Name: 미생물 커뮤니티를 공부 생체 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델 칸디다 알비 칸스 및 녹농균 항공에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 학습하세요 Candida albicans와 Pseudomonas aeruginosa의 상호작용을 연구하는 생체내 마우스 모델 구축 방법을. 이 기법은 호흡기 감염의 병원성 메커니즘을 이해하는 데 임상적 관련성이 높은 데이터를 제공합니다.

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저자는 릴 대학과 릴 파스퇴르 연구소, 특히 동물 사육, 사육 안전 및 축산을 담당하는 티에리 샤사(Thierry Chassat)와 장 피에르 드카벨(Jean-Pierre Decavel)에게 감사를 표합니다. 이 연구는 "Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française"(SPILF)의 지원을 받았습니다.

동물 실험에 대한 지역 윤리 지역위원회는 임상 연구 지침에 국내 및 국제 동물 보호 및 사용에 따라,이 방법을 승인했다. 1. 샘플 컬렉션 <ol><li> 샘플 저장 <ol><li> 저하를 방지하기 위해 냉동 저장 될 때까지 20 ° C 또는 얼음에 -에 저장 즉시 모든 샘플을 수집하고. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 성능을 향상시키기 위해 얼음 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 배치했다. </li></ol></li><li> 외과 <ol><li> 오토 클레이브를 사용하여 모든 수술 장비 소독. 참고 : 가능하면이 교차 오염을 방지하기 위해 복부 및 흉부 단계는 악기의 두 가지 세트를 사용하는 것이 좋습니다. 필수 해부 장비는도 4a에 자세히 설명되어 있습니다 </li></ol></li></ol> 2. 마우스, 세균과 효모 균주 <ol><li> 다시 동물의 지방의 사용을 준수 하우스 마우스때문에 바이오 안전성 레벨 2 미생물의 사용으로 바이오 안전성 레벨 2 주택 시설, 음식과 물을 적량으로, 케이지 당 5 마우스를 초과하지 않고 통풍이 랙에서 검색위원회 지침 : P. 녹농균 및 C 알비 칸스. </li><li> 40 % 글리세롤 배지에서 -80 ° C에 보관 균주. <ol><li> 10 μL 접종 루프를 사용하여 멸균 루리아 - 베르 타니 국물 3 ㎖를 포함하는 문화 튜브에 냉동 재고에서 직접 박테리아를 추가합니다. 궤도 흔들림 (400 RPM)와 37 ° C 점안 전날에 O / N를 남겨주세요. </li><li> 원심 분리하여 수확 박테리아 5 분 2,000 XG에. </li><li> 적절한 폐쇄 생물 학적 폐기물 처리에 뜨는을 대기음. 문화 튜브의 바닥에 흰색 부착 된 펠렛을 준수하십시오. </li><li> 세척하고 5 ㎖의 PBS를 사용하여 펠렛을 중지. </li><li> 반복 두 번째 세척을 수행하는 두 번째 시간을 2.2.3 2.2.2 단계를 반복합니다. </li><li> 1 ㎖의 PBS를 사용하여 세균 펠렛을 재현 탁그리고 간단한 텍싱. </li><li> 광학 밀도 측정기를 사용하여 600 nm에서 광 농도계를 사용하여 접종 밀도를 결정합니다. 0.9의 밀도 PAO1 대 109 CFU / ㎖에 대응하고, 따라서 희석. 주 :이 결과는 교정 접종원 연속 희석액의 농도를 결정함으로써, 각 사용 균주에 대해 획득되어야한다. </li><li> 시리얼 로그 희석하여 접종을 확인하고 브로 모 크레졸 퍼플 한천 (BCP) 접시와 O / N 문화에 각 희석 100 μl를 접시. 각 마우스에게 ml의 당 1 × 10 8 8 X10 2 CFU (마우스 당 5 × 10 6 7 X10 1 CFU)를 포함하는 용액의 비강 50 μl를 관리합니다. </li></ol></li><li> 사용 C. 기준 변형으로 알비 칸스 SC5314. -80 ℃에서 40 % 글리세롤 배지에서 균주를 보존. <ol><li> 세균 오염을 방지하고 더 수를 용이하게하기 위해 0.015 %의 아 미카 신으로 효모 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 국물을 보충합니다. </li><li> &amp; 10을 사용하여 효모 추가# 181; 37 ° C에서 아 미카 신에 O / N 보충 준비 YPD-국물에 L 접종 루프. </li><li> 5 분 2,000 XG에서 원심 분리하여 수확 효모. </li><li> 적절한 bioharzard 폐기물 처리에 뜨는을 제거합니다. 