Name: 혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 배우세요 혈관 질환 연구를 위한 체외 맥동류 모델링 방법을 내피세포에 적용하여 세포 형태와 단백질 발현 변화를 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생리학적 및 병리학적 혈류 조건을 정확히 재현합니다.

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저자는 (중량 HL097246 및 HL119371) AHA (중량 13GRNT16990019) 및 NHLBI을 포함하여 자금 출처를 인정하고 싶습니다.

1. 실란 화 및 슬라이드의 생체 분자 기능화 또는 폴리 카보네이트 막 참고 :이 프로토콜 내에서 화학 물질 및 솔루션의 대부분은 높은 증발 속도 (에탄올 (EtOH로), 아세톤 등)이있다. 다른 단계 낮은 증발 속도에 대한 긴 배양 시간을 수반한다. 파라핀 필름 용기를 밀봉하는 것이 좋습니다. 주의 : (포함 : 황산, 아세톤, (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란, 글루 타르 알데히드, EtOH로) 화학 물질의 대부분은 위험, 또는 휘발성 간주됩니다. 사용하기 전에 적절한 보관, 취급 및 폐기에 대한 각 물질의 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. <ol><li> 전체 침수를 보장 방향에 관계없이 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 1mm에 의해 50mm로 75mm를 측정하는 새로운 유리 슬라이드를 놓습니다. 단계 1.1-1.12에 대한 용기를 사용할 것. 주 : 모든 후속 인트 들면 50mm로 75mm의 크기로 잘라 0.4 미크론 기공 크기의 공동 배양에, 폴리 카보네이트를 포함한다 (PC) 막,PC의 작용과 EC 파종을위한 PS. </li><li> 황산 (20 %), O / N에서 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 황산에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 3 회 탈 이온수 (DI)를 침지마다 DI를 ​​변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 30 분 동안 아세톤에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 6 % (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 / 아세톤 용액의 O / N에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 및 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 아세톤마다 변경, 5 분, 3 회 아세톤 슬라이드 담가. 주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 3 회 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 60 분 동안 1.5 % 글루 타르 알데히드 / DI 솔루션에 슬라이드를 담가. 주의 : 사용하기 전에 글루 타르 알데히드에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. </li><li> 5 분, 두 번 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 장소 슬라이드멸균 층류 후드에서 30 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)로 S. </li><li> 의 EtOH를 제거하고 증발 잔류 남아 있습니다. 슬라이드를 재수하기 위해 멸균 DI와 드레인에 슬라이드를 담가. 참고 : 슬라이드 또는 PC 막 1 주일까지 4 ° C에서 유리 슬라이드 홀더에 밀봉 저장 될 수있다. 세포 배양에 대한 사용하면, 반복 1.10 및 1.11 단계를 반복합니다. </li><li> 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 제거하고 층류 후드에 100mm 광장 페트리 접시에서 100mm로 배치합니다. 참고 :이 컨테이너는 나머지 모든 단계에 사용됩니다. <ol><li> 단종 실험에 대한 내피 세포 시드를위한 슬라이드 또는 PC를 준비합니다. <ol><li> 코트 기능화 슬라이드 또는 PC 한쪽에 1 ml의 피브로넥틴 용액 (25 μg의 / ㎖)과 함께 (단계 1.11), 세포 배양 챔버에 노출 근사 면적. