 및 저 입력, 차세대 라이브러리 구성 프로토콜을 설명합니다.

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

여기, 우리 제시 내용은 기술적인 측면 및 만성 림프모구 백혈병 (CLL) 환자에서 강력한 IG 유전자 순서 분석을 위해 필수적인 요구 사항에 유럽 연구 이니셔티브의 축적 된 경험에 기반 하는 프로토콜 CLL (에릭)입니다.

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

여기, 우리는 프로토콜 분석 및 구조 시각화 및 전체 항 체 레파토리의 헌법에 대 한 설명. 이 다음-세대 시퀀싱을 사용 하 여 항 체 RNA의 광대 한 시퀀스의 수집을 포함 한다.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

여기에 제시된 마우스 페이어의 패치에서 발아 센터 B 세포를 사용하여 면역 글로불린 무거운 사슬 유전자 궤적 내의 체세포 초열을 정량화하는 분석이다.

마우스 페이어의 패치에서 발아 센터 B 세포의 JH4 인트론에서 체증 의 분석

현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.

차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석

이 동영상은 사후의 눈에 인간의 유리 신체의 다양한 반투명 구조를 차별하고 해부를위한 효과적인 기법을 보여줍니다.

Proteomic 분석을위한 인적 유리 바디 요소의 해부

방법은 생쥐에서 인간의 retinoblastoma 종양을 전파하기 위해 설명되어 있습니다. 종양 세포에 직접 면역 결함 생쥐의 눈을에 주입하고 있습니다. 이차 종양이 성공적으로 직접적으로 인간의 종양과 교양 tumorspheres에서 수확을 모두 세포를 사용하여 설립되었습니다.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

배우세요 B세포 림프종의 클론 진화 패턴을 파악하기 위한 VDJ-SEQ 방법입니다. 면역글로불린 중쇄 유전자의 심층 시퀀싱을 통해 림프종 샘플의 클론 구성을 분석하고 재발 종양의 기원과 진화를 이해할 수 있습니다.

VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

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