화이트 부착 펠릿 문화 튜브의 바닥에서 관찰되어야한다. </li><li> PBS 세척하고 간단한 텍싱 5 mL를 이용하여 세균 펠렛을 중단하고. </li><li> 반복 두 번째 세척을 수행하는 두 번째 시간을 2.2.3 2.2.2 단계를 반복합니다. </li><li> PBS 및 간단한 텍싱 1 ㎖를 사용하여 펠릿을 재현 탁. </li><li> 40 배 배율에서 표준 현미경을 사용하여 Mallassez의 hematocytometer를 믿고 의해 접종의 크기를 결정합니다. 주 : (효모의 개수 × 105) / (Mallassez의 hematocytometer를 계산에 그리드 사각형의 수) : 농축 (CFU / ㎖)에 다음 식을 이용하여 얻어진다. </li><li> 해당 솔루션에 포함 된 확인 10-5 및 10-6 직렬 로그 희석 확인 2 × 10 6 CFU / ㎖. </li><li> YPD 한천 플레이트 접시는 0.015 %의 아 미카 신 보충. </li></ol></li></ol> C. 3. 항공 식민 알비 칸스 참고 : 환경에 적응 한 후, 마우스는 하루에 두 번 무게가있다. <ol><li> 흄 후드에서, 4cm X 4cm 가제 (오픈 드롭 기술) (14) 상 세보의 보증금 500 μL. <ol><li> 즉시 약 750 ml의 유도 챔버의 바닥에 거즈를 놓습니다. 즉시 동물과 거즈 사이의 직접 접촉을 방지하기 위해 거즈 위에 메쉬 제기 플랫폼을 배치합니다. </li><li> 밀폐 뚜껑을 닫고 챔버 세보의 확산을 허용하는 1 분 2를 기다립니다. </li><li> 플랫폼과 가까운 뚜껑을 메쉬 케이지에서 마우스를 전송합니다. 보존자가 호흡 빛 마취는 30-45 초에 달성해야한다. </li><li> 마우스가 f를 제거 할 수있는 점에서 반사를 바로 잡고의 손실을 관찰하여 근력 저하에 대한 모니터링상자와 주입을 ROM. </li></ol></li><li> 비강 내 점적 주입은 (훈련 된 작동에 의해 10 초에서 수행 될 수있다). <ol><li> 똑바로 세워 그 뒷면 (그림 4B)에 자리 잡고 하나 - 손으로 마우스를 잡고. </li><li> 집게 손가락을 사용하여, 헤드를지지하고 유지하는 턱의 손가락을 사용 객담 (도 4C)을 방지하기 위해 폐쇄. </li><li> 단계 2.3.8에서 설명 된 바와 같이, 준비된 C. 있도록 알비 칸스 솔루션은 볼륨을 심어 50 μl를위한 ㎖의 당 2 X10 6 CFU가 포함되어 있습니다. 참고 : 두 번째 중요한 점은 점안 한 볼륨입니다. 보다 낮은 50 μL가 불충분 한 식민지 또는기도의 불 균질 점안을 초래할 수있는 볼륨은 더 큰 볼륨이 익사 / 질식 사망을 야기 할 수 있음. </li><li> 콧 구멍에 피펫에 접근하여 내 비강 마우스를 한 방울 씩 떨어 뜨 리다. </li><li> 콧 구멍에 용액을 함유하는 버블을 형성하는 50 μL 강하 피펫이어서 spontaneousl 의해 흡입Y 호흡 마우스. </li><li> 복구 영역에 넣어 마우스 (예를 들어, 오버 헤드 가열 램프와 대형 잘 탄산 베어 케이지). 마우스는 완전한 각성 할 때까지 모니터링해야합니다. 이 흉골 드러 누움 및 바로 잡고 반사를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 이 시점에서, 마우스는 정상 하우징 케이지로 복귀 할 수있다. </li></ol></li></ol> 4. P. 녹농균 유도 된 급성 폐 감염 참고 : 마우스는 네 다음 일 동안 무게가있다. 통상, 마우스는 C. 동안 체중 알비 칸스 - 매개기도 식민지 (그림 2A). <ol><li> P.를 함유하는 현탁액을 제조 aeruginosa의 O / N 증가율 (2.2 절) 후 점안의 날. </li><li> (3.1) 전술 한 바와 같이 간단히 마취하는 것은 세보를 흡입하여. 주 : 급성 폐 감염을 수행하기 위해 제안되는 세균 부담을 권장표 1. </li><li> 후 점안 복구에 특히주의와 (3.2) 전술 한 바와 같이 마우스를 한 방울 씩 떨어 뜨 리다. </li></ol> 폐 손상 지수 5. 측정 <ol><li> FITC 표지 된 알부민을 함유하는 용액을 제조 하였다. 동물 안락사 전에이 솔루션 2 시간을 주입한다. <ol><li> 적절한 장비와 알부민 - FITC 0.2 mg의 무게. </li><li> 1 ml의 PBS에 0.​​2 mg을 추가합니다. 간단히 소용돌이. 즉시 사용하지 않을 경우, 주변 광에 대한 노출을 피해야 호일에 솔루션을 배치합니다. </li><li> 각 마우스 FITC로 표지 된 알부민 용액을 복강 내 200 μl를 주입한다. </li></ol></li><li> 안락사 <ol><li> 마지막 체중 데이터에 대한 마우스의 무게를. </li><li> 5.47 % 펜토 바르 비탈의 300 μL : 펜 토바 비탈의 치명적인 과다 복용 한 복강 내 주사를 사용하여 연구위원회 지침에서 동물의 지역 사용에 따라 하나의 마우스를 안락사. </li><li> 케이지에서 마우스를 제거하고 L를 수신운영자가 ethal 주입. </li><li> 주입 후, 다른 동물 숨겨진 또 다른 케이지, 혼자 마우스를 전송합니다. 