Name: 높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 마우스 골격근에서 소량의 고품질 미토콘드리아를 분리하여 높은 처리량 마이크로 호흡 측정을 수행하는 방법을. 이 기술은 약물과 단백질이 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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버지니아 공대의 프랄린 생명과학 연구소(Fralin Life Science Research Institute)와 대사 표현형 코어(Metabolic Phenotyping Core)가 이 작업을 지원했습니다.

동물 실험 기관 동물 관리에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서위원회를 사용했다. 1. 설정 (시간 : ~ 45 분) <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 미토콘드리아 (IBM) 1 IBM2 0.25 % 트립신, 절연 버퍼의 해동 냉동 저장합니다. </li><li> 유리 및 고순도 물 다음 70 % 에탄올에 해부 악기를 씻어. </li><li> 4 부 IBM1 1 부 트립신을 희석하여 0.25 % 트립신 재고에서 0.05 % 트립신 솔루션을 준비합니다. </li><li> 스크류 캡과 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 : (100 비율 1) 세포 용해 버퍼와 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 억제제 칵테일을 섞는다. </li><li> 분취 량 5 ml를 15 ml의 플라스틱 튜브에 0.05 % 트립신 (5 ㎖ / 마우스). </li><li> 설정된 모터 80 RPM으로 조직 균질기를 구동. </li></ol> 골격근 미토콘드리아 2. 분리 (시간 : ~ 90 분) <ol><li> CO 2로 마우스를 안락사 </su자궁 경부 전위 다음에 B&gt; 흡입,. </li><li> 다음 단계에 설명 된대로 가자미근 (~ 75-100 mg의 총)을 포함하는 대퇴사 두근과 비복근 근육, 붉은 근육을 제거합니다 : <ol><li> 마우스쪽으로 피부 껍질. </li><li> 대퇴사 두근 원점을 통해 지방 패드를 제거합니다. 뾰족한 가위로 슬개골에 부착 된 대퇴사 두근 건을 잘라. 참고 : 대퇴사 두근은 근위 대퇴골의 앞쪽 부분에 자사의 해부학 적 위치로 식별됩니다. </li><li> 뼈에서 대퇴사 두근을 해방, 대퇴 동맥을 피하면서 천천히, 뼈와 대퇴사 두근의 건막을 싹둑. 대퇴사 두근 근육을 해방하고 냉장 PBS의 대퇴사 두근 근육을 배치 대퇴골에 원점에서 뾰족한 가위로 힘줄을 잘라. </li><li> 가위로 대퇴사 두근을 통해 눈에 보이는 지방 조직을 제거합니다. 그래서 대퇴골 위에 놓인 된 근육의 부분이 U를 향하도록 통해 대퇴사 두근 플립피. 패닝의 움직임에 집게로 대퇴사 두근 근육을 엽니 다. 냉각 IBM1 5 mL를 넣은 비커에 뾰족한 가위와 장소 각 로브에서 두 개의 눈에 보이는 붉은 근육 부분을 제거합니다. 참고 : 대퇴사 근육 각 엽의 측면 가장자리 근처에있는 붉은 근육의 스트립 두 엽으로 나타납니다. </li><li> 뾰족한 가위로 아킬레스 건을 덮는 피부를 잘라 마우스 향해 피부를 벗겨. 노출 아킬레스 건을 잘라 마우스의 몸으로 근육 껍질. </li><li> 비복근을 해방하고 냉장 PBS에 그 힘줄에 부착 된 비복근을 배치 할 뾰족한 가위로 대퇴골의 외측과 내측 과두의 힘줄을 잘라. </li><li> 이상 비복근 플립과 가자미 근육을 벗겨 차게 IBM1 5 mL를 포함하는 비커에 넣습니다. 팬 비복근을 엽니 다. 