혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름
2015년 11월 3일
이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.
다음 실험의 전반적인 목표는 내피 세포에 대한 다양한 박동 흐름 병리학의 영향을 관찰하는 것입니다. 시험관 내. 이는 먼저 유리 슬라이드를 화학적으로 처리하고 단백질로 코팅하여 흐름에 노출되는 동안 세포 부착을 보장함으로써 달성됩니다.
두 번째 단계로, 흐름의 박동 지수가 결정되며, 이를 통해 in vitro 흐름을 문헌에 설명된 값과 비교할 수 있습니다. 다음으로, cell seated slides는 flow pathology에 대한 세포 반응을 측정하기 위해 flow system에 연결됩니다. 그 결과, 광학 현미경 및 면역형광 염색을 사용한 유동 프로파일을 기반으로 한 형태 및 단백질 발현의 변화를 보여줍니다.
연동 또는 박동 펌프에 비해 이 기술의 주요 장점은 병에 걸리거나 건강한 반응을 모방하기 위해 유량 맥박을 조정할 수 있다는 것입니다. 이는 동맥 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 75mm x 50mm x 1mm 크기의 새 유리 슬라이드를 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 넣습니다.
그런 다음 20% 황산 용액을 충분히 추가하여 유리 슬라이드를 완전히 담그고 다음 날 밤새 산성 용액에서 배양합니다. 슬라이드를 깨끗한 탈이온수에 매번 5분 동안 담가 세 번 세척합니다. 한 번 헹구는, 30 분 동안 아세톤에 있는 활주를 가라앉히고, 그 후에 아세톤에 있는 6%three 아미노 프로필 trixi seline의 해결책에서 그 후에 밤새도록 가라앉히십시오.
다음으로, 슬라이드를 순수 아세톤으로 5분 동안 세 번 헹구고 세탁할 때마다 아세톤을 변경합니다. 그런 다음 탈이온수로 슬라이드를 5분 동안 세 번 세척하고 세척할 때마다 탈이온수를 변경합니다. 그런 다음 슬라이드를 1.5% 글루타르알데히드에 담그고 60분 동안 담가 둡니다.
한 번 교차 결합해, 각 세척 후에 탈이온수를 바꾸어, 탈이온수에서 활주를 두번 세척하고, 그 후에 그(것)들을 살균하기 위하여 30 분 동안 70%ethanol로 활주를 두십시오. 에탄올을 제거하고 슬라이드에 남아 있는 잔여물이 증발하도록 합니다. 건조되면 슬라이드를 멸균 탈이온수에 잠시 넣어 수분을 보충합니다.
그런 다음 슬라이드 홀더를 제거하고 100mm x 100mm 정사각형 페트리 접시에 넣습니다. 층류 후드에서 기능화된 슬라이드를 1밀리리터당 25마이크로그램의 피브로넥틴 용액으로 코팅하여 세포 배양 챔버에 노출될 대략적인 영역을 덮습니다. 다음 접시를 덮고 외피 후에 1개에서 2 시간 동안 37 섭씨 온도에 활주를 배양하십시오, 잔여 해결책 및 씨를 뿌린 600, 활주의 입히는 측에 10%FBS를 가진 DMEM의 1 밀리리터에 있는 000의 내피 세포를 흡입하십시오.
챔버를 덮은 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 120분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 세포를 추가 배지로 덮고 70-80% confluent가 될 때까지 계속 배양합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 회로를 연결하고 여기에 표시된 대로 damping 챔버와 초음파 유량계가 올바른 흐름 방향으로 배열되어 있는지 확인합니다.
다음으로, 흐름, 회로 및 저장소를 탈 이온수로 채 웁니다. 저장 탱크 배출 튜브가 저장 탱크 부피 내에 잠겨 있는지 확인하십시오. 그런 다음 유량계를 사용하여 유량 파형을 시각화합니다.
d의 공기 방출 밸브를 엽니다.amping 챔버를 사용하여 유체 대 공기 부피 비율을 변경합니다. 다른 유체 레벨 간격으로 공기 배출 밸브를 닫고 맥동 지수를 계산하십시오. 인덱스를 계산하려면 피크가 VM max를 나타내므로 흐름 파형을 평가합니다.
저점은 v min을 나타내고 V 평균은 신호 레코드의 평균입니다. 노트북의 puls 인덱스 값입니다. 결과 유체 수준과 기동 지수를 damp나중에 사용할 수 있도록 펠트 팁 영구 잉크 펜을 사용하여 감쇠 챔버.
플로우 챔버 워밍업을 준비하는 동안 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 참조된 병리학 문헌에서 원하는 박동 지수 수준을 결정합니다. DMEM은 섭씨 37도의 수조에서 1%FBS를 보충했습니다. 70-80% confluent가 되면 미디어에서 셀 코팅된 슬라이드 중 하나를 꺼내 셀 시트 측 위에 개스킷을 놓습니다.
다음으로, 흐름 챔버의 진공 채널을 개스킷의 구멍에 맞춥니다. 그런 다음 진공 튜브를 진공 포트에 연결하여 매체가 진공으로 누출되지 않도록 합니다. 유리 슬라이드 아래에 폴리카보네이트 시트를 놓고 흐름 챔버의 짧은 면 각각에 하나의 스프링 클램프와 흐름 챔버의 긴 면을 따라 두 개의 스프링 클램프로 흐름 챔버 어셈블리를 고정합니다.
다음으로, 흐름 챔버, 입구 및 출구를 흐름 회로에 연결합니다. 유량 시스템을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 인큐베이터에 넣고 저장소를 매체로 채우고 낮은 박동으로 펌핑하여 회로를 예열 매체로 채웁니다. 이 흐름을 4시간 동안 유지하여 세포를 사전 컨디셔닝합니다.