운동의 부재까지 마우스를 관찰합니다. 확인 죽음은 운동, 특히 호흡 운동, 펄스의 부족의 부재입니다. </li><li> 따라서 마취제 나 진통제없이, 죽은 동물에 샘플의 수술 모음을 수행합니다. </li></ol></li><li> 외과 샘플 컬렉션 : 흉부 단계. 참고 : 무균 상태를 유지하기 위해 모든 수술은 바이오 안전성 레벨 2 환경에서 멸균 장비를 사용하여 수행됩니다. <ol><li> 피부에 에탄올을 적용합니다. 가위로 중간 복부에 흉골에서 중간 선에 피부 절개를 수행합니다. 양쪽에있는 흉곽을 따라 중간 선 째다에서. 흉곽을 시각화하기 위해 흉부의 양쪽에 피부를 다시 접어. </li><li> 위해 쇄골을 향해 올라가고 양쪽에있는 흉곽의 수직 절개를 수행하는 것은 선미와 전체 전방 흉벽을 기대 게 할 수음 심장과 폐 (그림 5A, 5B)의 완벽한 시각화를 허용한다. </li><li> 심실 동맥 옆에있는 심장을 천공하여 사전 heparined 주사기를 사용하여 혈액을 수집합니다. 플라즈마의 적어도 100 μL를 얻기 500 μL의 최소 철회. 얼음에 혈액 샘플을 놓습니다. </li><li> 기관 (그림 5B 및 5C)를 시각화하는 중간 선 자궁 절개를 수행합니다. 조심스럽게 기관 주위의 근막을 해부하다. 기관 (그림 5C 및 5D) 뒤에 봉합을 놓습니다. 그 후 봉합 적절한 세척을 보장하기 위해 cannulating 바늘 주위에 종료됩니다. </li><li> 20-G 변성 위관 니들 (도 5d 및 4A)을 사용하여 기관을 카테 테르를 꽂다. 이전에 배치 봉합과 유관 기관 주위에 수술 매듭을 묶어. </li><li> 기관지 세척술 (BAL)을 수행하려면, 부드럽게 점진적으로 주입과 폐에서 /에 얼음처럼 차가운 PBS 500 μl를 그립니다. i에서 샘플을 놓고CE는 세포의 용해를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 5.3.6, 3 회 2 ㎖의 원심 분리 관 (그림 5E)에 1,500 μL 기관지 폐포 세척액과 풀 세척 샘플의 총을 얻었다. </li><li> 가슴에서 폐를 제거합니다. 80 ° C - 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 (크기가 하나의 폐 또는 엽의 절반에 해당한다)과에서 빠르게 저장 폐 세그먼트를 배치합니다. </li><li> 세균 부담을 결정하고 얼음에 배치하는 PBS를 함유하는 미리 칭량 용혈 튜브 폐 세그먼트를 배치했다. </li></ol></li><li> 외과 샘플 컬렉션 : 복부 단계. <ol><li> 복부의 왼쪽에 다른 절개를 수행합니다. 복막을 통해 비장을 준수하십시오. </li><li> 비장을 제거하고 얼음에 두 번째 용혈 1 ml의 PBS를 포함하는 튜브를 제자리에 놓습니다. </li></ol></li><li> 폐 손상 지수 주가 : 폐포 - 모세 혈관 막 투과성 측정하여 평가한다 FITC를 표지 알부민 누설을 혈관 구획에서에 폐포 - interstitial 함. <ol><li> 원심 분리기 혈액 샘플과 1,500 x g에서 10 분 동안 기관지 폐포 세척액. 새로운 원심 분리기 튜브에 상층 액을 수집합니다. 펠렛을 모집 플라즈마 또는 BAL 세포에 해당하고 얼음에 배치해야합니다. </li><li> 96 웰 투명 판 (300 μL 우물)에 각각 혈액 뜨는 (플라즈마, 노란색) 또는 BAL 상층 액 100 μl를 추가합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 접시에 호일을 놓습니다. </li><li> 형광 혈장 농도와 형광 마이크로 플레이트 리더 (; 방출, 520 nm의 여기, 487 나노 미터)를 사용하여 BAL 상등액을 측정한다. </li><li> 형광 비 산출함으로써 폐 손상 지수를 결정 [(BAL 상등액 / 혈액 상청액) X 100]. </li></ol></li><li> 기관지 폐포 세척액 (BAL) 차동 세포 수. 참고 : 단계 5.5.1에​​서 기관지 폐포 세척액의 원심 분리에서 얻은 세포 펠렛을 사용합니다. <ol><li> 필요하다면 적혈구 용해 완충액을 사용한다. CEL을 함유하는 원심 분리 관에 적혈구 용해 완충액 500 μL를 추가L 펠렛. 간단히 소용돌이와 얼음에 10 분을 둡니다. 붉은 세포 용해를 중지 500 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 1,500 X g에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 세포. 