높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

다음 실험의 전반적인 목표는 마이크로플레이트 기반 산소 소비 기술을 사용하여 전자 전달계, TCA 회로 베타 산화 경로 및 기질 수송체의 기능을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 분석을 위한 기질 및 주입 용액을 준비합니다. 두 번째 단계는 이전에 수화시킨 tric 분석 카트리지에 주입 용액을 첨가하여 산소 소비 측정기를 교정하는 것입니다.

다음으로, 미토콘드리아 기질 용액을 준비하여 세포 배양 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 원심 분리하여 미토콘드리아가 플레이트 웰에 부착되도록 한 후, 이를 호흡 측정 분석 장비에 로딩합니다. 각 호흡 측정 분석에 대해 미토콘드리아 호흡에 기반한 산소 소비율을 나타내는 장비 결과값을 얻습니다.

Clark 전극과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 마이크로플레이트 기반 기술을 통해 더 적은 양의 미토콘드리아로 산소 소비량을 더 효율적이고 높은 처리량으로 측정할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 분석용 용액을 준비하는 과정에 복잡한 단계가 많아 어려움을 겪을 수 있습니다. 실험 전날 밤, 비 CO2 인큐베이터의 37 °C 조건에서 1 mL의 보정 용액으로 tric 분석 카트리지를 수화시킵니다. 다음 날, 냉동된 모든 스톡 용액을 꺼내 37 °C 항온수조 또는 인큐베이터에서 해동합니다. 모든 기질 용액과 주입 용액을 준비하여 얼음 위에 보관합니다. 다음 단계는 멀티웰 산소 소비 측정 장치를 적절한 혼합 속도 및 측정 파라미터로 프로그래밍하는 것입니다.

분석 소프트웨어를 실행하고 표준 모드를 선택하십시오. seahorse 게스트 포럼으로 진입하여 assay wizard를 클릭하십시오. assay wizard 내에서 protocol을 클릭하여 믹스 무게 및 측정 파라미터를 변경하십시오.

배경 보정(background correction) 탭에서 배경 웰을 지정하고 반드시 강조 표시하십시오. 배경 보정을 수행합니다. 먼저 그룹 및 레이블(groups and labels) 탭을 클릭한 다음, 그룹 정보(group info) 탭을 클릭하여 조건들을 레이블링하십시오.

이러한 매개변수들을 입력한 후, end를 클릭하고 이어서 save template를 클릭하십시오. 이 절차를 시작하려면 주입 용액을 분석 실행 카트리지에 로드하십시오. 용액이 적절한 포트로 주입되도록 주의하십시오.

어세이 런 카트리지의 홈이 파인 모서리가 왼쪽 하단으로 향하게 하여 장비에 장착하십시오. 분석 소프트웨어에 접속한 후 표준 모드로 진입하여 교정을 시작하십시오. seahorse 게스트 포럼에 접속하십시오.

templates 탭의 XF Drive 아래에 저장된 템플릿을 엽니다. 템플릿이 열리면 시작(start)을 클릭하여 캘리브레이션을 시작하며, 이는 약 30분 정도 소요됩니다. 이 절차에 사용된 미토콘드리아는 적색 골격근에서 분리되었습니다. 끝부분을 약 3mm 절단한 200 µL 피펫 팁으로 용액을 부드럽게 저어 미토콘드리아 기질 스톡을 조심스럽게 하지만 충분히 혼합하십시오.

미토콘드리아 스톡의 단백질 농도를 결정한 후, 숙신산(succinate) 기질 혼합물 200 µL당 10 µg의 미토콘드리아 단백질을 재현탁합니다. 끝부분을 약 3 mm 잘라낸 200 µL 피펫 팁으로 용액을 부드럽게 저어 미토콘드리아 기질 용액을 완만하지만 충분히 혼합합니다. 나머지 기질 혼합물 각각에 대해서도 200 µL당 14 µg의 미토콘드리아 단백질을 재현탁합니다. 모든 미토콘드리아 단백질 기질 혼합물을 얼음에 보관합니다.

24웰 세포 배양 플레이트를 얼음에 올리고, 각 미토콘드리아 기질 혼합물을 웰당 50 µL씩 3반복으로 분주합니다. 마이크로플레이트 기반 TRIC 분석법 개발자는 미토콘드리아가 없는 공백 웰을 최소 2개, 가급적 세포 배양 플레이트의 양 끝단에 배치할 것을 권장합니다. 플레이트가 회전하는 동안 미토콘드리아가 웰에 부착되도록 세포 배양 플레이트를 4 °C에서 2000 G로 20분 동안 원심 분리합니다.

기질 용액을 37 °C 항온 수조에서 가온합니다. 스핀이 완료되면, 각 웰의 상단에 각 기질 용액 450 µL를 조심스럽게 분주합니다. 플레이트는 반드시 상온에서 로딩하십시오.

