높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

이 비디오 기사의 전반적인 목표는 마이크로플레이트 기반 tric assay에 사용하기 위해 소량의 마우스 골격근에서 고품질 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 이 방법은 특정 약물 및 단백질이 골격근, 미토콘드리아 산소 소비량을 조절하는 방법을 설명하는 것과 같은 생물 의학 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고품질 미토콘드리아가 이전에 보고된 것보다 더 적은 양의 마우스 골격근에서 분리될 수 있다는 것입니다.

기관 지침에 따라 쥐의 안락사를 수행합니다. 그런 다음 마우스를 옆으로 눕히고 끝이 가는 가위를 사용하여 피부를 절개합니다. 대퇴골의 외측 상과를 오버레이합니다.

마우스 쪽으로 피부를 벗긴 다음 대퇴사두근 원점 위에 있는 지방 패드를 제거합니다. 다음으로, 슬개골에 부착된 대퇴사두근 힘줄을 자릅니다. 대퇴 동맥을 피하면서 뼈와 대퇴사두근 사이의 apo 신경증을 천천히 잘라냅니다.

그런 다음 대퇴골의 원점에서 힘줄을 잘라 대퇴사두근을 해방시키고 대퇴사두근을 냉각된 PBS에 넣습니다. 가위를 사용하여 대퇴사두근 위에 보이는 지방 조직을 제거합니다. 깨끗해지면 대퇴골 위에 있는 근육 부분이 위를 향하도록 대퇴사두근을 뒤집습니다.

부채질하는 동작으로 집게로 대퇴사두근을 엽니다. 각 엽에서 눈에 보이는 두 개의 붉은 근육 부분을 제거하고 5ml의 차가운 미토콘드리아가 들어 있는 비커에 넣습니다. 격리 버퍼.

다음으로, 끝이 가는 가위로 아킬레스건 위의 피부를 자르고 쥐 쪽으로 피부를 벗겨냅니다. 노출된 아킬레스건을 자르고 마우스의 몸통 쪽으로 근육을 벗겨냅니다. 대퇴골의 측면 및 내측 과두에서 힘줄을 잘라 비복근을 해방시키고 힘줄에 부착된 비복근을 식힌 PBS로 채워진 접시에 넣습니다.

비복근을 뒤집어 가자미근을 벗겨냅니다. 가자미근을 5ml의 차가운 미토콘드리아가 들어 있는 비커에 넣습니다. 격리 버퍼.

다음 팬 한 명이 위복선을 열고 세 개의 시각적 붉은 근육 부분을 제거했습니다. 두 개의 측면 부분과 하나의 내측 표면 빨간색 스트립이 있습니다. 일단 분리되면, 5ml의 차가운 미토콘드리아가 들어 있는 비커로 붉은 근육을 옮깁니다.

절연 버퍼 1. 마우스의 다른 쪽 다리에서 75-100mg의 붉은 근육을 추가로 제거합니다. 방금 보여준 과정을 반복합니다.

두 번째 다리에서 절개된 근육을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일과 함께 세포 용해 완충액을 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비합니다. 즉시 플래시, 웨스턴 블로팅에 사용하기 위해 액체 질소에 두 번째 샘플을 동결합니다. 미리 치유된 평평한 플라스틱 표면을 큰 양동이에 담긴 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 미토콘드리아 분리 버퍼 한 방울을 플라스틱 표면에 붓고 핀셋을 사용하여 절제된 모든 붉은 근육을 분리 방울에 놓습니다. 완충기. 단면 면도날을 사용하여 2분 동안 근육 조직을 다진 후 40초마다 새로운 날카로운 면도날로 교체합니다. 다진 조직을 5ml의 신선한 미토콘드리아가 있는 새 비커로 옮깁니다.

절연 버퍼 1. 그런 다음 용액을 가져 와서 100 밀리리터 원추형 튜브에 놓인 50 미크론 셀 스트레이너를 통해 배출합니다. 섬세한 작업용 와이퍼로 조직을 닦아낸 다음 5ml의 0.05% tryin 용액으로 옮깁니다.

핀셋을 사용하여 작업 와이퍼에 남아 있는 조직을 제거하고 트립신에 추가합니다. 트립신 용액의 근육 조직을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3분 동안 200배 G로 샘플을 원심분리합니다.

