Name: 절제 잎 분석과 쌍자엽 잡초의 제초제 대사의 요금을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 쌍자엽 잡초의 제초제 대사율을 절제 잎 분석법으로 측정하는 방법을. 방사성 표지 제초제와 HPLC 분석을 활용하여 정확한 대사 속도를 산출하고, 전체 식물 시험의 변이성을 줄여 효과적인 잡초 관리 전략 수립에 기여합니다.

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식물 성장 및 추출에 도움을 주신 Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, Brittany Janney, 크로마토그래피 분석을 지원해 주신 Dr. Anatoli Lygin, 그리고 자금을 지원해 주신 Syngenta Crop Protection에 감사드립니다.

1. 식물 재료, 성장 조건, 그리고 식물 복제 참고 : 세 waterhemp 집단이 연구 조사 하였다 : MCR (아담스 카운티, 일리노이에서), ACR, 및 WCS (맥린 카운티, 일리노이에서) (표 1) (웨인 카운티, 일리노이에서). <ol><li> 수집하여 0.1 g L-1 한천 waterhemp 씨앗 일시 : 발아를 강화하기 위해 적어도 30 일 동안 4 ℃에서 용액을 물. 참고 : 일부 waterhemp 인구가 휴면 있지만,이 단계는 휴면을 극복하고 종자가보다 균일하게 발아 할 수 있도록 도와줍니다. </li><li> 온실에서 화분 매체를 포함하는 12 X 12cm 트레이에 (표 1에서와 같이) 각 waterhemp 인구의 씨앗을 발아. <ol><li> 16/8 시간의 광주 (12) 내에 22분의 28 ° C를 주 / 야간 온도에서 온실 조건을 유지한다. </li><li> 500 μmol m의 최소값을 제공하는 할로겐화 수은 램프로부터의 빛을 온실에서 자연광을 보충 -2 </SUP&gt; 공장 캐노피 수준에서 초 -1 광자 플럭스. </li></ol></li><li> 그들은 80cm 온실에서 3 냄비에 2cm 키가 큰 경우 이식 모종을 등장. </li><li> 1 : 1 : 포팅 믹스의 1 : 1 혼합물 토양 : 이탄 : 모래 모종 4cm 키가 950cm 3를 포함하는 3 냄비에 이식 모종. 각각의 냄비에 서방 비료 과립 5g을 추가하고이 토양 혼합물로 섞는다. </li><li> 혀끝의 지배력을 제거하기 위해 잘라 7cm 키가 큰 식물에서 세 어린 잎을 포함하는 촬영을 혀끝의 분열 조직을 제거합니다. 참고 :이 단계는 각 공장은 복제 할 수있는 충분한 3cm의 겨드랑이 촬영을 증가 할 것을 보장한다. </li><li> 모종 (표 1에서와 같이) 각 waterhemp 인구에서 높이 약 14cm가 소비세 다섯 겨드랑이 촬영 (길이 3cm). 추가 처리시 수분 손실을 줄이기 위해 이러한 겨드랑이 촬영에 잎의 대부분을 제거 할 수 있지만 이식에 추가 성장을 할 수 있도록 두 어린 잎을 유지합니다. <br/&gt; 참고 : 신중하게 처리하고 잎을 제거 할 때 촬영이 손상되지 않도록하려고합니다. 지분 각 공장 레이블. </li><li> 이식 겨드랑이는 발아에 사용 된 것과 같은 매체 포팅 매체에 80cm 3 냄비 (냄비 당 하나의 경종)로 촬영합니다. 포팅 매체는 초기에 포화 성장 챔버에 뿌리를 형성 할 때까지, 다음 뿌리를 설정하기 위해 7 일간 성장 챔버에서 일정한 수분과 장소 냄비를 유지해야한다. 