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 37 ℃로 설정 무균 인큐베이터에서 슬라이드 나 PC를 품어. </li><li> 배양 후, GLA를 사용하여 남아있는 용액을 대기음진공에 접속 SS 흡인기 피펫. 참고 : 슬라이드는 이제 향후 사용을 위해 4 ° C에서 O / N을 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 단지 EC / SMC 공동 문화의 제조 1.12.2 단계를 수행합니다. 제조와 공동 배양 실험 평활근 세포 (SMC) 배양을 시드. <ol><li> 흐름 챔버 진공에 맞춰 50mm 외경 30mm로 50mm의 내경, 두께 0.5 mm로 75mm의 크기와 구멍과 슬라이드 (단계 1.11)의 상단에 배치 실리콘 가스켓. </li><li> 10 % FBS / DMEM 서스펜션에 1 ml의 SMC를 준비합니다. 7 %의 NaHCO3 및 7.4의 pH를 0.1 M NaOH 용액으로 2 ㎎ / ㎖의 콜라겐 타입 I의 1 ml의 용액을 중화하고, 2 × 106 세포 / ml의 최종 세포 밀도와 SMC 현탁액과 혼합한다. </li><li> 가스켓 내에 SMC 용액을 확산하고, 30 분간 CO 2, 37 ℃에서 슬라이드를 배양하고 5 %. </li><li> 배양 후, 수정 된 둘 베코 혼합 25 ㎖, 0.1 % 소 태아 혈청 (FBS)과 슬라이드 커버72 시간 동안 독수리 중간 (DMEM). </li></ol></li></ol></li><li> 유리 슬라이드 / 폴리 카보네이트 막에 문화 내피 세포되는 EC (). <ol><li> 시드 유리 슬라이드 또는 폴리 카보네이트 막의 피브로넥틴 표면에 6.0 × 105 세포 / ml 농도의 초기와 10 % FBS / DMEM에서 한 ML되는 EC. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 한 세포, 및 10 % FBS 120 분. </li><li> 37 ° C에서 인큐베이터에서 추가로 10 % FBS / DMEM으로 세포 및 장소를 포함하는 커버 슬라이드, 5 % CO 2 O / N, 70 % -80 %의 합류까지. </li></ol></li></ol> 유체 점도 및 체적 유량 2. 결정 참고 : 회전 점도계 민감한 장비, 그리고 점도계 사용자 설명서는, 교정 제로, 또는 측정을 수행하기 전에 참고해야한다. <ol><li> 실험의 대상으로 혈관의 문학에서 원하는 유체 전단 (τ)를 결정합니다. </li><li> 지표 성과회전 점도계를 사용하여 E 1 % FBS / (μ) DMEM 점도. </li><li> Poiseuille 식으로부터 필요한 체적 유량 (Q)을 결정 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , 여기서 τ = 유체 전단, μ = 점도, Q = 권. 유량, W = 챔버 폭, H = 챔버 높이). </li><li> 설정 펌프는 단계 2.3에서 파생 된 유량, 이후의 모든 단계에 사용하는. </li></ol> 박동 지수 3. 결정 주 : 시스템 내의 모든 연결 포트는 적절한 크기의 로크 링 투 미늘 또는 암형 루어 투 미늘 연결부와 연결되어야한다. 연결 PVC 튜빙은 미늘 이음쇠에 접속 될 수 있고, 회로는 완성했다. <ol><li> 올바른 흐름 방향 챔버 (그림 3) 초음파 유량계를 감쇠와, 그림 2에서와 같이 흐름 회로를 연결합니다. 초음파 유량계는 장비의 중요한 부분이며, 참고사용자 설명서는 사용하기 전에 참고해야한다. </li><li> 저장 볼륨 내에서 침수 (펌프하기 위해) 저수지 배출 튜브를 보장함으로써, DI 물 흐름 회로와 저수지를 입력합니다. 유량계를 사용하여 흐름 파형을 시각화. </li><li> 댐핑 챔버에 야외 방출 밸브는 유체 / 풍량 비율을 변경합니다. 가까이 다른 오일 레벨 간격으로 공기 방출 밸브 및 계산 박동 지수 (PI = (V 맥스 - V 최소) / V 평균) 흐름 파형 피크 (V 최대), 통 (V 최소)를 사용하여, 그리고 의미 (V 평균). 노트북에 기​​록 PI 값. </li><li> 마크는 향후 사용을 위해 팁 펠트, 영구적 인 잉크 펜을 사용하여, 댐핑 챔버에 오일 레벨 및 PI를 결과. 