혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 박동성 흐름 병증이 혈관 내피 세포에 미치는 영향을 in vitro에서 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리 슬라이드를 화학적으로 처리하고 단백질을 코팅하여, 흐름에 노출되는 동안 세포가 잘 부착되도록 합니다.

두 번째 단계로 유동의 맥동 지수(pulsatility index)를 결정하며, 이를 통해 in vitro 유동을 문헌에 기술된 값과 비교할 수 있습니다. 다음으로, 유동 병증에 대한 세포 반응을 측정하기 위해 세포가 부착된 슬라이드를 유동 시스템에 연결합니다. 결과는 광학 현미경과 면역형광 염색을 사용하여 유동 프로파일에 따른 형태 및 단백질 발현의 변화를 보여줍니다.

이 기술이 연동 펌프나 맥동 펌프에 비해 갖는 주요 장점은 흐름의 맥동성을 조절하여 질환 상태 또는 건강한 상태의 반응을 모사할 수 있다는 점입니다. 이는 동맥 질환 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, 75 mm × 50 mm × 1 mm 크기의 새 유리 슬라이드를 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 넣으십시오.

그 후, 유리 슬라이드가 완전히 잠길 정도로 20% 황산 용액을 추가하고 다음 날까지 산 용액에서 하룻밤 동안 배양합니다. 슬라이드를 신선한 탈이온수에 각각 5분씩 세 번 담가 세척합니다. 헹굼이 끝나면 슬라이드를 아세톤에 30분 동안 담근 후, 6% three amino propyl trixi seline 아세톤 용액에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 슬라이드를 순수 아세톤으로 5분 동안 세 번 헹구며, 매 세척 시마다 아세톤을 교체합니다. 그 후, 탈이온수로 5분 동안 세 번 세척하며, 매 세척 시마다 탈이온수를 교체합니다. 이어서 슬라이드를 1.5% glutaraldehyde에 담가 60분 동안 유지합니다.

가교 결합이 완료되면, 슬라이드를 탈이온수로 2회 세척하고 매 세척 시마다 탈이온수를 교체한 다음, 70% ethanol에 30분 동안 담가 멸균합니다. ethanol을 제거하고 슬라이드에 남은 잔여물이 증발하도록 둡니다. 건조 후, 슬라이드를 멸균된 탈이온수에 잠시 담가 재수화합니다.

다음으로, 슬라이드 홀더를 제거하여 100 millimeter by 100 millimeter 정사각형 페트리 접시에 넣습니다. 층류 후드 내에서 기능화된 슬라이드의 세포 배양 챔버에 노출될 예상 영역을 25 microgram per milliliter 피브로넥틴 용액 1 milliliter로 코팅합니다. 그런 다음 접시를 덮고 슬라이드를 37 degrees Celsius에서 1~2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 남은 용액을 흡입 제거하고 10% FBS가 함유된 DMEM 1 milliliter에 부유시킨 혈관 내피세포 600,000개를 슬라이드의 코팅된 면에 접종합니다.

챔버를 덮은 후 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 120분 동안 배양합니다. 그 다음 세포에 배지를 추가로 채우고 70~80% 합쳐질(confluent) 때까지 계속 배양합니다. 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술되고 여기에서 보여지는 것과 같이 유로 회로를 연결하며, 이때 댐핑 챔버와 초음파 유량계가 올바른 흐름 방향으로 배치되었는지 확인합니다.

다음으로, 유량 회로와 저장조를 탈이온수로 채웁니다. 저장조 배출 튜브가 저장조 용액 내에 잠겨 있는지 확인하십시오. 그런 다음 유량계를 사용하여 유량 파형을 시각화합니다.

감쇠 챔버의 공기 배출 밸브를 열어 액체 대 공기 부피 비율을 변경합니다. 서로 다른 액체 수준 간격에서 공기 배출 밸브를 닫고 박동 지수(pulsatility index)를 계산합니다. 지수를 계산하려면 피크가 VM max를 나타내도록 유량 파형을 평가하십시오.

최저점은 v min을 나타내며, V mean은 신호 기록의 평균값입니다. 노트에 맥동 지수(puls index) 값을 기록하십시오. 향후 사용을 위해 펠트 팁 영구 마커 펜을 사용하여 댐핑 챔버에 결과 유체 레벨과 맥동 지수를 표시하십시오.

유동 챔버 예열을 준비하는 동안, 동봉된 텍스트 프로토콜에 참조된 병리학 문헌을 통해 원하는 박동지수(pulsatility index) 수준을 결정하십시오. 1% FBS가 첨가된 DMEM을 37 °C 항온 수조에서 예열합니다. 세포가 70~80% 정도로 밀집(confluent)되었을 때, 배지에서 세포가 코팅된 슬라이드 하나를 꺼내 세포가 부착된 면 위에 가스켓을 배치하십시오.

다음으로, 유량 챔버의 진공 채널을 가스켓의 구멍에 맞춥니다. 그 후 진공 포트에 진공 튜브를 연결하고, 배지가 진공 쪽으로 누출되지 않도록 확인합니다. 유리 슬라이드 아래에 폴리카보네이트 시트를 놓고, 유량 챔버의 짧은 쪽 양끝에 각각 하나씩, 그리고 긴 쪽 양옆을 따라 두 개의 스프링 클램프를 사용하여 유량 챔버 어셈블리를 고정합니다.

다음으로, 유체 챔버, 입구 및 출구를 유체 회로에 연결합니다. 유체 시스템을 37 °C 및 5% CO2로 설정된 배양기에 넣고, 리저버에 배지를 채운 후 낮은 맥동으로 펌핑하여 회로를 예열된 배지로 채웁니다. 세포를 사전 처리하기 위해 이 흐름을 4시간 동안 유지합니다.

그런 다음 댐핑 챔버의 액체 부피를 미리 표시된 맥동 지수(pulsatility index) 수준으로 조절하고, 원하는 기간 동안 세포를 배양합니다. 여기에 제시된 내피세포는 무흐름(no flow), 정상류(steady flow) 및 맥동류(pulsatile flow) 조건에서 배양되었습니다.

고맥동 유동에 24시간 동안 노출된 후, 전형적인 혈관 내피 세포 형태에서 더 방추형에 가까운 형태로의 형태학적 변화가 관찰될 수 있습니다. 반면, 정적인 상태와 정상 유동에서는 형태학적 차이가 거의 없거나 나타나지 않습니다. 평활근 세포 또한 고맥동 유동에 노출된 혈관 내피 세포와의 공동 배양에 의해 영향을 받으며, 이는 여기서 alpha smooth muscle actin 및 myosin heavy chain의 서로 다른 발현 수준으로 나타납니다.

다양한 유동 조건 전반에 걸쳐, 맥동류(pulsatile flow)에 노출된 세포가 두 단백질 모두에서 가장 높은 발현량을 보였으며, 이는 비대 및 수축력의 증가를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 밀봉 상태를 유지하고, 절차 완료 후 액체 수준이 일정하게 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 세포 간 상호작용과 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 혈관 내피 세포 및 혈관 세포 공배양과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 유동 회로를 조립하고, 인덱스를 제어하며, 혈관 내피 세포를 박동성 흐름에 노출시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.