미생물 커뮤니티를 공부

본 절차의 전반적인 목표는 개별 박테리아와 단일 곰팡이 사이의 상호작용을 연구하기 위한 모델을 구축하는 것입니다. 이러한 방식은 상호 교신과 종간 대화에 어떤 요인들이 관여하는지와 같은 병원체 상호작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 in vivo 모델에서 생성된 데이터가 임상적 관련성을 갖는다는 점입니다.

곰팡이를 비강 내로 주입하려면, 먼저 멸균 PBS에서 C.albicans를 ml당 2 × 10⁶ CFU로 희석합니다. 다음으로, 성체 저장성 마우스의 정위 반사 소실을 확인한 후, 200 µL 피펫으로 곰팡이 현탁액을 최소 50 µL 흡입합니다. 이제 한 손으로 마우스를 잡고, 동물을 돌려 복부가 위를 향하도록 등으로 눕힙니다.

마우스가 위치를 잡으면, 마우스를 잡고 있는 손의 검지로 머리를 받치고 엄지로 턱을 닫은 상태에서 피펫 팁을 동물의 코 가까이로 이동시킵니다. 그런 다음, 50 µL의 곰팡이 용액 한 방울을 콧구멍 위에 조심스럽게 분사하여 마우스의 자발적 호흡을 통해 흡입되도록 합니다. 이후 마우스가 완전히 회복될 때까지 케이지에 단독으로 배치합니다.

C.albicans 감염 4일 후, 안락사시킨 동물의 복부를 면도하고 노출된 피부를 에탄올로 멸균합니다. 다음으로 가위를 사용하여 흉골부터 복부 중간까지 피부를 절개합니다. 그런 다음 정중선 양쪽의 늑골을 따라 절개선을 확장하고 흉부 양측의 피부를 젖힙니다.

늑골이 보이면 흉골 양측에서 쇄골 방향으로 수직 절개를 가하고, 흉골을 이용해 전흉벽 전체를 뒤로 젖혀 심장과 폐를 시각화합니다. 그 다음, 헤파린 처리된 주사기를 사용하여 심실간동맥 옆의 심장을 천자하고, 최소 500 µL의 혈액을 채취합니다. 채취한 혈액 샘플은 얼음 위에 놓아 보관합니다.

그다음, 기관을 노출시키기 위해 경부 정중선 절개를 실시합니다. 기관 주변의 근막을 조심스럽게 박리한 후, 기관 아래에 봉합사를 배치합니다. 이어서 20-gauge 변형 가바지 바늘(modified gavage needle)을 사용하여 기관에 카테터를 삽입하고, 앞서 배치한 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다.

기관지폐포 세척술을 수행하려면, 차갑게 냉장 보관한 PBS 500 µL를 폐에 조심스럽게 주입하십시오. 그런 다음 세척액을 흡입하여 얼음 위에 놓인 2 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 500 µL 샘플을 두 번 더 수집한 후, 흉부에서 폐를 적출하고 폐 조직 일부를 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣어 즉시 -80 °C에서 보관하십시오.

그다음, PBS가 들어 있고 얼음 위에 놓인 미리 무게를 잰 용혈 튜브에 또 다른 폐 조직 조각을 넣습니다. 마지막으로, 복부 왼쪽에 절개창을 냅니다. 비장을 1 mL의 PBS가 들어 있는 두 번째 용혈 튜브에 채취하여 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

마우스 한 마리당 5 × 10⁵ CFU의 C.albicans를 비강 내로 투여하여 4일간의 지속성 모델을 구축합니다. 이 4일 동안 마우스의 체중은 증가하지만, 폐 손상은 나타나지 않습니다. 그러나 접종균의 CFU가 증가함에 따라 폐 손상 또한 심화됩니다.

감염 후 24시간에서 36시간 사이에 최대 폐 손상이 관찰되었습니다. 이와 대조적으로 세균 수치는 24시간마다 밀리리터당 1 log CFU씩 감소하지만, 누적 세균 확산은 매일 증가하는 것으로 나타났습니다. 감염된 마우스에서 수집한 기관지폐포 세척액에서는 호중구가 광범위하게 모집되었으며, 분획 세포 수 측정 결과 침윤된 면역 세포 집단의 90%는 호중구, 10%는 대식세포 및 림프구인 것으로 확인되었습니다.

이 절차 이후에 기관지폐포 세척액 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 염증 반응의 특성에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 Pseudomonas 군집 형성 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 발광 Candida를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 비말 오염을 방지하기 위해 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 이 절차를 수행하는 동안 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.