병리 문학 (11)에서 원하는 PI 수준을 결정합니다. </li><li> 실리콘 튜브 Formation- 선택, 제어 박동의 더 진보 된 방법 <ol><li> 예 (BAS을 다른 비율로 실리콘 엘라스토머 기재와 경화제를 혼합1-36 : 10의 전자 - 투 - 가교제 비율. 1) 변경 대상 탄성 계수를 들어, 이전에 도시 한 바와 같이 2 </li><li> 간단히 소정의베이스 - 가교제 비율로 실리콘 프리폴리머 혼합물에 강 캐 뉼러 (14 G)에 침지 반복 침지 처리에 의해 경화 실리콘 튜브를 제작. </li><li> 경화 공정의 중간에 방향 전환, 캐 뉼러 상에 폴리머 코팅을 경화시키기 4 시간 동안 60 ℃에서 오븐 세트로 예비 코팅 된 캐 뉼러를 배치했다. </li><li> 같은 실리콘 엘라스토머 혼합물로 침지 과정을 반복 0.3 ~에 mm 두께의 튜브 결과 추가로 4 시간에 대해 다시 오븐에 넣습니다. </li><li> 스테인레스 스틸 정맥에서 얇은 실리콘 튜브를 제거합니다. </li><li> 3.3에서와 같이 각 대신 챔버 댐핑 회로 및 테스트 PI를 흐름에 튜브를 연결합니다. </li></ol></li></ol> 4. 펌프 살균 <ol><li> 1에서 유량 용기 (그림 2), PVC 튜브, 가스켓을 담가0 % 과산화수소 (H 2 O 2). 4 단계 전에 멸균 디 씻으시오. </li><li> 예비 보육 선반에 혈액 펌프를 놓습니다. 주 : 인큐베이터 선반 스테인리스, 그리고 전체 유동 회로의 무게를 지탱할 수 있어야한다. </li><li> 저장 볼륨 내에 잠기 저장조 출구 관 (펌핑하기 위해)하도록함으로써 10 % H 2 O 2 유동 회로 및 저장조를 채운다. 에 UV 광으로 층류 후드에서 20 분 동안 회로를 통해 펌핑하여 H 2 O 2를 순환. </li><li> 기음 모든 H 2 O 튜브 2, 및 흐름 회로를 통해 펌핑에 의해 멸균 PBS로 씻는다. </li></ol> 5. 유량 용기 조립 참고 : 유량 용기는 진공 포트와 입구 및 출구 흐름 ​​포트 (그림 2 참조), 아크릴, 사용자 정의 만든 판으로 구성되어 있습니다. 챔버 어셈블리 문화 슬라이드 상단의 유량 용기 및 개스킷을 배치 구성, 프로perly 정렬하고 설명한다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 1 % FBS / DMEM을 따뜻하게하고 유량 용기를 준비합니다. <ol><li> 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13)에서 용지가 EC 슬라이드를 가져 가라. </li><li> (선택 사항) 미디어에서 PC 멤브레인을 가지고 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13에서). PC 막 아래 시드 SMC (단계 1.12.2)와 공동 문화 슬라이드를 놓습니다. </li></ol></li><li> 개스킷의 구멍 (그림 2)와 유량 용기의 진공 채널을 맞 춥니 다. </li><li> 진공에 어떤 미디어 누수를 보장하지 진공 포트 (그림 2)에 진공 튜브를 연결합니다. </li><li> 스프링 클램프, 유량 용기의 각면 (그림 2와 5)에 하나의 유리 슬라이드 클램프 유량 용기 어셈블리 아래 장소의 폴리 카보네이트 시트. </li><li> 장소 흐름 37 ° C에서 인큐베이터 시스템 및 5 % CO 2, 낮은 박동에 가득 저수지에서 펌핑에 의해 미디어와 회로를 입력합니다.세포를 전처리하는 4 시간 동안이 흐름을 유지한다. </li><li> 원하는 시간에 대한 유체 표시된 PI 수준으로 챔버 댐핑에 볼륨과 문화를 조정합니다. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 시험관 내에서 맥동 흐름을 재생하는 방법을 설명하고, 질환 병리에 유동 조건의 기여도를 결정하는 수단이 최초의 단계가 될 수도있다. 이 프로토콜을 사용하여 이전의 연구는이 프로토콜을 경험 연구소를 대상으로, 유동 조건은 또한 혈관 염증 반응. 1, 10에 기여 발견했다. 이와 같이, 어느 깊이 유체 역학 않으며 생화학 분석은 본원에 기재되어있다. 고급 유체 역학 1 및 고급 기술하기 문헌 상담 장시간은 위에 유체 전단 하에서 세포를 배양 2 긴급 :. 1), 밀봉 된 유동 회로를 유지 저장조를 제외하고, 2) 실험에 걸쳐 오염을 방지한다. 흐름 회로 씰링 원하는 유량 파라미터에 영향을주는 의도적 공기의 도입과 함께, 매체 볼륨 정정 PI 수준을 유지하는데 필수적이다. 시스템 5 월 P의 추가 공기artially, 스트림 내에서의 흐름을 방해 흐름 경로를 방해하고, 전체 시스템의 적합성을 향상시킨다. 용적 유량이 유지 될 수...