참고 : 식물이 시점에서 매우 민감하고 스트레스를해서는 안된다. <ol><li> 16/8 시간의 광주 (12) 내에 22분의 28 ° C를 주 / 야간 온도에서 성장 챔버 조건을 유지한다. </li><li> 백열등과 형광등의 조합이 성장 챔버에서 광을 제공하는데 사용될 수 있고, 적어도 550 μmol m -2의 식물 캐노피 수준에서 12 초 -1 광자 플럭스를 제공한다. </li></ol></li><li> 950cm 3 냄비에 다시 이식 (포트 당 하나의 경종) C1 : 1 : 포팅 믹스의 1 : 1 혼합물 토양 : 이탄 : 3 ontaining 복제 식물이 4cm 높이있을 때 모래를 다시 온실로 전송, (도 5g 서방 비료 과립을 포함한다). </li><li> 상술 한 바와 같은 방법을 사용하여 식물을 한 번 복제 (즉, 반복 단계는 1.5 내지 1.8, 및 2.1 단계로 진행). 전형적인 시간 코스 연구를 위해, 각 waterhemp 인구에서 최소 6 독립적 인 식물에서 클론을 생성하고 라인 MCR 1-6, ACR 1-6과 WCS 1-6로 기록한다. <ol><li> 실험을 반복하고 적절하게 각 waterhemp 인구 내에서 유전 적 다양성을 표현하기 위해 적어도 6 별개 &quot;부모&quot;클론 라인을 설정합니다. </li><li> 분석 얼마나 많은 시간이 지점에 따라, 시간 코스 연구를 수행하기 위해 각 &quot;부모&quot;클론 라인에서 충분히 서브 클론을 생성합니다. </li></ol></li></ol> 2. 절제 Waterhem과 대사 연구를 실시P 잎 <ol><li> 복제 waterhemp 식물 제초제 대사와 DT (50) 분석을위한 높이 10~12cm이 때 세 번째로 어린 잎 (첨부 잎자루 0.5 CM을 포함 길이 2-3cm)을 절제. </li><li> 각 waterhemp 공장에서 잘라 잎은 잎자루 두 번째 물 속에서 (잎자루의 0.3 cm가 될 수 있도록 보장),이 컷은 1.5 ml의 플라스틱 병 (유리 병 당 하나의 잎) (15)에 종료 놓습니다. 참고 : 물에서 두 번째로 절단 형성과 목부 혈관을 연결에서 공기 방울을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 첫째, 부분적으로 1 시간 동안 0.1 M 트리스 - 염산 (PH 6)의 사전 배양 버퍼 (200 μL)에서 컷 잎자루와 잎 적출 몰입. </li><li> 둘째, 새로운 1.5 ml의 유리 병 0.1 M 트리스 - 염산 (PH 6) 플러스 150 μM [URL- (14) C] 제초제 (200 μL) 배양 버퍼를 포함하는 각 잎을 이동하고, 1 시간 동안 28 ℃에서 배양 잎에 제초제 흡수 할 수 있습니다. 참고 : 모두 14 C-메소 트리 온 및 <s최대&gt; (14) C-primisulfuron 메틸 약 20의 MCI 밀리몰의 특정 활동에서 우리의 연구에 사용되었다 -1. 목부 증산 스트림을 통해 두 확산 및 흡수는 잎 당 흡수 제초제의 양에 기여한다. 주 : 제초제 대사 대사 억제제의 효과는 단계 2.2.1 및 2.2.2 상기 수정에 의해 결정될 수있다. 사전 배양 버퍼에 억제제의 100 μM을 추가 한 다음 제초제와 배양 버퍼로 전송하고 다시 100 μm의 억제제를 추가, 2 시간 동안 품어 보자. 예를 들어, 말라 티온 및 tetcyclacis 식물 15-17 특정 시토크롬 P450 활동을 억제한다. </li><li> 탈 이온수로 절제 잎의 침지 부분을 세척하고 분기 강도 무라 시게과 스쿡 (MS) 염 용액 (500 μL)는 각각 0 시간, 5 시간, 11 시간, 23 시간, 35 시간, 용에 절제 잎을 전송, 시간 코스 대사 연구를위한 성장 챔버. </li></ol></li><li> 휴가를 제거하여 수확수동 배양 적절한 시점에서의 용액은 폴리 프로필렌 튜브 (15 mL) 및 유리 유봉을 사용하여 액체 질소의 각 잎 조직을 분쇄. </li><li> 방사성 표지 제초제와 위와 같은 폴리 프로필렌 튜브 실험실 조직 균질 90 % 아세톤의 7 ml의 각 잎에서의 대사 산물의 압축을 풉니 다. 90 % 아세톤의 추가 7 ml의 조직 균질 린스, 그리고 조직이 철저하게 (보통 2 분) 분쇄 될 때까지 균질화를 계속합니다. 