뾰족한 가위로 3 종류의 시각적 붉은 근육 부분 (두 측면과 하나의 내측 표면 빨간색 스트립)를 제거S 및 냉장 IBM1 5 ㎖을 함유하는 비이커에 옮긴다. </li></ol></li><li> (단계 2.2에 기재된 바와 같이) 마우스의 다른 레그에서 적색 근육의 또 다른 ~ 75 내지 100 mg의 분리하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 및 세포 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, 1 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 배치 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 1 % 소듐 도데 실 설페이트, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % 폴리 옥시 에틸렌 (9) 노닐 페닐이. 즉시 블 롯팅 웨스턴에서 나중에 사용하기 위해 액체 질소에서이 제 2 샘플을 플래시 동결 분지 (단계 6.1 참조). </li><li> 큰 양동이에 얼음에 미리 냉장, 평면 플라스틱 표면을 놓습니다. 플라스틱 표면에 IBM1 한 방울을 붓고 IBM1 방울의 단면 붉은 근육 (단계 2.2.4과 2.2.7)을 모두 배치 핀셋을 사용합니다. 변경 면도기 3 단일 에지 면도날마다 40 초를 사용하여 2 분 동안 근육 조직을 말하다. </li><li> 제 위에 플라스틱 표면을 유지함으로써 새로운 IBM1 5 ㎖와 새로운 비이커 다진 조직을 이동시켜전자 비커와 면도날로 비커에 근육을 긁어. 이 솔루션을 가지고 50 ML 원뿔 튜브에 배치 된 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 배출. </li><li> 섬세한 작업 와이퍼와 조직을 가릴 후 0.05 % 트립신 용액 5 ㎖로 옮긴다. 작업 와이퍼에서 조직을 제거하는 핀셋을 사용합니다. </li><li> 0.05 % 트립신 용액에서 30 분 동안 얼음에 근육 조직을 배양한다. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 200 XG에 15 ML 원뿔 튜브 포함 트립신 / 근육 혼합물을 스핀. </li><li> 폐기물 용기에 트립신 뜨는을 붓고 얼음 3 ㎖ 차가운 IBM1와 펠렛을 재현 탁. 45 ㎖의 유리 균질 튜브에 조직을 전송합니다. 나머지 샘플을 수집하고 유리 균질 관이를 추가하는 또 다른 1.5 ml의 IBM1에 15 ml의에게 원뿔 튜브를 씻어. </li><li> 유리 균질이 비커 내에서 최소한의 이동 때문에 얼음 비커 또는 플라스틱 용기 충전 중간에 유리 균질 튜브를 놓습니다. </li><li&gt; 80 rpm으로 10 패스와 모터 구동 조직 균질에 부착 된 PTFE와 유 봉, 조직 / IMB1 혼합물을 균질화. ~ 2 초 동안 각 패스의 바닥을 잡으십시오. </li><li> 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 조직 파쇄 옮기고 IBM1 6.5 ml의 균질화 유리 튜브를 헹군다. 조직 균질 물을 포함하는 15ml의 원뿔형 튜브에 IBM1 붓는다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 700g로 15 ml의 원추형 튜브 스핀. 부드럽게 유리 고강도 원심 분리기 튜브에 뜨는을 부어 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 8,000 XG에서 위의 단계에서 뜨는 스핀. </li><li> IBM1 상층 액을 제거하고 천천히 IBM2 500 μl를 추가하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 피펫 팁의 끝을 잘라 부드럽게 혼합 운동을 교반 IBM2에 펠릿을 균질화. 펠렛가 완전히 정지 한 후 혼합물에 IBM2의 또 다른 4.5 ML을 추가합니다. T와 같은 더 큰 펠릿 조각을 파괴하면서 과도한 분쇄를 피하십시오 : 주자신은 미토콘드리아의 세포막에 손상을 줄 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 8,000 XG에 IBM2 / 조직 파쇄 스핀. 