공백 웰에 substrate blank 500 microliters를 분주합니다. 전자 흐름 분석용으로 지정된 웰에는 전자 흐름 substrate를 분주하고, 결합 분석 공백 웰에는 임의의 결합 분석 substrate를 분주할 수 있습니다. 각 웰에 substrate 450 microliters를 첨가한 후, 20배 배율로 웰 내의 미토콘드리아 층을 관찰하여 미토콘드리아가 단일 단층으로 고르게 분산되었는지 확인하십시오.

본 예시에서 보여주는 바와 같이, 단일층이 균일하게 분포되지 않은 것으로 보이는 이미지 웰은 oc 이후에 제거할 수 있습니다. 미토콘드리아의 부착을 확인한 후, 세포 배양 플레이트를 Respir metric 분석 기기로 옮기십시오. 확인을 클릭하십시오.

기기는 앞서 캘리브레이션에 사용된 유틸리티 플레이트를 배출합니다. 유틸리티 플레이트를 제거하고 미토콘드리아가 포함된 세포 배양 플레이트를 트레이 위에 놓으십시오. 세포 배양 플레이트의 파란색 홈이 트레이의 왼쪽 하단 모서리에 위치해야 합니다.

계속하기를 클릭하여 약 40분 정도 소요되는 분석 실행을 시작하십시오. 실행이 완료되면 화면의 배출 버튼을 눌러 세포 배양 플레이트를 배출하십시오. 플레이트가 배출되면 세포 배양 플레이트와 카트리지를 제거하여 폐기하십시오.

화면에서 계속(continue)을 누르십시오. 실행 결과는 데이터 파일에 XLS 파일로 자동 저장됩니다. 이 파일을 열고 Y1 마커 아래의 아래쪽 화살표를 눌러 표시 설정을 O2에서 OCR로 변경하십시오.

다음으로, 표시된 속도 데이터 옵션에서 중간 지점(middle point)을 지점 간 속도(point to point rates)로 변경하십시오. 확인을 클릭합니다. 이러한 변경 사항을 적용하려면 화면 왼쪽 하단의 웰 그룹 모드(well group mode) 탭을 클릭하여 유사한 조건의 웰들을 함께 그룹화하십시오.

마지막으로 화면 중앙 좌측에 있는 sample mean standard error 탭을 클릭하십시오. 이 명령들은 분석 전에 미리 설정할 수도 있습니다. 이 트레이싱은 네 가지 커플링 분석에 대한 시간 경과에 따른 산소 소비율 또는 OCR을 나타냅니다.

첫 번째 패널은 DP가 없는 상태에서의 호흡인 상태 2(state two)를 나타냅니다. DP 주입 후의 두 번째 패널은 최대 결합 호흡(maximal coupled respiration)인 상태 3(state three) 호흡을 나타냅니다. 올리고마이신(oligomycin) 주입 후의 세 번째 패널은 양성자 누출(proton leak)로 인한 호흡인 상태 4(state four) 호흡을 나타냅니다.

FCCP 주입 후의 네 번째 패널은 최대 비결합 호흡(maximal uncoupled respiration)을 나타내며, 이는 상태 3U(State three U) 호흡이라고도 합니다. antimycin A 주입 후의 다섯 번째 패널은 산화적 호흡의 억제를 나타냅니다. 미토콘드리아 스톡과 미토콘드리아 기질 혼합물을 철저히 혼합하고, 부착 원심분리 후 미토콘드리아가 단일 단층을 형성하게 함으로써 모든 미토콘드리아 상태에서 표준 편차를 최소화하였습니다.

대조적으로, 각 웰에 불균일한 양의 미토콘드리아를 로딩하여 미토콘드리아가 단일 단층을 형성하지 못한 경우에는 각 상태에서 표준 편차가 증가합니다. 이는 분당 OCR 값이 1,500 ole를 초과하는 파란색 트레이스와, 지점 간 속도 값의 하락으로 예시되는 측정 기간 동안의 호흡률 감소를 통해 확인할 수 있습니다. 반면 빨간색 트레이스는 일관된 지점 간 속도를 보여주며 최대 OCR 값은 분당 1,500 ole 미만임에 유의하십시오. 미토콘드리아 단백질 과부하는 웰의 마이크로 챔버 내 산소 고갈을 초래할 수 있으며, 이는 파란색 트레이스에서 나타나듯 측정 기간 동안 O2 값이 0에 근접하고 연속적인 측정 후 시작 O2 값이 현저히 감소함에 따라 각 후속 측정에서 정확한 OCR 측정을 방해하게 됩니다.

이 절차를 수행할 때는 미토콘드리아와 기질 용액을 혼합할 때 인내심을 갖는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이러한 방법들을 숙달하면, 특정 기질 수송체를 대상으로 하는 약물 치료가 미토콘드리아 산소 소비에 어떤 영향을 미치는가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 추가 실험을 설계할 수 있습니다.