상등액을 제거하고 멸균 PBS 1 ㎖로 세포 펠렛을 중지. 세포를 계산하는 Hemacytometer 사용. Mallassez의 hematocytometer를에 세포를 열거합니다. cytospin와 슬라이드에 세포를 집중. </li><li> 셀 식별 및 카운트 (대 식세포, 림프구, 호중구)을 허용 착색 키트를 사용하여 세포를 염색. </li></ol></li><li> 폐 세균 부담과 세균 보급 주 : 폐 세균 및 세균 부담 보급, 폐와 비장을 평가하기 위해 각각 수집하고, PBS (단계 5.3.9) 1 ㎖를 함유하는 미리 칭량 용혈 튜브에 보관 하였다. <ol><li> 1 ml의 PBS 및 폐 또는 비장를 포함하는 용혈 튜브의 무게. 폐와 비장 균질 균질 물을 얻기 조직 균질기로 균질화 샘플. </li><li> 조직 호모 100 μl를 입금시리얼 희석 대수를 구하는 멸균 PBS 900 μl를 함유하는 원심 분리 튜브에 genates. </li><li> 피에 대한 BCP 한천 중 하나에있는 두 개의 마지막 적절한 희석 샘플 (10-3 및 10-2)를 플레이트 녹농균 또는 C에 대한 한천을 YPD - 아 미카 신 - 보충 알비 칸스 폐와 비장 부담 결정. </li><li> 37 ° C에서 접시 O / N을 품어. 다음 날, 접시에 식민지를 열거합니다. </li><li> 인덱스 폐 중량 결과는 폐의 그램 당 CFU를 얻었다. 폐 샘플 크기는 결과는 폐의 그램 당 CFU에서 발현되어야하며, 동일하지 않다. 인덱스에 대한 공식은 다음과 같습니다 [CFU] × [용혈 튜브의 무게와 폐] - [용혈 튜브의 무게]. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Casadevall, A., Pirofski, L. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li>
<li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li>
<li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+research+%3A+J.+Lab.+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li>
<li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Candida+interactions%3A+an+ecological+role+for+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li>
<li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans%3A+do+they+really+need+to+stick+together%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+intestinal+immunity%3A+same+ballpark%2C+different+players%3B+different+rules%2C+same+score%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li>
<li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+repertoire%2C+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Micro.%22%5BJournal%5D)">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li>
<li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-Induced+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
<li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li>
<li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li>
<li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+care%22%5BJournal%5D)">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li>
<li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li>
<li>Faure, E., Mear, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
</ol>