심혈관 질환의 이환율은 많은 사람들이 건강에 해로운 혈관의 결과로, 미국에서 가장 큰 있습니다. 건강한 동맥 내피 세포 (EC) 단일 층으로 코팅 된 소프트 내강 표면과, 탄성 조직으로 구성되어 있습니다. 동맥 흐름 긍정적 평균 유량을 갖는 진동 파 함수로서 모델링 될 수있다. 박동 지수 (PI)는 진동 크기의 몫과 평균 흐름 (.. (PI) = (최대 - 최소) / 평균)이며, 1 변수 혈관 탄성과 함께 체외에서 모델링 된 2 동맥의 탄력이 흐름의 저장에 중요하다. 심장 수축으로부터 에너지 수축기 압력으로 확장시키고,과 혈류를 PI 조절에 중요​​한 역할을한다. 심장 일관 박동성, 체적 유량을 유지하기 때문에, 동맥의 확장은 혈류 속도, 전단 응력, 및 PI의 흐름을 감소시킴으로써 안정성을 향상 단면적을 증가시킨다. 탄성에 자주, 건강에 해로운 동맥 본 변경또는 규정 준수, 혈관 재, 흉터 조직 또는 석회화 3, 4에서 보강 표시. 또한, 이러한 신생 내막 증식증 (NIH), 5 (6) 동맥류, 고혈압 및 혈관 섬유증 4와 같은 다른 혈관 질환은 혈관 직경을 수축 할 수있다. 그러나, 현재의 약물 치료 및 혈관 질환의 치료 장치들은 종종 용기의 형태 및 성질의 변화에​​ 의해 복잡 혈관 질환에서 혈관 벽 컴플라이언스 또는 혈류 역학의 중요성을 무시. 어느 풍선 혈관 성형술이나 스텐트 벽 탄성 (7)의 합병증에 응답합니다. 따라서, 혈액의 체외 모델링 동맥 질환과 치료에 의한 흐름은 질병의 병리와 치료의 미래 효능을 조사하는 것이 중요하다. 여기서, 우리는 혈관 질환 pathol에서 세포 반응을 판정하기위한 생리 학적 및 병리학 적 혈류를 복제하는 방법을 서술프라 이즈. 유체 유동은 혈관 내의 모든 셀에 영향을주는, 혈관 건강에 중요한 기계적 신호 혈관벽에서 전단 응력을 야기한다. 유체 전단의 혈관 내피 세포에 여러 기계적 센서는 내피 8 mechanosensing에 대한 최근의 연구에서 보여 주 섬모를 포함, 확인되었습니다. 내피 세포 활성 및 형태는 유속, 방향 및 박동에 의해 영향을 받는다. 또한 평활근 세포 (SMC) 마이그레이션 간질 액 (9)을 통해 저속 유동 - 기계 신호에 의해 영향을받을 수 있고, 또한 유동 및 사이토킨 통해 유동 신호 - 기계 형질 그들의 응답을 통해 내피 세포로부터의 분비 신호를 통해 ​​할 수있다 (10)를 놓습니다. 