VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

이 절차의 전반적인 목표는 림프종 샘플의 클론 조성을 분석하여 림프종 재발의 클론 진화 패턴을 식별하는 것입니다. 이 방법은 재발성 종양이 원래의 종양으로부터 어떻게 기인하는지와 같은 림프종 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 최신 고처리량 시퀀싱 기술을 적용하여 림프종의 공통점을 더욱 포괄적으로 매핑할 수 있다는 점입니다.

본 프로토콜에서는 냉동 OCT 임베딩 조직의 박절편뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE)된 정상 또는 악성 조직에서 DNA를 추출합니다. 먼저, 10~30개의 박절편을 proteinase K와 0.625% SDS가 포함된 4 mL의 핵산 용해 버퍼(nucleic lysis buffer)에 넣고 37 °C 항온수조에서 하룻밤 동안 소화시킵니다. 다음 날, 소화 혼합물에 포화 5 M 염화나트륨(sodium chloride) 1 mL를 첨가하고 15초 동안 격렬하게 흔든 후, 1,100 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.

실온에서 상층액을 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 100% ethanol을 2배 부피로 첨가하고 튜브를 6~8회 반전시켜 섞은 후, 4°C에서 5,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다. 침전된 DNA를 수집하기 위해, 70% ethanol로 DNA 펠릿을 2회 세척하며, 매회 5,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.

포르말린 고정 파라핀 임베딩 조직의 박절편에서 DNA를 추출하기 위해, DNA 펠릿을 100에서 400 µL의 TE 버퍼에 녹여 실온의 쉐이커에서 하룻밤 동안 반응시켜 펠릿을 수집하십시오. 먼저 파라핀 절편을 1 mL의 자일렌에 넣고 실온에서 10분씩 두 번 배양하여 탈파라핀 처리를 합니다. 실온에서 13,000 ×g로 5분간 원심분리하여 조직 절편을 수집하십시오.

다음으로, 절편을 100% Ethanol 1 mL에 넣고 상온에서 10분씩 두 번 인큐베이션하여 잔류 자일렌을 제거합니다. 13,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 조직 절편을 수집합니다. 상온에서 10~15분 동안 절편을 자연 건조시킵니다.

갓 조제한 protease case 용액을 샘플에 추가하여 최종 부피를 50 내지 100 µL로 맞춘 후, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 샘플을 95 °C에서 10분 동안 가열하여 proteinase K를 불활성화합니다. 이전 세그먼트에서 보여준 추출법을 통한 DNA 수득량은 조직의 크기에 따라 5 내지 200 µg입니다.

다음 단계는 PCR 튜브 혼합물 내의 각 DNA 샘플 품질을 평가하는 것입니다. 상용 래더 키트의 마스터 믹스 45 µL에 TDNA polymerase 25 µL를 분주하십시오. PCR 튜브에 DNA 5 µL를 첨가하고, 피펫팅으로 최소 5회 이상 상하로 섞어 충분히 혼합합니다.

프로토콜 본문에 상세히 기술된 조건에 따라 DNA를 증폭하십시오. 다음으로, PCR 반응액 20 µL와 6x 로딩 다이 4 µL를 혼합하여 2% AGROS 겔에 로딩하십시오. 전기영동이 완료되면 AGROS 겔을 Ethereum bromide로 염색하여 PCR 산물을 검출하십시오.

겔 이미징 시스템을 통해 100, 200, 300, 400 및 600 base pairs 크기의 5가지 PCR 산물을 생성하는 샘플을 사용하여 VDJ 앰플리콘만을 생성합니다. 본 비디오에서는 프레임워크 영역 1 또는 IGV HFR 1로부터 재조합된 I-G-H-V-D-J 세그먼트의 증폭 과정을 시연합니다. 프레임워크 영역 2로부터 재조합된 I-G-H-B-D-J 세그먼트의 증폭은 이와 유사한 절차를 따르며, PCR 튜브 믹스 내의 프로토콜 텍스트에 기술되어 있습니다.

상업용 somatic IGH HYPERMUTATION gel 검출 키트의 mix two라고 표시된 튜브에서 마스터 믹스 45 µL를 취합니다. 여기에 Taq DNA polymerase 0.25 µL와 샘플 DNA 5 µL를 첨가합니다. 프로토콜 텍스트에 설명된 조건에 따라 DNA를 증폭시킵니다. 최적화되지 않은 DNA를 증폭하려면 변성(denaturing) 시간을 연장하거나 증폭 사이클 횟수를 늘려 PCR 조건을 조정할 수 있습니다. 전체 PCR 생성물을 2% agarose 겔 전기영동으로 분리합니다. 0.5 µg/mL 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 agarose 겔을 염색하여 PCR 생성물을 검출합니다.

겔 이미징 시스템을 통해 310에서 380 base pairs 범위의 크기를 가진 단일클론 앰플리콘(monoclonal amplicon)이 검출될 것으로 예상됩니다. 단일클론 앰플리콘이 포함된 겔 부분을 절개하십시오. 그 후, 제조사의 프로토콜에 따라 표준 겔 추출 키트를 사용하여 절개된 겔로부터 DNA를 정제하십시오.