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동물 모델, 특히 포유 동물은 면역의 분야에서 호스트 병원체 상호 작용의 복잡한 메커니즘을 규명하는데 유용하다. 물론, 단지 필수적이어야 동물 모델에서 얻을 수있는 정보의 필요성; 그렇지 않으면, 동물의 사용은 체외 모델로 교체해야합니다. 이러한 동물 모델은 병원체 간의 상호 작용이 다 성분 호스트 응답에 의해 매개되기 때문에 단지 동물 모델에 의해 제공 될 수있는 통찰력을 나타낸다. 현재이 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용 마우스는 성숙하고 변경되지 않은 면역 반응과 6~10주 세 젊은 성인입니다. 선천성 면역 반응에 집중하면, C57BL6 / J 마우스 배경이 바람직하다. 섹스와 면역 반응에 호르몬주기 (특히 에스트로겐)의 영향을 방지하기 위해, 남성은 따라서 최선의 선택입니다. 통계적 유의성을 달성하기 위해, 그룹이 실험의 끝에서 적어도 5 개인이 있지만, 모든 동물 experimen 의해 제안해야테이션 가이드가 사용 동물의 수는 엄격한 최소한으로 감소하고 정제한다. <p class="j...

동물 모델, 특히 마우스는 병원체에 대해 광범위 면역 반응을 조사하는 데 사용되어왔다. 타고난 및 획득 면역은 설치류와 인간 (7) 사이에 차이가 있지만, 번식의 용이성과 다양한 유전자 녹아웃의 개발, 면역 반응 (8)을 연구하기 위해 쥐에게 훌륭한 모델을합니다. 면역 반응은 복잡하고 병원균의 상호 작용의 결과, 상주 미생물 식물과 여러 면역 (림프구, 호중구, 대 식세포) 및 비 면역 (상피 세포, 내피 세포) 세포 유형 2. 시험 관내 연구는 관찰 허용하지 않습니다 이러한 복잡한 상호 작용은 주로 독특한 세포 병원체의 상호 작용에 초점을 맞추고있다. 동물 모델 사용할 때는주의 매우 특이적이고 중요한 문제로 제한해야하지만, 마우스 모델은 생체 내에서 포유 동물의 면역 반응에 대한 우수한 통찰력을 제공하고 중요한 임상 문제 (7)의 일부를 해결할 수있다. (6)의 다수 관련 복잡하다. 무엇 &quot;정상&quot;기도 마이크로 바이 옴을 구성하는 결정 남아 있지만, 주민 커뮤니티 자주 polymicrobial 있으며, 다양한 생태의 원본. 화농성 만성 폐 질환 (낭포 성 섬유증, bronchectasis) 환자 또는 기계적 통풍 환자가 환경 취득 미생물 9 인해기도의 식민지로 특정 식물을 나타낸다. 녹농균 및 칸디다 알비 칸스 모두 문제가 자주 기관지 샘플에서 함께 고립, 5 병원균이다 , 특히 중환자 실 (ICU) 4, 이러한 환자에서 심각한 기회 감염의 책임. 피에 대한 항균 치료에 ICU 결과 급성 폐렴 동안 이들 미생물의 분리 녹농균의 B유타 효모는 일반적으로이 사이트에 5에서 병원성 간주되지 않습니다. (P) 사이의 체외 상호 작용을 녹농균 및 C 알비 널리보고하고 이러한 미생물 성장과 서로의 생존에 영향을 미칠 수 있지만, 연구가 종결 수 없다는 것을 보여 주었다 되었다면 C. 존재 알비 칸스 (Candida albicans)는 호스트 (10)에 대한 악영향이나 유리하다. 마우스 모델은 P.의 관련성을 해결하기 위해 개발 된 녹농균 및 C 생체 내 알비 있지만 미생물 사이의 상호 작용은 핵심 아니었다. 사실,이 모델은 C의 참여를 평가하기 위해 설립되었다 호스트 면역 반응, 그리고 결과에 알비 칸스. 루 등에 의해 설립 이전 모델은 이미 다 함께 초기 식민지를 사용 알비 칸스은 P.에 의해 유도 된 급성 폐 감염 다음 녹농균은. 자신의 모델을 사용하여, 저자는 P의 해로운 역할을 발견대한 뛰어난 다 알비 칸스 11 군체. 그러나 루 등은 C.의 높은 부하를 사용 연속 3 일 동안 2 × 106 CFU / 마우스로 자신의 모델에 알비 칸스. 우리는 C.의 -4- 일 모델을 확립 알비 칸스기도 식민지, 또는이 모델 C에서 폐 손상없이 적어도 지속성에 알비 칸스 마우스 (그림 2B) 12, 13 당 105 CFU의 단일 점안 후 사일까지 검색되었습니다. 사일 후 염증 세포의 모집, 염증성 사이토 카인 생성이나 상피 손상의 증거는 관찰되지 않았다. C의 피크의 존재에 48 시간, - (24) 알비 칸은 세포 및 사이토 카인 선천성 면역 반응이 관찰되었다하더라도, 폐 손상의 증거가 없었다. 놀랍게도, 마우스, 따라서 (C)와 식민지 P.의 점안을 비강에 알비 칸스 48 시간 전 녹농균은 피와 쥐에 비해 감염을 감쇠했다 혼자 녹농균 감염. 나는ndeed는, 마우스는 작은 폐 손상을 전시하고 세균 부담 12,13 감소했다. 몇 가지 가설 C.와 이전 식민지의 유익한 효과를 설명 할 수 피에 알비 칸스 녹농균은 급성 폐 감염을 매개 성. 첫째, 각 미생물 정족수 감지 시스템, homoserinelactone 기반 P.를 포함 종간 크로스 토크 (cross-talk) 녹농균 시스템 및 파네 솔 기반 C. 알비 시스템, 평가 하였다. 