주의 :이 단계는 총 단백질 함량에 기여할 수있다 잔류 BSA 4 단계 이후에 격리 미토콘드리아 단백질보다 정확한 정량 깨끗한 고강도 원심 분리 튜브에서 반복 될 수있다. </li><li> 부드럽게 뜨는 및 제거,하지만 완전히 차단의 포인트 피펫 팁과 IBM2의 두 25 μL 단위를 추가하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 부드럽게 저어 IBM2 25 μL를 각각 첨가 한 후 펠렛을 섞는다. 얼음이 미토콘드리아 주식을 놓습니다. </li></ol> 전체 조직 해물 3. 균질화 (시간 : ~ 45 분; 단계에서 수행 할 수 있습니다 7) <ol><li> 즉, 단계 230에서 액체 질소에 넣고에서 근육을 제거하고 완전 해동 될 때까지 실온에서 배양한다. </li><li> 뾰족한 가위로 얼음 ~ 30 초 동안 조직을 말하다. </li><li> Zirco의 두 100 μL 개만 추가다진 조직을 포함 단계 3.2에서 스크류 캡으로 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 천년 산화물 비즈. 4-6 (매체 설정)의 속도 설정에서 3 개의 5 분주기를 이용하여 비드 밀 조직 균질 기에서 균질화 조직. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 단계 3.3에서 혼합물을 스핀. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스핀 및 전송 후 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 취소하고 얼음에 뜨는을 배치합니다. </li></ol> 4. 단백질 결정 (시간 : ~ 30 분) <ol><li> 제조업체의 사양에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 전체 조직 용 해물 (단계 3.4) 및 미토콘드리아 스톡 (단계 2.17)의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 5. 미토콘드리아 막 무결성; 구연산 합성 효소 (CS) 활동 (시간 : ~ 15 분) <ol><li> 고순도 물에 미토콘드리아 주식의 20 희석 : 두 개의 1을 확인합니다. 더하다하나의 샘플에 트리톤 100-X의 0.1 % 및 낮은 설정 (765 와트, 2의 진폭)에 그것을 초음파 처리. 얼음에 다른 희석 둡니다. 초음파 후 얼음에 샘플을 돌려줍니다. </li><li> 시트 레이트 신타 제와 분석을 수행 모두 비 초음파 처리하고, 이전에 기술 된 바와 같이 (11, 12)을 분광 분석을 이용하여 미토콘드리아 희석액 초음파. </li><li> 다음 식을 사용하여 그대로 미토콘드리아 막의 비율을 결정 : (비 초음파 CS 활성 ÷ 초음파 CS 활성) * 100 </li></ol> N은 100- (퍼센트 위에서 달성) 6. 미토콘드리아 격리 품질; 웨스턴 블로 팅 (시간 : 실험실 프로토콜에 따라) <ol><li> 이전 12 설명 된대로 전체 조직 해물과 격리 된 미토콘드리아에 웨스턴 블로 팅을 수행합니다. 참고 : GAPDH에 대한 사용 차 항체 (1 : 1000 희석 5 %의 BSA / TBS-T) 및 COXIV (1 : 1,000 희석 5 % 무 지방우유 / TBS-T 각각 반 염소, 토끼 이차 항체 (1 다음에) : 10,000). </li></ol> 7. 호흡계 분석 실행 (시간 : ~ 90 분) <ol><li> 전술 한 바와 같이 마이크로 기반 O 2 소비량 측정 기술을 이용하여 원하는 분석을 수행 호흡계 (컴패니언 문서 및 로저스 외 8 참조). </li><li> 주 4O (RCR)에 의해 상태 3 분할 또는 주 4O 의해 주 3U 나누어 호흡 조절 비율 (RCR)를 결정한다. RCR을 결정할 때 포인트 - 투 - 포인트 흔적에서 중간 (평균) 점, 또는 가장 높은 (주 3), 저렴한 가격 (주 섭씨 40도)를 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