평균 전단, PI 및 분비 신호의 &quot;용량&quot;의존은 상호 의존적 일 수있다. 단층 문화에서이 끝, 다양한 &quot;투여&quot;와 유체 전단에 혈관 세포 반응의 결정에또는 생체 외에서 공동 배양은 혈관 재에 역학적 통찰력을 제공하고, 질병 및 치료의 예측을 개선 할 수있다. 이 실험에 사용 된 유동 시스템은 혈액 펌프, 상류 흐름 댐핑 공기 저장소 만 실험 장치, 하류 세포 배양, 평행 평판 유동 챔버, 및 미디어 저장 기 동안 사용 하류 유량계로 구성된다. , 유속 의미 같은 혈관 흐름의 제어 변수는 분당 비트 및 PI는 제어 유량, 펄스 주파수, 압력 도입 댐핑을 통해 달성 될 수있다. 박동성 혈액 펌프는 체적 유량, 및 펄스 주파수를 의미하는 직접 관련 제어 스트로크 주파수에서, 가변 스트로크 변위 가능하다. 흐름 회로 내의 공기 저장소의 도입 유량 진동 크기를 감소 압력 댐핑을 허용한다. 댐핑 챔버 내의 공기가 유동 될 파의 과도한 압력을 허용하면서 압축 가능 매체는 비압축성 유체압축 공기에 의해 흡수. 미디어 비율 공기는 많은 감쇠가 발생하는 방식을 제어 할 수 있습니다. 폭 50mm로 길이가 75mm 사용자 정의 세포 배양 흐름 챔버는 아크릴로 만들어졌습니다. 흐름은 유입구를 통해 유입 및 유동 챔버의 전체에 걸쳐 일관된 유동을 제공하는 입구 매니 폴드를 통해 확장된다. 유사한 흐름과 구조는 챔버 출구에 존재한다. 세포가 기능화 된 슬라이드 상에 접종하고,이어서 유동 챔버에 부착된다. 이것은 쉽게 연구 한 후 검색된 큰 인구 수 있습니다. 공동 배양 실험 사이토킨 / 플로우 전송을 허용하면서 문화 간의 세포 간 접촉을 제거하는 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용할 수있다. 이 시스템은 이전에, 높은 PI 흐름 및 내피 단층 배양 및 EC / SMC 공동 배양 1, 10에 미치는 영향을 모델링하기 위해 세포 반응에 병리학 PI 높은 질환을 조사하는데 사용되었다. 이러한 플로우 콘을 모델링하는 데 사용되는 프로토콜을 기술함으로써ditions, 우리는 응답을 셀에 흐름 신호 기여를 결정하는 다른 사람을 도울 수 있도록 노력하겠습니다.