참고 : 90 % 아세톤 식물 조직에서 가장 제초제의 추출에 사용될 수있다. 이 방법은 흡수 된 방사성 표지 화합물의 90 % 이상을 추출 할 수없는 경우에는, 90 % 메탄올, 90 % 아세토 니트릴을 추출 용매로 치환 될 수있다. </li><li> 추가 추출이 발생하는 레이블 90 % 아세톤 추출물 (14 ml의 총)과 상점은 -4 16 시간 동안 C를 허용하는 °. 참고 : 처리 된 잎의 추출 후, 추출 방사선의 양을ioactivity는 처리 잎에 흡수 방사성 표지 화합물의 적어도 98 %가 일반적이다. 절제 잎에 비 추출 방사능 (결합 잔류 물은) 우리의 이전 연구 (12)의 모든 시점에서 0.3 %로 평균,하지만이 금액은 조사 된 사용 제초제와 시점에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 0.5 ㎖의 최종 부피까지 원심 분리를 10 분 동안 5,000 XG에 샘플 및 로타리 증발기로 40 ℃에서 농축 상청액이 얻어진다. 2.0 ml의 플라스틱 튜브에이 볼륨을 전송합니다. </li><li> 식물의 최종 부피는 1.25 ml의 추출 조정하고 다시 원심 분리기를 10,000 XG에 10 분 동안 모든 입자를 제거하기 위해 (볼륨 1, 1) 물 : 아세토 니트릴을 추가합니다. </li><li> (DPM μL -1) 액체 섬광 분광 (LSS) (12)에 의해 각각의 샘플에서 가져온 나누어 총 방사능을 측정하고 양을 정상화 (예를 들어, HPLC 분석을 위해 주입 화합물, 10,00 [14 C 표지]결과를 그래프 0 총 DPM / 샘플 / 실행) 그래서 Y 축 샘플에서 통일 될 것입니다. </li></ol> 절제된 잎에서 제초제 대사 3. HPLC 분석 주 : 다음 RP-HPLC 조건 (12)를 사용하여 부모 제초제 제초제 대사로 총 추출 방사능를 해결합니다. <ol><li> 1ml의 분의 유속으로 18 C 컬럼 (4.6 × 250mm, HPLC 분석 용 5 ㎛의 입자 크기)와 RP-HPLC를 수행 -1 가장 비극성 대한 제초제. 주 : 4 C 또는 C 12 RP-HPLC 컬럼은 또한 대사에서 상위 제초제의 분리를 최적화하기 위해 사용될 수있다. 미리 열 필터 및 / 또는 보호 컬럼은 보호 RP 컬럼의 수명을 연장하는 데 사용될 수있다. <ol><li> 리제, 물에 0.1 % 포름산 (V / V)와 리제 B 100 % HPLC 급 아세토 니트릴 : RP-HPLC에 대해 다음 이동상을 사용합니다. 주 : HPLC 등급 메탄올 또한 엘로서 사용될 수있다uent의 극성 화합물 및 대사 문제를 해결하기 위해 B,하지만 체류 시간도 변경 될 수 있음에 유의하십시오. 참고 : 우리의 연구 (12)에서의 극성 대사에서 메소 또는 primisulfuron 메틸를 해결하는 데 사용되는 용출 프로파일은 다음과 같습니다 1 단계 : B (4 : 1, v / v)로 : B (3 : 2, V / V ) 선형 구배 (12 분) B :에 : (2, V / V 3) : 2 단계, B (3 : 7, v / v)의 선형 구배 (5 분) 3 단계 : B :에 : (7, V / V 3) B : 2 분 선형 그라데이션 (1 9, v / v)로 (19 분의 총을 포함). 