George Rogers는 이 프로토콜이 수정된 기기를 생산하는 Seahorse Bioscience의 직원입니다.

본원에 제시된 방법은 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 미토콘드리아로부터 분리 절차의 상세한 설명을 제공한다. 이 분리 절차는 O 2 소비율, RCR 값, 최대 시트 레이트 신타 제 활성 및 면역에서 단백질 발현에 의해 입증되는 바와 같이 높은 작동, 순수한 미토콘드리아 (~ 450 μg의)을 수득 할 수있다. 중요한 것은,이 과정에서 분리 된 미토콘드리아는 높은 처리량을 가능 마이크로 기반 O 2 소비 기술 respirometirc 여러 분석에 사용될 수있다. 골격근의 미토콘드리아의 분리는 종종 결합 조직과 구조 단백질 7,16 주변에서 미토콘드리아를 해방 가혹한 방법을 필요로한다. 결과적으로, 미토콘드리아 막에 따라서 후속 respirome 미토콘드리아 동안 O 2 소비 활동 (및 정확도) 손상, 파괴 될 수있는⚻에 정해진 분석. 전술 한 프로토콜을 (7)에 ...

미토콘드리아의 주요 기능은 산화적 인산화로부터 ATP를 생성하는 것입니다. 그러나 미토콘드리아는 활성 산소 종의 생성 및 해독, 세포질 및 미토콘드리아 칼슘 조절, 세포 기관 이동, 이온 항상성 및 세포사멸 관여를 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 많은 중요한 세포 기능을 가지고 있습니다1,2. 따라서 기능 장애 미토콘드리아가 노화, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 암, 비만 및 당뇨병과 같은 많은 질병 병리학에서 역할을 한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다3,4. 중요한 것은 골격근 미토콘드리아가 특히 이러한 많은 병리에 관여한다는 것입니다3-5.
분리된 미토콘드리아를 사용하는 미토콘드리아 호흡 분석은 전자 전달 사슬 및 산화적 인산화 기능을 평가하고 신진대사를 조절하는 약물 및 단백질의 작용 메커니즘을 결정할 수 있도록 합니다. 미토콘드리아 분리 절차는 다양한 종의 여러 조직 및 세포 유형에 대해 존재합니다6,7. 그러나 이러한 절차는 고전적인 호흡 측정 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아 수율을 위해 많은 양의 조직/세포를 필요로 하는 경우가 많습니다. 
마이크로플레이트 기반 호흡기 분석기 분석은 최소한의 분리된 미토콘드리아를 사용하여 고처리량 측정을 가능하게 하며, 종종 웰당 몇 μg에 불과합니다8. 따라서, 우리는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석에 사용하기 위해 더 적은 양의 마우스 골격근에서 고품질 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 발표된 방법7의 변형을 제시합니다. 또한, 미토콘드리아 분리 제제의 품질과 미토콘드리아 막의 무결성을 확립하기 위한 방법이 제공됩니다. 골격근 미토콘드리아가 많은 병리학적 상태에 관여한다는 점을 감안할 때, 기계론적 기반 연구에서O2 소비량 측정은 생물 의학 연구에서 더욱 보편화되고 있습니다9,10.

<table><tbody><tr><td>Essentially Fatty</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acid Free- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td>EDTA 시그마 Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>자당</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-만니톨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>염화나트륨 백색 결정 또는 결정성 분말 &ge; 99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L3771&nbsp;</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>D6750&nbsp;</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌 (12) 노닐페닐 에테르, 분지형</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>단일 모서리 면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM 나일론 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>정지 프로테아제 & Phosphatse Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브(스크류 캡 포함</td><td>) Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>산화지르코늄 비드</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 항체 (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti- COXIV 항체</td><td>세포 신호</td><td>4844s</td><td>모든 미토콘드리아 내막 단백질은</td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure 당나귀, 안티 토끼 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>피루브산, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>4°C에 보관; 호흡량 측정 분석에서 사용하기 전에 C, pH 7.4, KOH</td></tr> 숙<tr><td>신산</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9512</td> 호흡량 분석 L(-) 말산, BioXtra, &ge에 <td>사용하기 전에 실온에서 보관, KOH와 함께 pH 7.4로 저장</td></tr><tr><td>; 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>실온에서 보관, 호흡량 분석에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지 L</td></tr><tr><td>-글루탐산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>실온에서 보관, 호흡량 분석에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지, 호흡량 분석</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지 <tr><td>Palmitoyl L-카르니틴 클로라이드 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>P1645</td><td>-20°C에서 보관</td></tr><tr><td>올리고마이신 A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)</td><td>시그마 알드리치</td><td>C2920</td><td>2-8 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>페닐히드라존</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (TLC), 분말 [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이세스 sp.에서 추출한 안티마이신 A.</td><td>시그마 알드리치</td><td>A8674</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>아데노신 5&프라임;-디포스페이트 모노칼륨 염 탈수 [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>-20 &deg에 저장; C, 호흡량 분석</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>에 사용하기 전에 KOH로 7.4까지 <tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>실온에서 보관</td></tr></tbody></table>

