높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

다음 실험의 전반적인 목표는 마이크로플레이트 기반 산소 소비 기술을 사용하여 전자 전달 사슬, TCA 주기 베타 산화 경로 및 기질 수송체의 기능을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 분석을 위한 기질과 주입 용액을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 이전에 수화된 tric assay 카트리지에 주입 용액을 추가하여 산소 소비량 기계를 보정하는 것입니다.

다음으로, 미토콘드리아 기질 용액을 준비하고 이러한 용액을 세포 배양 플레이트에 로드합니다. 세포 배양 플레이트를 돌려 플레이트를 Respira metric assay에 로드하기 전에 미토콘드리아 플레이트가 플레이트에 잘 부착되도록 합니다. 각 respiro metric assay에 대한 미토콘드리아 호흡을 기반으로 산소 소비율을 보여주는 기기 결과를 얻습니다.

클라크 전극 같이 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은, microplate 근거한 기술이 미토콘드리아의 더 적은 양을 가진 산소 소비의 능률 적이고 및 더 높은 처리량 취득을 허용한다 이다, 일반적으로 이 방법에 새로운 개인은 분석실험 전 밤에 구경측정 해결책의 1 밀리리터에 있는 수화물 tric 분석실험 카트리지를 비 실험 전에 수화물 tric 분석실험 카트리지를 위한 해결책을 준비하기에서 포함된 모든 이동 부분 때문에 고군분투할 것이다 CO2 인큐베이터 다음 날 섭씨 37도에서 얼어붙은 줄기를 모두 꺼내 섭씨 37도의 수조 또는 인큐베이터에서 해동합니다. 모든 기질 용액과 주입 용액을 준비하고 얼음에 보관하십시오. 다음 단계는 다중 웰 산소 소비량 측정 기계를 적절한 혼합 중량 및 측정 매개변수로 프로그래밍하는 것입니다.

해석 소프트웨어를 입력하고 표준 모드를 선택합니다. Seahorse 게스트 포럼에 들어가 분석 마법사를 클릭하십시오. 분석 마법사에서 프로토콜을 클릭하여 혼합 중량 및 측정 파라미터를 변경합니다.

back correction(뒤로) 수정 탭 아래의 배경 웰에 레이블을 지정하고 강조 표시해야 합니다. 배경 보정을 수행합니다. 먼저 groups and labels(그룹 및 레이블) 탭을 클릭한 다음 group info(그룹 정보) 탭을 클릭하여 조건에 레이블을 지정합니다.

이러한 매개 변수를 입력한 후 end(종료)를 클릭한 다음 save template(템플릿 저장)을 클릭합니다. 이 절차를 시작하려면 주입 용액을 분석 실행 카트리지에 로드합니다. 용액을 적절한 포트에 주입하도록 주의하십시오.

분석 실행 카트리지를 왼쪽 하단에 노치가 있는 모서리가 있는 기계에 로드합니다. 먼저 해석 소프트웨어를 입력한 다음 표준 모드로 들어가 보정을 시작합니다. Seahorse 게스트 포럼에 참여하세요.

템플릿 탭 아래의 XF Drive 아래에 저장된 템플릿을 엽니다. 열리면 시작을 클릭하여 보정을 시작하며 약 30분이 소요됩니다. 이 절차를 위한 미토콘드리아는 적색 골격근에서 분리하고, 끝이 약 3mm 잘린 200마이크로리터 피펫 팁으로 용액을 부드럽게 반복하여 미토콘드리아 기질 스톡을 부드럽지만 철저하게 혼합했습니다.

미토콘드리아 스톡의 단백질 농도를 측정한 후, resus는 숙시네이트 부패로 알려진 기질 혼합물 200마이크로리터당 10마이크로그램의 미토콘드리아 단백질을 현탁합니다. 미토콘드리아 기질 용액을 부드럽지만 철저하게 혼합하고, 같은 방식으로 끝이 약 3mm 잘린 200마이크로리터 피펫 팁으로 용액을 부드럽게 저어줍니다. Reeses Band, 나머지 기질 혼합물 각각의 200마이크로리터당 14마이크로그램의 미토콘드리아 단백질은 모든 미토콘드리아 단백질 기질 혼합물을 얼음 위에 놓습니다.

얼음 위에 24웰 세포 배양 플레이트를 놓고 각 미토콘드리아 기질 혼합물을 웰당 50마이크로리터씩 3회 로드합니다. 마이크로플레이트 기반 tric assay의 개발자는 미토콘드리아가 없는 최소 2개의 빈 웰을 남겨두는 것이 좋으며, 가급적이면 세포 배양 플레이트의 양쪽에 두는 것이 좋습니다. 세포 배양 플레이트를 섭씨 4도에서 20분 동안 2000G로 회전시켜 플레이트가 회전하는 동안 미토콘드리아를 웰에 부착합니다.