이 절차를 시작하려면, 정제된 V-D-J-P-C-R 생성물을 PCR 튜브에 옮기고 DNA 샘플 준비 키트의 Resus 현탁 버퍼를 추가하여 최종 부피를 60 µL로 맞춥니다. DNA 샘플 준비 키트의 엔드 리페어 믹스 40 µL를 추가하고 충분히 혼합한 후, 100 °C로 예열된 리드가 장착된 예열된 써모사이클러에서 30 °C로 30분 동안 반응물을 배양합니다. 다음으로, 1.5 mL 튜브에 마그네틱 비드 136 µL와 PCR 등급 멸균수 24 µL를 혼합하고, 엔드 리페어 반응물 전체를 해당 튜브로 옮겨 비드 용액과 잘 혼합합니다.

비드가 용액에서 분리될 수 있도록 튜브를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 둡니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 갓 준비한 80% ethanol로 비드를 두 번 세척합니다. 에탄올 용액을 완전히 흡입하여 제거하고, 실온에서 15분 동안 비드를 자연 건조시킵니다.

15분 후에 튜브를 자석 거치대에서 꺼내어 비드들을 17.5 µL의 Resus Suspension Buffer에 다시 현탁합니다. 튜브를 다시 자석 거치대에 2분 동안 놓아 비드와 Resus Suspension Buffer를 분리합니다. 말단 수복 생성물이 포함된 Resus Suspension Buffer를 깨끗한 PCR 튜브로 옮깁니다.

다음 단계는 말단 수선 산물에 a-tail을 추가하는 것입니다. 말단 수선 산물이 들어 있는 PCR 튜브에 12.5 µL의 a-tailing mix를 넣고 충분히 섞어줍니다. 100 °C로 예열된 덮개가 있는 예열된 서모사이클러에서 PCR 튜브를 37 °C로 30분 동안 배양합니다.

어댑터 결합을 위해, a-tailing 반응액에 Resus 현탁 완충액 2.5 µL, 결합 믹스 2.5 µL, 그리고 DNA 어댑터 인덱스 2.5 µL를 추가합니다. 100 °C로 예열된 리드가 장착된 예열된 서모사이클러에서 30 °C로 30분 동안 반응을 배양합니다. 30분 후, 각 반응액에 결합 정지 완충액 5 µL를 추가하고 충분히 혼합합니다.

잘 섞인 마그네틱 비드 42.5 µL를 각 반응액에 첨가하고, 앞서 설명한 대로 80% ethanol로 세척합니다. 어댑터가 결합된 생성물을 용출시키기 위해 Resus suspension buffer 50 µL를 첨가합니다. 잘 섞인 ampu XP 비드 50 µL를 사용하여 어댑터가 결합된 생성물을 두 번째로 정제하고, 생성물을 25 µL의 Resus Suspension Buffer로 용출하여 깨끗한 PCR 튜브에 담습니다.

VDJ 앰플리콘을 증폭하려면, 어댑터가 결합된 생성물이 들어 있는 PCR 튜브에 PCR 프라이머 칵테일 5 µL와 PCR 마스터 믹스 25 µL를 넣고 충분히 섞은 후, 프로토콜 본문에 설명된 조건에 따라 써모사이클러에서 증폭을 수행합니다. 증폭이 완료되면 잘 섞인 마그네틱 비드 50 µL를 사용하여 반응물을 정제하고, 최종 생성물을 30 µL의 Resus Buffer에 용출합니다. 이후 VTJ 앰플리콘 라이브러리는 프로토콜 본문에 설명된 대로 검증, 풀링 및 시퀀싱 과정을 거칩니다.

VVG 시퀀싱 라이브러리의 복잡성이 낮기 때문에, 정확한 염기 호출(base calling)이 가능하도록 승인된 시퀀싱 샘플에 20~50% FI 스파이킹(spiking)을 추가할 것을 권장합니다. 다음의 대표적인 젤 이미지는 림프종 환자 샘플에서 추출한 DNA로부터 얻은 V-D-J-P-C-R 앰플리콘 산물을 보여줍니다. 라이브러리 구축 전후의 V-D-J-P-C-R 앰플리콘 품질은 바이오어낼라이저(bioanalyzer)로 평가되었습니다.

334bp에서 459bp로의 크기 변화는 미만성 거대 B세포 림프종 재발 사례의 클론 진화를 추적하기 위한 어댑터의 추가를 나타냅니다. 진단 시점과 재발 시점의 샘플 간에 주요 중쇄 VDJ 재배열의 체세포 과돌연변이(SHM) 프로필에 대한 계통발생학적 분석이 수행되었습니다.

후기 발산적 클론 진화 모드가 관찰되었습니다. 클론 진화를 시각화하기 위한 새로운 그래픽 방법이 개발되었습니다. 제시된 패턴은 후기 발산적 재발 모델과 초기 발산적 재발 모델의 다차원 척도법 플롯입니다.

각 원의 반지름은 특정 SHM 프로파일에 해당하는 서브클론의 수를 나타냅니다. 파란색은 진단 시료에 해당하며, 빨간색은 재발 시료에 해당합니다. 마찬가지로, 무방향 그래프는 후기 분기 사례의 서브클론 수 분포가 초기 분기 사례와 다름을 보여줍니다.

각 모서리는 한 글자의 문자열 거리 차이가 있는 두 개의 SHM 프로필에 해당하며, 색상 척도 막대는 빨간색의 진단 샘플 또는 노란색의 재발 샘플에 해당하는 특정 SHM 프로필에 매핑되는 서열의 비율을 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 샘플 간의 교차 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 림프종 종양 샘플의 특성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 접근 방식은 미세 잔존 질환을 추적하고 암에 대한 면역 감시 반응을 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.