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

역기능 골격근의 미토콘드리아 노화, 비만과 형 당뇨병으로 관찰 변경된 대사의 역할을한다. 절연 미토콘드리아 제제로부터 미토콘드리아 호흡계 분석법은 약물 대사를 조절하는 단백질의 작용기구 (S)의 미토콘드리아 기능의 평가뿐만 아니라, 판정이 가능. 현재 분리 절차는 종종 호흡계 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아를 수득 조직 대량을 요구한다. 본원에 제시된 방법 (~ 450 μg의)는 높은 처리량 호흡 측정에 사용하기 위해 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 분리 할 수​​있는 방법을 고품질로 정제 미토콘드리아 설명한다. 우리는 우리의 분리 방법은 분광 시트르산 합성 효소 활성을 측정하여 92.5 ± 2.0 %의 미토콘드리아 손상을 산출 것으로 판정. 또한, 고립 된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석은 cytoso의 희미한 식의 결과LIC 단백질, GAPDH 및 미토콘드리아 단백질, COXIV의 강력한 표현. 단리 된 미토콘드리아에 띄는 GAPDH 밴드의 부재는 분리 과정 동안 비 미토콘드리아 소스로부터 조금 오염을 나타낸다. 가장 중요한 것은, O (2) 소비 마이크로 플레이트 기반 기술과 속도와 고도의 결합을 보여줍니다 결합 호흡계 분석을위한 호흡 조절 비율 (RCR) 결정의 측정 (RCR을, 모든 분석을위한&gt; 6) 및 기능 미토콘드리아. 결론적으로, 별도의 닦지 단계 첨가 및 상당히 이전에보고 된 방법의 모터 구동 균질화 속도를 감소시키는 것은 높은 기능 호흡 고도로 결합 미토콘드리아 결과 마우스 골격근의 소량으로부터 고품질 정제 미토콘드리아의 분리를 허용했다 마이크로 기반 respirometirc 분석 중.

시트 레이트 신타 제 활성은 시트 레이트 신타이 양막 미토콘드리아 현탁액으로 존재해서는 안 따라서 미토콘드리아 내막에 위치되고, 이후 막 무결성을위한 수단으로서 기능한다. (1)이 초음파에 비해 비 초음파 미토콘드리아 시료에 시트 레이트 신타 제 활성을 나타내는 도표 같은 격리에서 샘플. 시트 레이트 신타 제 활성의 유의 한 증가 미토콘드리아 결과 (P &lt;0.01)를 초음파 처리. 중요한 것은, 미토콘드리아의 92.5 ± 2.0 %는 격리 다음 그대로 있었다. 도 2는 고립 된 미토콘드리아 및 전체 골격근 조직 파쇄물에서 GAPDH 및 COXIV 발현을 나타낸다. GAPDH는 세포질에있는 단백질이지만 COXIV는 미토콘드리아 내막에있는 단백질 동안 또한 후에 핵 전좌에서 찾을 수있다. GAPDH와 COXIV의 발현은 전체 담배 마는에서 분명 있습니다UE 해물. GAPDH의 희미한 ...