<table><tbody><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>시그마-알드리치</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-아미노프로필)트리에톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드 (70&#160; mm x 50&#160; mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 멤브레인</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>HTTP09030</tr><tr><td>실리콘 가스켓</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin (25 &mu; g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>댐핑 챔버</td><td></td><td></td><td>이 챔버는 맞춤 제작되며 그림 3의 엔지니어링 도면을 사용하여 요청할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>혈액 펌프</td><td>하버드 장치</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐 카보네이트 튜빙</td><td>US 플라스틱</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>다양한 크기가 필요할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Luer Connections</td><td>Nordson Medical</td><td>다양한</td><td>다양한 크기가 필요하며 교체용으로 여러 부품을 구입해야 합니다.</td></tr><tr><td>Culture Chamber</td><td>Machined 사내</td><td>맞춤형</td><td>아크릴은 시트로 구입하여 의도 된 용도로 가공 할 수 있습니다. 그림 2에 표시된 엔지니어링 도면을 사용하여 이 챔버를 재현할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>사각 페트리 접시</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드 홀더</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 수정 독수리 매체</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>유량계</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>실가드 엘라스토머 키트</td><td>시그마-알드리치</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G 스틸 캐뉼라</td><td>일반 실험실 공급</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

혈관 질환은 미국 내 사망의 흔한 원인이다. 여기서, 우리는 혈관 질환의 병리 향해 유동 역학의 기여를 조사하는 방법을 제시한다. 보강 벽, 흉터, 또는 모든 유체의 유량에 영향을 미칠 수있는 부분 협착증 및 유량 맥동의 크기, 또는 박동성 지수 종종 본 해로운 동맥. 다양한 유동 조건의 복제는 혈액 펌프의 하류 챔버 댐핑 유동 압력 조정의 결과이다. 압축성 매체 펌프로부터의 압력 맥동을 흡수하므로 박동 지수를 변화시키기 위해 닫힌 유동 시스템 내에서 공기의 도입은 허용한다. 본원에 기술 된 방법은 매우 간단하게 제어 가능한 입력하고 쉽게 측정 결과와 함께 재생된다. 몇 가지 제한 사항은 시스템에 의해 근사 복잡한 생리 펄스 파형, 레크리에이션이다. 내피 세포, 평활근 세포, 섬유 아세포 및 혈류 THR 의해 영향동맥을 깨닫지 못하고 있거나 남의. 혈류의 다이내믹 성분은 심 박출량 및 동맥벽의 준수에 의해 결정된다. 유동 역학의 혈관 세포 - 기계 전달은 사이토 카인의 방출과 동맥 내 세포 유형 사이의 크로스 토크를 트리거 할 수 있습니다. 혈관 세포의 공 배양은 혈관벽과 혈관 기계적 시그널링 응답에 대한보다 정확한 그림 반사 세포 - 세포 상호 작용이다. 흐름의 동적 및 평균 (또는 정상) 성분 세포 반응을 포함 유동 역학의 기여는, 따라서 질병 병리 및 치료 효능을 결정하는 중요한 메트릭이다. 시험 관내 공동 배양 모델을 도입하고, 압력 모의 심 박출량을 생성 혈액 펌프의 하류 댐핑 통해, 각종 동맥 질환의 병리 상태를 조사 할 수있다.