그런 다음 댐핑 챔버의 유체 부피를 미리 표시된 박동 지수 수준과 배양으로 조정합니다. 원하는 지속 시간 동안의 셀입니다. 여기에 표시된 내피 세포는 무흐름, 정상 흐름 및 박동 흐름으로 배양되었습니다.
형태학의 변화는 전형적인 내피 세포 형태학에서 높은 박동 흐름에 24시간 노출된 후 형태학과 같은 형태학으로 볼 수 있습니다. 정적 흐름과 정상 흐름은 모두 형태학에서 차이가 거의 또는 전혀 없습니다. 평활근 세포는 또한 높은 박동 흐름에 노출된 내피 세포와의 공동 배양에 의해 영향을 받으며, 여기에서 알 수 있듯이 다양한 수준의 알파 평활근 액틴 및 미오신 중쇄에 의해 나타납니다.
다양한 흐름 조건 전반에 걸쳐 박동 흐름에 노출된 세포는 두 단백질의 양이 가장 많았으며, 이는 비대와 수축성을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 씰을 유지하고 이 절차에 따라 유체 레벨이 일정하게 유지되도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 세포 대 세포 상호 작용과 같은 추가 질문에 답하기 위해 내피 세포, 혈관 세포 공동 배양과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 흐름 회로를 조립하고, 인덱스를 제어하고, 내피 세포를 박동 흐름에 노출시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 질병 병리에서 세포 반응을 결정하는 데 도움이 되도록 생리학적 또는 병리학적 혈류를 시험관 내에서 복제합니다. 이 실험은 다른 맥동성 흐름 병리가 내피 세포에 미치는 영향을 관찰하는 데 중점을 둡니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 혈관 생물학
배경
- 내피 세포 반응을 이해하는 것은 혈관 질환을 연구하는 데 중요합니다.
- 맥동성 흐름은 시험관 내 생리적 조건을 모방할 수 있습니다.
- 이전 연구에서는 흐름 조건이 세포 형태 및 기능에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌습니다.
- 본 연구는 이러한 조건을 더 나은 실험 정확도를 위해 복제하는 것을 목적으로 합니다.
연구 목적
- 맥동성 흐름 병리가 내피 세포에 미치는 영향을 관찰합니다.
- 혈관 연구를 위한 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 확립합니다.
- 흐름 프로파일로 인한 세포 형태 및 단백질 발현의 변화를 측정합니다.
사용된 방법
- 세포 부착을 위한 글라스 슬라이드의 화학적 처리.
- 내피 세포 성장을 촉진하기 위해 슬라이드에 단백질 코팅.
- 문헌과 비교하기 위해 흐름의 맥동성 지수 결정.
- 응답을 측정하기 위해 세포가 놓인 슬라이드를 흐름 시스템에 연결합니다.
주요 결과
- 다양한 흐름 조건에서 내피 세포의 형태 변화가 관찰되었습니다.
- 적용된 흐름 프로파일에 따라 단백질 발현 수준이 달라졌습니다.
- 광학 현미경 및 면역형광 염색을 사용하여 결과를 분석했습니다.
- 이 연구는 흐름 병리가 내피 세포 행동에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공합니다.
결론
- 이 시험관 내 모델은 생리학적 및 병리학적 혈류를 효과적으로 복제합니다.
- 연구 결과는 혈관 질환에서 내피 세포 반응을 이해하는 데 기여합니다.
- 이 방법론은 혈관 생물학의 추가 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This in vitro flow model enables mechanistic de-risking of vascular targets by simulating physiological and pathological hemodynamics. It supports target validation through controlled modulation of pulsatility index to probe endothelial and smooth muscle cell responses. The system enhances predictive confidence in preclinical vascular research by linking flow dynamics to cytokine release and cross-talk mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating flow as an independent variable in vascular cell remodeling.
- Operational Value: Enables reproducible assessment of cell morphology and protein expression under defined flow conditions.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking hemodynamic stress to cytokine release and cell-type cross-talk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated co-culture systems for downstream compound screening in vascular disease models.
- Operational Value: Standardizes flow exposure via pressure damping chamber tuning for consistent pulsatility index control.
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (morphology, actin/myosin expression) for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant shear stress to study vascular cell remodeling in stenosis or hypertension contexts.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via tunable flow pathologies.
- Scientific Value: Addresses risk-adjusted advancement by identifying flow-dependent hypertrophy and contractility markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement to lead optimization by providing hemodynamic context for vascular phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of flow-dependent pathways in endothelial dysfunction and vascular remodeling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell responses under controlled pulsatile and steady flow conditions.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell morphology and protein expression across flow profiles using imaging and staining.
- Translational Research: Connects hemodynamic stimuli to preclinical relevance through co-culture models reflecting arterial wall interactions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular flow platform adaptable to multiple vascular cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by de-risking vascular targets through hemodynamic mechanism elucidation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via calibrated damping chamber and indexed flow waveforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing flow-dependent contractility and hypertrophy phenotypes early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets based on flow-responsive protein expression thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular cell culture and hemodynamic flow system setup.
- Depends on precision fluid handling, pressure damping chambers, and ultrasonic flow metering.
- Necessitates cross-team standardization of pulsatility index protocols for comparative studies.
- Involves adaptation considerations when extending to smooth muscle fibroblasts or co-culture configurations.
- Limited by approximation of complex physiological pulse waveforms, which may affect translational fidelity.
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