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

본 비디오 논문의 전반적인 목표는 마이크로플레이트 기반의 tric 분석에 사용하기 위해 소량의 생쥐 골격근으로부터 고순도의 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 이 방법은 특정 약물과 단백질이 골격근의 미토콘드리아 산소 소비를 어떻게 조절하는지 기술하는 것과 같은 생의학 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존에 보고된 것보다 더 적은 양의 생쥐 골격근으로부터 고순도의 미토콘드리아를 분리할 수 있다는 점입니다.기관의 가이드라인에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 그런 다음 마우스를 옆으로 눕히고 끝이 뾰족한 가위를 사용하여 피부를 절개합니다. 대퇴골의 외측상과 부위를 덮도록 절개하십시오.피부를 마우스 방향으로 벗겨낸 후, 대퇴사두근 기시점 위에 위치한 지방 패드를 제거합니다. 다음으로, 슬개골에 부착된 대퇴사두근 건을 절단합니다. 대퇴동맥이 손상되지 않도록 주의하면서 뼈와 대퇴사두근 사이의 건막을 천천히 절개합니다.그런 다음 대퇴골의 기시점에서 힘줄을 절단하여 대퇴사두근을 분리하고, 대퇴사두근을 냉각된 PBS에 넣습니다. 가위를 사용하여 대퇴사두근 위의 가시적인 지방 조직을 제거합니다. 세척이 완료되면, 대퇴골 위에 놓여 있던 근육 부분이 위를 향하도록 대퇴사두근을 뒤집습니다.포셉을 사용하여 대퇴사두근을 부채꼴 모양으로 펼쳐 엽니다. 각 엽에서 보이는 붉은색 근육 부위 두 곳을 제거하여 5 mL의 냉각된 미토콘드리아 분리 완충액이 담긴 비커에 넣습니다.다음으로, 끝이 뾰족한 가위로 아킬레스건 위의 피부를 절개하고 피부를 마우스 방향으로 벗겨냅니다. 노출된 아킬레스건을 절단하고 근육을 마우스 몸통 방향으로 벗겨냅니다. 대퇴골의 외과와 내과 부위에서 건을 절단하여 비복근을 분리한 후, 건이 부착된 비복근을 차갑게 식힌 PBS가 담긴 접시에 넣습니다.비복근을 뒤집어 가자미근을 벗겨냅니다. 가자미근을 5 mL의 냉장 미토콘드리아 분리 완충액이 담긴 비커에 넣습니다.다음으로 실험자는 비복근(gastroc)을 절개하여 육안으로 확인되는 세 부분의 적색 근육을 제거했습니다. 여기에는 두 개의 외측 부위와 하나의 내측 표면 적색 띠가 포함됩니다. 적색 근육을 분리한 후, 5 mL의 냉각된 미토콘드리아가 들어 있는 비커로 옮깁니다.분리 완충액 1. 마우스의 반대쪽 다리에서 적색근 75~100 mg을 추가로 제거합니다. 방금 보여드린 과정을 반복합니다.동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 준비한 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일과 세포 용해 버퍼가 들어 있는 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 두 번째 다리에서 절제한 근육을 넣습니다. 웨스턴 블로팅에 사용하기 위해 두 번째 샘플을 즉시 액체 질소로 급속 동결시킵니다. 큰 버킷의 얼음 위에 미리 가열된 평평한 플라스틱 표면을 놓습니다.그 다음, 플라스틱 표면에 미토콘드리아 분리 완충액 1을 한 방울 떨어뜨리고, 핀셋을 사용하여 절단된 적색근 전체를 분리 완충액 방울 위에 올립니다. 외날 면도날을 사용하여 근육 조직을 2분 동안 잘게 다지며, 40초마다 새롭고 날카로운 면도날로 교체합니다. 다져진 조직을 5 mL의 신선한 미토콘드리아 분리 완충액이 담긴 새 비커로 옮깁니다.분리 완충액을 처리합니다. 그다음 용액을 50 mL 원심 분리 튜브 위에 놓인 100 micron 세포 스트레이너로 걸러냅니다. 조직을 정밀 와이퍼로 가볍게 닦아낸 후, 0.05% trypsin 용액 5 mL에 옮깁니다.핀셋을 사용하여 태스크 와이퍼(task wiper)에 남아 있는 조직을 모두 제거하여 트립신에 추가합니다. 근육 조직을 트립신 용액에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 4°C에서 200 ×g로 3분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 트립신 상층액을 폐기물 용기에 붓고 펠렛을 3 mL의 얼음처럼 차가운 mitochondria isolation buffer one으로 재현탁합니다. 그런 다음 조직을 45 mL 유리 균질기 튜브로 옮깁니다. 15 mL 원추형 튜브를 1.5 mL의 mitochondria isolation buffer one으로 한 번 더 헹구어 남아 있는 샘플을 모두 모아 유리 균질기 튜브에 추가합니다.