둘째, C. 폐 상피 세포에서 병원균을 전환 녹농균에 대한 &quot;미끼&quot;대상의 역할 알비 칸스이 연구되었다. 두 가설 (게시되지 않은 데이터) 무효화되었다. 세 번째 가설은 C.에 의한 선천성 면역 시스템의 &quot;마중물&quot;의를했습니다 피에 대한 강화 된 이후 타고난 응답에 대한 책임 알비 칸스 녹농균. 이 가설은 최근 확인되었다. 실제로 C. 알비 칸스의 식민지는 선천성 면역의 프라이밍 throu 주도GH IL-22은 주로 박테리아 증가 클리어런스 결과 선천성 림프계 세포에 의해 분비 폐 손상 (12)를 감소시켰다. 결론적으로, 호스트는 선천성 면역 반응을 조절 및 다른 염증 세포 유형을 포함하는 미생물의 상호 작용에서 중심 배우이다. 이들 복잡한 상호 작용이 시험 관내 면역 해부 될 수있는 반면, 초기 가설은 생체 내 모델에서 적절한 의해 제공 될 수있다. 다음 프로토콜은 다른 미생물에 적응 될 수있다 호스트 매개 병원체의 생체 내 상호 작용 연구의 예를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml 플라스틱 병</td></tr><tr><td>형광 리더 Mithras&nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>첫 번째 칼럼</td><td>참조 댓글 없음</td></tr><tr><td>Bromo-cresol 보라색 한천</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>단위당 20배</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100ml 플라스틱 병</td></tr><tr><td>2-헤드 밸브&nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>없음 멸균 접종 루프 10 &마이크로; l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1,000 컨디셔닝</td></tr><tr><td>Insuline 주사기 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>100 컨디셔닝</td></tr><tr><td>2 위치 배양 튜브 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>없음 Ultrospec 10&nbsp;</td><td>General Electric 생명 과학</td><td>80-2116-30</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>없음 Hemolysis 튜브 13 x 75 mm&nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>per 100</td></tr><tr><td>PBS - 인산염 완충 식염수</td><td>생명 기술은</td><td></td><td>500 ml</td></tr><tr><td>아미카신 1 g</td><td>마일란</td><td>62516778</td><td>10개당 패키지로</td> 10010023</tr>;<tr><td>2ml의 Heparin 10,000 UI</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>단위당 10회</td></tr><tr><td>RAL 555 착색 키트</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>100mL</td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td> 3개 플라콘 <td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>투명 300 &micro; l 96-웰 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>없음 Yest-peptone-Dextrose Broth</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>in powder</td></tr><tr><td>FITC-albumin</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>in powder</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>in powder</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Terumo or unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditioning</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>코멘트 없음</td></tr></tbody></table>