주 : 그래디언트 및 등용 매 단계 분해능을 최적화하기 위해 모재의 물성에 기초하여 조절 될 필요가있을 수있다. </li><li> B (4 : 1, v / v)의 선형 구배 (3 분) : 행 (9, V / V 1) B :와, 상기 선형 그라데이션 단계에 따라 B를 (4 : 1, V / v)의 최소 2 분 동안 등용 매 단계 () 다음 추출물 (12)를 주입하기 전에 RP 열을 다시 평형을합니다. </li></ol></li><li> 검색 및 흐름 Scinti과 방사성 동위 원소 표지 화합물을 시각화llation 분석기. 각 샘플의 총 방사능 량의 백분율로 각 샘플에 남아있는 상위 제초제의 양을 녹음 (검출하고 제조자의 지시에 따라 상기 흐름 섬광 분석기로 정량) 시간 중에 각 waterhemp 인구 제초제 대사의 속도를 결정한다. </li></ol> 4. 통계 절차 <ol><li> 완전히 무작위 디자인 (또는 통계 분석을위한 다른 적절한 배열)에서 치료를 정렬합니다. </li><li> 각 실험에 대한 세 가지 생물학적 복제로 구성된 각각의 처리, 두 개의 독립적 인 실험을 수행합니다. 두 개의 독립적 인 실험은 총 여섯 생물 복제를 포함한다. 실험 효과 (α가 = 0.05)가 아닌 심각한 경우, 각각의 독립적 인 실험으로부터의 데이터를 결합 분석. 실험 효과가 중요한 경우, 개별적으로 각 실험 분석. 참고 : 처음 세 생물학적 복제를 포함 전n은 1을 실험과 실험 2에서 향후 3 생물 복제는 각 생물 복제는 (MCR 1-6, ACR 1-6, 및 WCS 1-6) 각 집단에서 파생 된 클론 라인 있도록 별개의 &quot;부모&quot;를 나타내는 각각의 시간 - 물론 분석은 유전자 동일한 식물을 사용합니다. 두 개의 독립적 인 실험은 각 waterhemp 인구에 대한 중간 DT (50)의 유전 적 다양성과 결정의 적절한 표현을 가능하게 총 여섯 생물 복제를 포함한다. </li><li> 비선형 최소 자승 회귀 분석으로 데이터를 분석하고 DT 50 (S)를 추정하기 위해 단순 일차 곡선들을 장착한다. 아래의 방정식 모델을 설명합니다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> 여기서,이 모델 (Y)으로 시간 t에서 나머지 상위 제초제의 비율을 나타내고, μ 나 각 DT 50waterhemp 인구 내가하고 매개 변수 C 0 T = 0 (12)의 부모 제초제 현재의 추정 금액입니다. </li></ol>

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여기에 설명 된 절제 잎 방법은 옥수수가 15 나뭇잎에 primisulfuron 대사 연구에서 이전에 사용되었지만, 우리의 결과는이 프로토콜은 또한 쌍자엽 잡초 종 12 제초제 신진 대사를 측정하기위한 효과적인 정확하고 재현성이 있음을 입증. 전체 식물 연구에 비해 적출 잎 기술의 가장 큰 장점은 적출 잎은 전체 식물 전위의 출현 후 패턴, 전신 제초제 또는 식물 또는 인구 중 제초제 흡수의 차이 독립적이라는 것이다. 적출 리프 세이가 온실 조건 하에서 성장 된 전체 식물에 비해 공부 튜브에 넣고 단일 리프로, 성장 챔버에서 수행되기 때문에, 또한, 환경 적 변동성이 감소된다. 식물 복제 전략도 내 유전 분산의 큰 정도를 최소화 할 MCR (12)에 메소 트리 온 저항 메커니즘을 연구하기위한 우리의 방법에 포함트윈 Amaranthus 인구 9. 잡초 Amaranthus 집단 내 유전 적 다양성은 출현 후 제초제 <su...