다음으로, 유리 균질기 튜브를 얼음이 절반 정도 채워진 비커 또는 플라스틱 용기에 넣습니다. 이때 유리 균질기가 비커 내에서 최소한으로 움직이도록 합니다. 모터 구동 조직 균질기에 부착된 폴리테트라플루오로에틸렌 페스틀을 사용하여 샘플을 균질화합니다.80 RPM에서 10회 균질기 처리를 합니다. 매 통과 시 하단부에서 약 2초간 유지합니다. 그 후 조직 균질액을 새로운 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다.그 후 유리 균질기 튜브를 6.5 milliliters의 미토콘드리아 분리 완충액 1로 헹굽니다. 해당 완충액을 나머지 조직이 들어 있는 15 milliliter 원추형 튜브에 붓습니다. 균질화합니다. 시료를 4 °C에서 700 ×g로 10분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 고강도 유리 원심분리 튜브에 조심스럽게 붓고 펠릿은 폐기합니다.다음으로, 상등액을 4 °C에서 8,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 미토콘드리아를 펠렛화하기 위해 상등액을 제거하고, 미토콘드리아 분리 완충액 2 500 µL를 천천히 첨가하여 펠렛을 재부유시킵니다. 이때 피펫 팁의 끝을 자르고 혼합 및 교반 동작을 통해 완충액 내의 펠렛을 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 미토콘드리아 분리액 4.5 mL를 추가로 첨가합니다.혼합물에 Buffer two를 추가합니다. 펠렛이 완전히 현탁되면, 균질액을 4°C에서 8,000 ×g로 10분간 원심분리하여 미토콘드리아를 다시 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고, 끝부분을 자른 피펫 팁을 사용하여 mitochondria isolation Buffer two를 25 µL씩 두 번 나누어 가하며 펠렛을 부드럽지만 완전히 재현탁합니다. 버퍼를 25 µL씩 추가할 때마다 펠렛을 부드럽게 젓고 섞어줍니다.완료되면, 이 미토콘드리아 스톡을 얼음에 둡니다. 고순수 증류수에서 미토콘드리아 스톡을 1:20으로 희석하여 두 개의 별도 샘플을 만듭니다. 한 샘플에 Triton 100 x를 0.1% 첨가하고 낮은 설정에서 10초 동안 초음파 처리합니다.다른 희석액은 얼음 위에 그대로 두고, 초음파 처리한 샘플을 다시 얼음에 넣습니다. 초음파 처리 후, 표준 기술을 이용한 광도 측정법으로 초음파 처리를 하지 않은 미토콘드리아 희석액과 초음파 처리한 미토콘드리아 희석액 모두에 대해 citrate synthase 분석을 수행하며, 함께 제공된 텍스트 프로토콜의 방정식을 사용하여 온전한 미토콘드리아 막의 백분율을 결정합니다. 미토콘드리아를 초음파 처리하면 citrate syntase 활성이 통계적으로 유의하게 증가합니다.초음파 처리하지 않은 미토콘드리아 샘플의 Citrate syntase 활성을 초음파 처리한 샘플과 비교한 결과, 분리 후 미토콘드리아의 92.5%가 온전한 상태였음을 보여줍니다. 전체 조직 용해물에서는 ga. DH와 COX four의 발현이 뚜렷하게 나타나며, 분리된 미토콘드리아에서도 Cox four의 발현이 관찰됩니다. GA DH의 밴드는 희미하게만 나타나는데, 이러한 결과는 분리 과정 중 비미토콘드리아 성분의 오염이 거의 없이 미토콘드리아가 잘 분리되었음을 나타냅니다.이 절차를 수행할 때, 미토콘드리아 스톡을 주의해서 다루는 것이 중요하며, 본 절차 이후에 절대 볼텍싱하거나 격렬하게 혼합해서는 안 됩니다. 분리된 미토콘드리아에서 특정 중재가 활성 산소종 생성에 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 활성 산소종 생성을 측정하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서...

골격근에서 Mitochondrial 절연

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다.  따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

골격근에서 Progenitors의 정화

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

배우세요 마우스 골격근에서 소량의 고품질 미토콘드리아를 분리하여 높은 처리량 마이크로 호흡 측정을 수행하는 방법을. 이 기술은 약물과 단백질이 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

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