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

호스트 병원체 상호 작용을 공부하는 것은 미생물 감염시 병원성의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 호스트의 예후는 병원균 1에 대한 적응 면역 반응의 참여에 따라 달라집니다. 면역 반응은 병원체 및 여러 면역 또는 비 면역 세포 유형 2의 상호 작용에서 복잡하고 결과입니다. 시험관 연구는 이러한 상호 작용의 특성과 세포 - 병원균 상호 작용에 초점을 맞출 수 없습니다. 또한, 특히 화농성 만성 폐 질환 또는 기계적 환기 환자에서 환자의기도 3에서는 polymicrobial 커뮤니티 존재 및 호스트 병원균 작용을 복잡. 녹농균 및 칸디다 알비 칸스 모두 문제가 자주 기관지 샘플로부터 단리 4 병원균되고 특히 중환자 5, 심각한 감염과 연관된. 미생물 상호 작용이체외에서 이러한 병원체 사이에보고하지만, 이러한 상호 작용의 임상 적 영향은 6 불분명 남아되었다. C. 알비 칸스과 경찰 사이의 상호 작용을 연구하는 애 루기 노사, C.의 뮤린 모델 P. 다음에 알비 칸스기도의 식민지, aeruginosa- 매개 급성 폐 감염을 행 하였다.

프로토콜 정보 중 미리 알 수있는 바와 같이, 실험 (: 실험 막대도 1)을 완성해야 오일. 하나의 오퍼레이터는 실험의 전체 동작 동안 권유되고 10 마우스의 최대 프로세스를 처리 할 수​​있다. 더 동물이 필요한 경우, 두 사람이 특히 수술 시료 채취를 위해 필요하다. 실제로 모든 샘플은 마지막 마우스에서 FITC 표지 된 알부민의 증가 패시브 폐포 모세 혈관 누출을 방지하기 위해 2 시간에 따라 수집되어야한다. 첫 번째 단계는 C.의 제조이다 알비 칸스 접종 물 및 비강 내 점적은 C. 의한기도 집락을 얻었다 알비 칸스. 4일 지속성 모델 C. 5 × 105 CFU의 비강 내 점적 주입에 의해 얻어진다 마우스 당 알비 칸스 (그림 2B). 이 사일 동안, 마우스는 L를 유도하지 않습니다 5 × <s...