잡초의 제초제 저항은 식품 및 섬유 1, 2의 글로벌 생산에 심각한 위협을 선물한다. 현재 백 이상 잡초 종에 강한 집단과 생물 형의 수천 전 세계적으로 문서화하고 3 연구되고있다. 식물에 제초제 저항성을 부여하는 주요 메커니즘은 제초제 - 단백질 결합 반응 속도 또는 대상 사이트 유전자 2의 증폭에 영향을 미치는 유전 적 변이를 포함하는 제초제 대상 사이트 유전자와 단백질의 변경입니다. 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제 (P450) 또는 글루타치온 S의 -transferase (GST) 효소의 높은 활동을 통해 대사 해독 대상 현장 기반 메커니즘 2에서 여러 가지 방법으로 구분된다 잡초의 제초제 저항성을 부여하는 또 다른 메커니즘입니다. 대사 기반의 저항 (피트니스 처벌 일명) 공장 피트니스 비용은 제초제 저항 메커니즘 정보 발생할 수 있는지 여부에 대한 상당한 파급 효과를 가지고m뿐만 아니라 잡초 개체군 1,2,4에서 교차 또는 다중 제초제 내성을 부여하는 단일 해독 메커니즘 전위에. 일반적으로 식물에 제초제 대사는 세 가지 단계 5로 나눌 수 있습니다. 증가 극성 부분 제초제 해독 5,6로 이어지는, 또는 O- 탈 알킬화 반응 - 단계 I는 방향족 고리 또는 알킬 그룹의 P450 매개 수산화, 또는 N으로 같은 제초제 변환 또는 활성화를 포함한다. 새로 나는 GSTs 감소 글루타티온에 결합에 대한 링크 사이트를 제공 할 수 있습니다 또는 단계 II 5,7에서 UDP에 의존하는 글리코에 의해 포도당 단계에 관능기를 도입했다. 예를 들어, 옥수수의 primisulfuron 메틸의 주요한 초기 대사 산물은 또한 하이드 록시 primisulfuron 글루코 내지 (단계 II)를 대사 후 장기간 저장 또는 상기 대사위한 액포로 이송 될 수 히드 록시 primisulfuron 메틸 8 인 찬성cessing 5,6 (단계 III). Waterhemp (Amaranthus의 tuberculatus)는 미국의 옥수수 생산 (ZEA이 메이), 콩 (글리신 최대), 면화을 (고십 피움 히르 수툼) 방해하기 어려운 제어, 쌍자엽 연간 잡초 종입니다. waterhemp의 유전 적 다양성의 높은 수준은 자웅 이주의 생물학 및 장거리 바람 수분에 의해 촉진되고, 하나의 여성 waterhemp 공장 만 씨앗 9 개까지 생성 할 수 있습니다. 이 씨는 자연스럽게 효과적인 분산 메커니즘 waterhemp을 부여하는, 작고 쉽게 확산됩니다. Waterhemp는 성장시기 (9)에 걸쳐 연속 발아를 표시하고, 그 씨앗은 휴면 몇 년 후 발아 할 수 있습니다. Waterhemp은 경작 할 작물 재배 시스템 (10)에있는 대부분의 잎이 넓은 잡초보다 더 높은 성장률을 가지고 C 4 식물입니다. 또한, 다수의 집단 waterhemp 여러 FAM에 내성제초제 3 ilies. 일리노이 waterhemp (MCR)의 이용의 인구는 4- 히드 록시 phenylpyruvate 시게나 제 (HPPD) 예컨대 메소 트리 온 등 -inhibiting 제초제 (11)뿐만 아니라, 아트라진 및 아세토 락 테이트 신타 제 (ALS)에, 제초제 -inhibiting primisulfuron 메틸을 포함하는 내성 비 대상 현장 기반 메커니즘 (12, 13)로 인해. 와 아트라진에 강한하지만 메소 트리 온에 민감하고, primisulfuron 메틸을 민감 WCS (14) 지정된 waterhemp 인구 (때문에 ALS 유전자의 돌연변이에) primisulfuron 메틸 내성 ACR (14) 지정 waterhemp의 다른 인구, 메소 트리 온 및 아트라진가 우리의 이전 연구 12, 현재 실험 MCR와 비교 하였다 (표 1에 요약 하였다). 초기 연구는 MCR에, HPPD 유전자 서열 또는 발현 수준의 변화, 또는 감소 메소 트리 온의 흡수를 감지하지 않았다인구 때 메소 트리 온 민감한 인구 (12)와 비교. 