유동 조건의 유지 보수 흐름 회로 (그림 1)의 정확한 조립에 의존하고있다. 직경 튜브하기 전에 배양 한 후 챔버 유동 저항 및 후속 압력 강하를 감소시키는 큰 직경 어셈블리에서 중요한 선택이다. 의도 압력 및 유속을 보장하기 위해 의도 된 튜빙 실험 전에 유량계 시스템을 조립한다. 실리콘 가스켓 (사진 없음)에 절취선이있는 문화 챔버 진공 채널 (그림 2)의 정렬, 흐름 회로 내에서 밀봉 유지한다. 시일을 보장하기 위해, 스프링 클램프는 개스킷에 추가적인 압력을 적용하는데 사용될 수있다. 유리 슬라이드, 폴리 카보네이트 시트에 의해 보호 챔버 영역 (그림 6)에 맞게 절단해야한다. 유속이 별도로 유지 시일 합병증에 기여할 수 있기 때문에, 미디어는 미디어의 점도를 증가시키기 위해 덱스 트란의 첨가를 통해 변경 될 수있다. 증가 viscos 통해성만은, 유체는 낮은 전단 속도에서 유지할 수있다. 시스템 응답 및 무결성 단순히 댐핑 실과 ...

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 박동성 흐름 병증이 혈관 내피 세포에 미치는 영향을 in vitro에서 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리 슬라이드를 화학적으로 처리하고 단백질을 코팅하여, 흐름에 노출되는 동안 세포가 잘 부착되도록 합니다.두 번째 단계로 유동의 맥동 지수(pulsatility index)를 결정하며, 이를 통해 in vitro 유동을 문헌에 기술된 값과 비교할 수 있습니다. 다음으로, 유동 병증에 대한 세포 반응을 측정하기 위해 세포가 부착된 슬라이드를 유동 시스템에 연결합니다. 결과는 광학 현미경과 면역형광 염색을 사용하여 유동 프로파일에 따른 형태 및 단백질 발현의 변화를 보여줍니다.이 기술이 연동 펌프나 맥동 펌프에 비해 갖는 주요 장점은 흐름의 맥동성을 조절하여 질환 상태 또는 건강한 상태의 반응을 모사할 수 있다는 점입니다. 이는 동맥 질환 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, 75 mm × 50 mm × 1 mm 크기의 새 유리 슬라이드를 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 넣으십시오.그 후, 유리 슬라이드가 완전히 잠길 정도로 20% 황산 용액을 추가하고 다음 날까지 산 용액에서 하룻밤 동안 배양합니다. 슬라이드를 신선한 탈이온수에 각각 5분씩 세 번 담가 세척합니다. 헹굼이 끝나면 슬라이드를 아세톤에 30분 동안 담근 후, 6% three amino propyl trixi seline 아세톤 용액에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.다음으로, 슬라이드를 순수 아세톤으로 5분 동안 세 번 헹구며, 매 세척 시마다 아세톤을 교체합니다. 그 후, 탈이온수로 5분 동안 세 번 세척하며, 매 세척 시마다 탈이온수를 교체합니다. 이어서 슬라이드를 1.5% glutaraldehyde에 담가 60분 동안 유지합니다.가교 결합이 완료되면, 슬라이드를 탈이온수로 2회 세척하고 매 세척 시마다 탈이온수를 교체한 다음, 70% ethanol에 30분 동안 담가 멸균합니다. ethanol을 제거하고 슬라이드에 남은 잔여물이 증발하도록 둡니다. 건조 후, 슬라이드를 멸균된 탈이온수에 잠시 담가 재수화합니다.다음으로, 슬라이드 홀더를 제거하여 100 millimeter by 100 millimeter 정사각형 페트리 접시에 넣습니다. 층류 후드 내에서 기능화된 슬라이드의 세포 배양 챔버에 노출될 예상 영역을 25 microgram per milliliter 피브로넥틴 용액 1 milliliter로 코팅합니다. 그런 다음 접시를 덮고 슬라이드를 37 degrees Celsius에서 1~2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 남은 용액을 흡입 제거하고 10% FBS가 함유된 DMEM 1 milliliter에 부유시킨 혈관 내피세포 600,000개를 슬라이드의 코팅된 면에 접종합니다.챔버를 덮은 후 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 120분 동안 배양합니다. 그 다음 세포에 배지를 추가로 채우고 70~80% 합쳐질(confluent) 때까지 계속 배양합니다. 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술되고 여기에서 보여지는 것과 같이 유로 회로를 연결하며, 이때 댐핑 챔버와 초음파 유량계가 올바른 흐름 방향으로 배치되었는지 확인합니다.다음으로, 유량 회로와 저장조를 탈이온수로 채웁니다. 저장조 배출 튜브가 저장조 용액 내에 잠겨 있는지 확인하십시오. 그런 다음 유량계를 사용하여 유량 파형을 시각화합니다.감쇠 챔버의 공기 배출 밸브를 열어 액체 대 공기 부피 비율을 변경합니다. 서로 다른 액체 수준 간격에서 공기 배출 밸브를 닫고 박동 지수(pulsatility index)를 계산합니다. 