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

본 절차의 전반적인 목표는 개별 박테리아와 단일 곰팡이 사이의 상호작용을 연구하기 위한 모델을 구축하는 것입니다. 이러한 방식은 상호 교신과 종간 대화에 어떤 요인들이 관여하는지와 같은 병원체 상호작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 in vivo 모델에서 생성된 데이터가 임상적 관련성을 갖는다는 점입니다.곰팡이를 비강 내로 주입하려면, 먼저 멸균 PBS에서 C.albicans를 ml당 2 × 10⁶ CFU로 희석합니다. 다음으로, 성체 저장성 마우스의 정위 반사 소실을 확인한 후, 200 µL 피펫으로 곰팡이 현탁액을 최소 50 µL 흡입합니다. 이제 한 손으로 마우스를 잡고, 동물을 돌려 복부가 위를 향하도록 등으로 눕힙니다.마우스가 위치를 잡으면, 마우스를 잡고 있는 손의 검지로 머리를 받치고 엄지로 턱을 닫은 상태에서 피펫 팁을 동물의 코 가까이로 이동시킵니다. 그런 다음, 50 µL의 곰팡이 용액 한 방울을 콧구멍 위에 조심스럽게 분사하여 마우스의 자발적 호흡을 통해 흡입되도록 합니다. 이후 마우스가 완전히 회복될 때까지 케이지에 단독으로 배치합니다.C.albicans 감염 4일 후, 안락사시킨 동물의 복부를 면도하고 노출된 피부를 에탄올로 멸균합니다. 다음으로 가위를 사용하여 흉골부터 복부 중간까지 피부를 절개합니다. 그런 다음 정중선 양쪽의 늑골을 따라 절개선을 확장하고 흉부 양측의 피부를 젖힙니다.늑골이 보이면 흉골 양측에서 쇄골 방향으로 수직 절개를 가하고, 흉골을 이용해 전흉벽 전체를 뒤로 젖혀 심장과 폐를 시각화합니다. 그 다음, 헤파린 처리된 주사기를 사용하여 심실간동맥 옆의 심장을 천자하고, 최소 500 µL의 혈액을 채취합니다. 채취한 혈액 샘플은 얼음 위에 놓아 보관합니다.그다음, 기관을 노출시키기 위해 경부 정중선 절개를 실시합니다. 기관 주변의 근막을 조심스럽게 박리한 후, 기관 아래에 봉합사를 배치합니다. 이어서 20-gauge 변형 가바지 바늘(modified gavage needle)을 사용하여 기관에 카테터를 삽입하고, 앞서 배치한 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다.기관지폐포 세척술을 수행하려면, 차갑게 냉장 보관한 PBS 500 µL를 폐에 조심스럽게 주입하십시오. 그런 다음 세척액을 흡입하여 얼음 위에 놓인 2 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 500 µL 샘플을 두 번 더 수집한 후, 흉부에서 폐를 적출하고 폐 조직 일부를

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 성장의 다른 방법을...

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

우리는 카테터에 생물막이 형성되고 C.albicans와 숙주 간의 상호 작용이 임상 CRI와 잘 상관되는 C.albicans 관련 카테터 관련 감염(CRI)의 마우스 모델을 확립합니다. 이 모델은 C.albicans 생물막 관련 CRI에 대한 치료법을 스크리닝하여 임상 혁신을 위한 토대를 마련하는 데 도움이 됩니다.

마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델

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이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

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이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

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이 연구는 낭포성 섬유증 폐 환경을 반영하는 녹농균 유전자 발현을 평가하기 위해 응집체 다미생물 생물막 모델을 개발하고 RNA 추출 프로토콜을 최적화하기 위한 프레임워크를 설명합니다. 응용 분야에는 항균 효과 평가 및 낭포성 섬유증과 관련된 조건에서 항생제 대안 연구가 포함됩니다.

감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

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지중해에서 칸디다 알비칸스 감염을 최적화하여 균류 발병기전과 숙주 방어 연구를 위한 프로토콜

학습하세요 Candida albicans와 Pseudomonas aeruginosa의 상호작용을 연구하는 생체내 마우스 모델 구축 방법을. 이 기법은 호흡기 감염의 병원성 메커니즘을 이해하는 데 임상적 관련성이 높은 데이터를 제공합니다.

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