그러나, 전체 식물 대사 연구는 11, 12 메소 이전 표현형의 반응과 상관 ACR과 WCS에 비해 MCR에서 부모 메소 트리 온 제초제의 상당히 낮은 수준을 보여 주었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp 인구 </td><td> 약어 </td><td> 메소에 표현형 </td><td> 메소 트리 온 저항 메커니즘 </td><td> Primisulfuron에 표현형 </td><td> Primisulfuron 저항 메커니즘 </td></tr><tr><td> 맥린 카운티 저항하는 </td><td> MCR </td><td> 저항하는 </td><td> 대사 * </td><td> 저항하는 </td><td> 대사 </td></tr><tr><td> 아담스 카운티 저항하는 </td><td> ACR </td><td> Sensit필자 </td><td> - </td><td> 저항하는 </td><td> ALS (14)에 대상 사이트 돌연변이 </td></tr><tr><td> 웨인 카운티에 민감한 </td><td> WCS </td><td> 민감한 </td><td> - </td><td> 민감한 </td><td> - </td></tr></tbody></table> * 향상된 대사 이외의 비 표적 사이트 저항 메커니즘은 또한 MCR 인구 (12) 메소 트리 온 저항을 부여 할 수있다. 표 1 : 본 연구에 사용 일리노이 waterhemp 개체군의 설명. 그대로 waterhemp 모종의 제초제 대사의 비율을 결정하는 것에 더하여, 다른 실험적 방법은 개발되었으며 절제 waterhemp 리프 세이 (12)뿐만 아니라 다양한 P450 억제제 (예 tetcyclacis 및 말라 티온)를 사용하여 대사를 조사하기 이전 연구에서 사용. 이 방법은 previ에서 waterhemp을 위해 특별히 적응했다적출 된 잎의 분석이 아직 쌍자엽 식물에 제초제 대사 연구를 수행보고되지 않은 때문에 절제 옥수수에 primisulfuron 메틸 대사의 OU를 조사, 15 나뭇잎. organophophosate 살충제 말라 티온 자주 생체에 사용 된 체외 제초제 대사 연구에서 P450의 참여 (16)를 나타냅니다. 예를 들어, 관용과 옥수수에 메소 트리 온의 빠른 대사는 말라 티온은 메소 트리 온 (17) 옥수수 감도를 증가 할 때 확인되었다 P450 - 촉매 링 수산화,에 기인한다. 마찬가지로, 말라 티온은 절제 옥수수에서 루게릭 병 억제제 primisulfuron 메틸 15 잎의 신진 대사를 억제 하였다. 식물 조직, 출현 후 제초제의 대사를 평가할 때 적출 리프 기술의 주요 이점은, 생성 된 데이터는 전체 플랜트 전위 패턴 무관하다는 것이다, 중요한 요인을 고려한다. 따라서,이 방법은 정량 할 수 있으며질적 대사는 단일 처리 리프 (12)에 초점을 분석한다. 식물 클로닝 전략은 적출 리프 프로토콜과 함께, 이전에 대사 과정 (12)을 실시 waterhemp에 이용 하였다. 때문에 waterhemp (별도의 남성과 여성의 식물)과 자웅 이주 Amaranthus 종 (9) 내에서 유전 적 다양성의 큰 정도의 이종간 교배 특성으로,이 프로토콜은 유 전적으로 동일한 waterhemp 모종 시간 코스 실험에서 분석 하였다 것을 보장. 이 문서는 쌍자엽 잡초 (waterhemp)에서 제초제 신진 대사의 속도를 측정하기위한 절제 잎 방법의 유틸리티를 보여줍니다. 부모 제초제의 양 (흡수 된 제초제의 50 %가 저하하는 시간을 추정하기 위해 단순 일차 곡선 적합 하였다 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 각각의 시간 점 (도 1)에서 측정 한 한 나머지 DT 50). 대리인역상 고속 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)에서 크로마토 내성 ALS-및 시간 과정 연구 중에 부모 제초제 및 극성 대사 산물 (들)의 병용 형성의 소실을 나타내는 과민 waterhemp 인구 (그림 표시되는 2). 우리 문서의 포커스가 균일 링 - 표지 (URL- 14 C) 제초제를 사용하여 설명하고 쌍자엽 식물 제초제 대사의 정확하고 재현 가능한 요금을 결정하기위한 식물 클로닝 방법과 조합 적출 리프 분석의 유용성을 입증하는 것이다 자신의 전체 식물의 반응에 차이가 세 waterhemp 인구는 HPPD-하고 루게릭 병 억제 제초제 (표 1).