지수를 계산하려면 피크가 VM max를 나타내도록 유량 파형을 평가하십시오.최저점은 v min을 나타내며, V mean은 신호 기록의 평균값입니다. 노트에 맥동 지수(puls index) 값을 기록하십시오. 향후 사용을 위해 펠트 팁 영구 마커 펜을 사용하여 댐핑 챔버에 결과 유체 레벨과 맥동 지수를 표시하십시오.유동 챔버 예열을 준비하는 동안, 동봉된 텍스트 프로토콜에 참조된 병리학 문헌을 통해 원하는 박동지수(pulsatility index) 수준을 결정하십시오. 1% FBS가 첨가된 DMEM을 37 °C 항온 수조에서 예열합니다. 세포가 70~80% 정도로 밀집(confluent)되었을 때, 배지에서 세포가 코팅된 슬라이드 하나를 꺼내 세포가 부착된 면 위에 가스켓을 배치하십시오.다음으로, 유량 챔버의 진공 채널을 가스켓의 구멍에 맞춥니다. 그 후 진공 포트에 진공 튜브를 연결하고, 배지가 진공 쪽으로 누출되지 않도록 확인합니다. 유리 슬라이드 아래에 폴리카보네이트 시트를 놓고, 유량 챔버의 짧은 쪽 양끝에 각각 하나씩, 그리고 긴 쪽 양옆을 따라 두 개의 스프링 클램프를 사용하여 유량 챔버 어셈블리를 고정합니다.다음으로, 유체 챔버, 입구 및 출구를 유체 회로에 연결합니다. 유체 시스템을 37 °C 및 5% CO2로 설정된 배양기에 넣고, 리저버에 배지를 채운 후 낮은 맥동으로 펌핑하여 회로를 예열된 배지로 채웁니다. 세포를 사전 처리하기 위해 이 흐름을 4시간 동안 유지합니다.그런 다음 댐핑 챔버의 액체 부피를 미리 표시된 맥동 지수(pulsatility index) 수준으로 조절하고, 원하는 기간 동안 세포를 배양합니다. 여기에 제시된 내피세포는 무흐름(no flow), 정상류(steady flow) 및 맥동류(pulsatile flow) 조건에서 배양되었습니다.고맥동 유동에 24시간 동안 노출된 후, 전형적인 혈관 내피 세포 형태에서 더 방추형에 가까운 형태로의 형태학적 변화가 관찰될 수 있습니다. 반면, 정적인 상태와 정상 유동에서는 형태학적 차이가 거의 없거나 나타나지 않습니다. 평활근 세포 또한 고맥동 유동에 노출된 혈관 내피 세포와의 공동 배양에 의해 영향을 받으며, 이는 여기서 alpha smooth muscle actin 및 myosin heavy chain의 서로 다른 발현 수준으로 나타납니다.다양한 유동 조건 전반에 걸쳐, 맥동류(pulsatile flow)에 노출된 세포가 두 단백질 모두에서 가장 높은 발현량을 보였으며, 이는 비대 및 수축력의 증가를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 밀봉 상태를 유지하고, 절차 완료 후 액체 수준이 일정하게 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 세포 간 상호작용과 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 혈관 내피 세포 및 혈관 세포 공배양과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 유동 회로를 조립하고, 인덱스를 제어하며, 혈관 내피 세포를 박동성 흐름에 노출시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

인간의 혈관 혈액 상호 작용을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델의 접근성이 부족합니다. 우리는 혈액(ELISA)과 혈관 구획(현미경) 모두에서 세포 상호 작용을 조사하기 위해 인간 전혈과 결합된 배양된 1차 인간 내피 세포의 체외 모델을 제시합니다.

소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

여기서, 우리는 생리적 흐름하에서 제조된 실제 크기의 3차원 인간 동맥 모델에서 내피 세포에 약물 운반대의 표적 증착을 연구하고 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시한다. 제시된 방법은 혈관 시스템 내의 약운반체를 표적으로 하는 새로운 플랫폼역할을 할 수 있다.

유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델

이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Ex Vivo (체외 주행) 3D 프린팅 생물반응기에서 큰 혈관의 관류 배양

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

배우세요 혈관 질환 연구를 위한 체외 맥동류 모델링 방법을 내피세포에 적용하여 세포 형태와 단백질 발현 변화를 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생리학적 및 병리학적 혈류 조건을 정확히 재현합니다.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

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