기질 용액을 섭씨 37도의 수조에서 예열합니다. 스핀이 완료된 후 각 기질 용액 450마이크로리터를 해당 웰 위에 조심스럽게 로드합니다. 반드시 실온에서 플레이트를 적재하십시오.

500마이크로리터의 기판 블랭크로 블랭크 웰을 로드합니다. 전자 유동 분석을 위해 지정된 웰에는 전자 유동 기질이 로드되어야 하며, 결합된 분석 블랭크 웰에는 모든 커플링 분석 기질이 로드될 수 있습니다. 450마이크로리터의 기판을 각각에 추가한 후 웰의 미토콘드리아 층을 20배 배율로 잘 보고 미토콘드리아가 단일 단층에 고르게 분산되도록 합니다.

이 예에서 볼 수 있듯이, 단층이 고르게 분포되어 있지 않은 것으로 보이는 이미지 웰은 oc 사후에 제거할 수 있습니다. 미토콘드리아 부착을 확인한 후 세포 배양 플레이트를 Respir metric assay 기기로 가져갑니다. 확인을 클릭합니다.

기계는 이전에 보정에 사용된 유틸리티 플레이트를 배출합니다. 유틸리티 플레이트를 제거하고 미토콘드리아가 포함된 세포 배양 플레이트를 트레이에 놓습니다. 세포 배양 플레이트의 파란색 노치는 트레이의 왼쪽 하단 모서리에 배치해야 합니다.

계속을 클릭하여 약 40분이 소요되는 분석 실행을 시작합니다. 실행이 완료된 후 화면에서 eject를 눌러 세포 배양 플레이트를 배출합니다. 플레이트가 배출되면 세포 배양 플레이트와 카트리지를 제거하고 폐기합니다.

화면에서 계속을 누르십시오. 실행은 데이터 파일에 XLS 파일로 자동 저장됩니다. 이 파일을 열고 Y one 마커 아래의 아래쪽 화살표를 눌러 디스플레이를 O2에서 OCR로 변경합니다.

그런 다음 옵션으로 표시된 속도 데이터 아래에서 중간 지점을 지점 간 비율로 변경합니다. 확인을 클릭합니다. 이러한 변경 사항을 적용하려면 화면 왼쪽 하단의 웰 그룹 모드 탭을 클릭하여 유사한 조건의 웰을 함께 그룹화합니다.

마지막으로 왼쪽 화면 중앙에 있는 표본 평균 표준 오차 탭을 클릭합니다. 이러한 명령은 분석 전에 설정할 수도 있습니다. 이러한 추적은 4가지 커플링 분석에 대한 산소 소비율 또는 OCR 대 시간을 나타냅니다.

첫 번째 패널은 상태 2, 호흡 또는 DP가 없는 경우의 호흡을 나타냅니다. A DP 주입 후 두 번째 패널은 상태 3 호흡이라고도 하는 최대 결합 호흡을 나타냅니다. 올리고 마이신 주입 후 세 번째 패널. A는 양성자 누출로 인한 호흡을 나타내며, 상태 4 오 호흡이라고도 합니다.

FCCP 주입 후 네 번째 패널은 State three U 호흡이라고도 하는 최대 비결합 호흡을 나타냅니다. 항마이신 A 주입 후 다섯 번째 패널은 산화 호흡의 억제를 나타냅니다. 모든 미토콘드리아 상태는 미토콘드리아 스톡과 미토콘드리아 기질 혼합물의 철저한 혼합과 접착 스핀 후 미토콘드리아의 단일 단층 달성으로 인해 최소 표준 편차를 갖습니다.

대조적으로, 각 웰에 불균등한 미토콘드리아를 로드하고 단일 단층의 미토콘드리아를 얻지 못하면 각 상태에서 표준 편차가 증가하며, 이는 분당 1, 500 ole 이상의 OCR 값을 보여주는 Blue trace에서 알 수 있듯이 점대점 속도 값의 하락으로 예시된 측정 기간 동안 호흡수 감소로 이어집니다. 빨간색 추적은 일관된 지점 간 속도를 표시하고 최대 OCR 값은 분당 1, 500 ole 미만임을 보여줍니다. 미토콘드리아 단백질 과부하는 또한 우물의 마이크로 챔버 내에서 산소를 고갈시킬 수 있으며, 따라서 측정 기간 동안 O2 값이 0에 가까워지고 각 연속 측정 후 시작 O2 값이 크게 감소하는 Blue Trace에서 표시된 바와 같이 각 연속 측정에 대한 OCR의 정확한 측정을 방해할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 미토콘드리아와 기질 용액을 혼합할 때 환자가 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 방법을 마스터하면 특정 기질 수송체의 약물 표적 처리가 미토콘드리아 산소 소비에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 추가 실험을 변형할 수 있습니다.