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>사전 발아 씨앗</td></tr><tr><td>포팅 미디엄</td><td>Sun Gro 원예</td><td>49040233</td><td>식물 성장을 위한</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&nbsp;</td><td>총 혼합물 13-13-13 T100</td><td>느린 방출 비료</td></tr><tr><td>성장 챔버 E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td><td>식물 배양</td></tr><tr><td>Tris 기반</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>절제 잎용</td></tr><tr><td>버퍼 HCl (집중)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td> 버퍼 <td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog (MS) 염의 pH 조정&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>절제 잎의 배양</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A452-4</td><td>잎 배양 후 세척</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>식물 추출물</td></tr><tr><td>아세토니트릴 (HPLC 등급)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC 이동상</td></tr><tr><td>포름산&nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analytical</td><td>MK259205</td><td>Acidify mobile phase, pH</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5417R</td>, <td>1.5 또는 2.0 ml 튜브</td></tr>, <tr><td>원심분리기(온도 조절)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td>, <td>15 또는 50 ml 튜브</td></tr><tr><td>, 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td>, <td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, 멸균</td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>B&Uuml; CHI</td><td>R200</td><td>농축 식물 샘플</td></tr><tr><td>액체 섬광 분광법 (LSS)</td> <td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>14C</td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토그래</td>피 <td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>제초제 대사 산물</td></tr><tr><td>분해 흐름 섬광 분석기&nbsp;</td><td></td><td>14C</td><td></td></tr> <tr><td>Hypersil Gold C18 컬럼</td>의 HPLC 분석을 위한 LabLogic 시스템 1103303<td>써모사이언티픽</td><td>03-050-522&nbsp;</td><td>역상</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M 