원심분리 후, 트립신 수피네이트를 폐기물 용기에 붓고 펠릿을 3ml의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 분리 완충액 1로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 조직을 45밀리리터 유리 균질기 튜브로 옮깁니다. 15ml 원뿔형 튜브를 다른 1.5ml의 미토콘드리아 분리 버퍼로 헹구어 남은 샘플을 수집하고 이를 유리 균질화 튜브에 추가합니다.

다음으로, 유리 균질화 튜브를 얼음으로 반쯤 채워진 비커나 플라스틱 용기에 넣습니다. 따라서 유리 균질화기는 비커 내에서 최소한으로 움직입니다. 모터 구동 조직에 부착된 폴리테트라플루오로에틸렌 유봉으로 샘플을 균질화합니다.

80 RPM에서 10을 가진 균질화기. 각 패스의 하단을 약 2초 동안 유지합니다. 그런 다음 조직 균질액을 새로운 15mm 원추형 튜브로 옮깁니다.

그리고 유리 균질화 튜브를 6.5ml의 미토콘드리아 분리 완충액으로 헹굽니다. 나머지 조직이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 완충액을 붓습니다. 균질화. 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 700배 G로 회전시킨 다음 supinate를 고강도 유리 원심분리기 튜브에 부드럽게 붓고 펠릿을 버립니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 10분 동안 8, 000번 G로 스내트를 돌립니다. 미토콘드리아를 펠릿화하려면 스내트를 제거하고 500마이크로리터의 미토콘드리아 분리 완충액 2개를 천천히 첨가하여 펠릿을 재현탁탁하고, 피펫 팁의 끝을 잘라낸 다음 혼합 및 교반 동작으로 완충액의 펠릿을 부드럽게 균질화합니다. 그런 다음 4.5ml의 미토콘드리아 분리를 더 추가합니다.

혼합물에 완충기 2 펠릿이 완전히 중단된 후에, 다시 미토콘드리아를 펠릿 하기 위하여 8, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 G에 균질산염을 회전시키십시오. S 상등액을 제거하고 미토콘드리아 분리를 2 25 μlit 단위로 추가하여 펠릿을 부드럽지만 완전히 재현탁합니다. 버퍼 2는 끝이 잘린 피펫 팁을 사용하여 25마이크로리터의 버퍼를 사용할 때마다 펠릿을 부드럽게 저어주고 혼합합니다.

완료되면 이 미토콘드리아 스톡을 얼음 위에 놓습니다. 고순도의 물에 미토콘드리아 스톡을 1-20회 희석하여 두 개 만듭니다. 하나의 샘플에 Triton 100 x의 0.1%를 첨가하고 낮은 설정에서 10초 동안 초음파 처리합니다.

다른 희석액은 얼음에 남겨두고 초음파 처리 된 샘플을 얼음에 다시 넣습니다. 초음파 처리 후, 표준 기술을 사용하여 광도 분석을 사용하여 nons 초음파 처리 및 초음파 처리 된 미토콘드리아 희석으로 시트레이트 합성 효소 분석을 수행하고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 제공된 방정식을 사용하여 손상되지 않은 미토콘드리아 막의 백분율을 결정하십시오. 미토콘드리아를 신디케이트하면 시트르산염 신타제 활성이 통계적으로 유의하게 증가합니다.

초음파 처리 된 샘플과 비교하여 nons 초음파 처리 된 미토콘드리아 샘플에서 구연산염 syntase 활성은 미토콘드리아의 92.5 %가 ga의 분리 발현 후 손상되지 않았 음을 보여줍니다. DH 및 COX 4는 Cox four의 분리 된 미토콘드리아 발현에서 전체 조직 용해물에서 분명합니다. GA DH의 희미한 띠만 분명하지만, 이러한 발견은 분리 절차 동안 비 미토콘드리아 구성 요소로부터의 오염이 거의 없이 양호한 미토콘드리아 분리를 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 미토콘드리아 스톡을 조심스럽게 다루고 이 절차에 따라 소용돌이치거나 세게 혼합하지 않는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 반응 작용 종 생산 측정과 같은 다른 방법은 개입이 고립된 미토콘드리아에서 활성 산소 종 생산에 영향을 미치는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.