칵테일</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>Flow-scintillation 분석기</td></tr><tr><td>Scintillation 칵테일 (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>for LSS; 생분해성</td></tr><tr><td>실험실 균질화기</td><td>Kinematica</td><td>CH-6010&nbsp;</td><td>잎 시료 균질화</td></tr></tbody></table>

절제 잎 분석과 쌍자엽 잡초의 제초제 대사의 요금을 측정

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

절개 쌍떡잎 잡초인 워터헴프(Amaranthus tuberculatus)에서 제초제 대사 속도를 분리하고 정확하게 결정하기 위해 제초제 흡수를 정상화하고 제초제 내성(R) 및 제초제에 민감한(S) 워터헴프 개체군에 기여하는 요인인 전좌를 제거하기 위해 식물 복제 전략과 결합된 절제 잎 분석을 개발했습니다. 식물의 유기 살충제에 대한 생체 역학 분석에는 일반적으로 흡수, 전좌(표적 부위로의 전달), 대사 운명 및 표적 부위와의 상호 작용 측정이 포함됩니다. 제초제 대사는 제초제 저항성 잡초 및 제초제 내성 작물에서 측정해야 하는 중요한 파라미터이며, 일반적으로 방사성 표지된 제초제를 사용한 전체 식물 테스트로 수행됩니다. 그러나 전체 식물 방법에서 파생된 생체 역학 매개변수를 해석하는 데 있어 한 가지 어려움은 극성 대사 산물은 일반적으로 제초제 해독 반응 후 식물 내에서 움직이지 않기 때문에 전좌가 제초제 대사 속도의 영향을 받는 경우가 많다는 것입니다. 이 원고에 기술된 프로토콜의 장점으로는 R 및 S 개체군에서 제초제 분해율의 재현 가능하고 정확하며 신속한 측정, 방사성 표지된 제초제 소비량의 상당한 감소, 추가 취급 및 폐기가 필요한 방사성 표지된 식물 물질의 대폭적인 감소, 온실 대신 실험실 또는 성장실에서 방사성 표지된 제초제 실험을 수행할 수 있는 능력 등이 있습니다. 제초제 내성이 전 세계적으로 쌍떡잎 잡초 개체군에서 계속 발전하고 확산됨에 따라, 본 명세서에 개발 및 설명된 절제 잎 분석 방법은 제초제 대사 및 해독 속도 향상으로 인해 비표적 부위 기반 저항성을 조사하는 데 매우 유용한 기술을 제공할 것입니다.

메소 트리 온 신진 대사의 속도에 큰 차이는 WCS 또는 ACR과 MCR (그림 1) 중 하나를 사이에 검출되었다. 각각의 시점에서, MCR은 더 빠른 속도로 이전의 전체 공장의 표현형 응답 (11)과 상관이 메소 트리 온 민감한 인구, WCS 및 ACR보다 메소 트리 온을 물질 대사로 변화했다. 각 집단에서 단일 부모의 공장에서 충분히 식물을 복제하여, 제초제 대사 시간 코스 분석에 의한마다 코스 (12) 내에서 유전 적 다양성의 부족으로 균일하고 재현성이다. 예를 들어, 클론 5 호선 12 메소 대사의 시간 과정은 그림 1에 표시됩니다. 여섯 가지 클론 라인의 총 여섯 개별 부모 식물에서 파생 된 각 인구 (표 1)에서 분석 하였다 전체 평균 (DT)를 결정하기 위해 MCR에 그 메소 트리 온 신진 대사를 표시 (50) 값이 훨씬 빠르게이었다 ( <e즉, ...

이 원고는 쌍떡잎 잡초에서 절제된 잎으로 제초제 대사율을 효과적으로 정량화하여 변동성을 줄이고 전체 식물 분석에서 일반적으로 관찰되는 제초제 흡수 또는 전좌의 가능한 교란 효과를 제거하는 방법을 설명합니다.

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 절단 잎 분석법을 사용하여 둑새풀의 제초제 대사를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 온실과 생장 챔버에서 둑새풀 집단을 식재하고 클로닝합니다. 두 번째 단계는 절단한 둑새풀 잎을 방사성 표지 제초제와 함께 배양하고 시간 경과 연구를 수행하는 것입니다.다음으로, 배양된 잎에서 제초제와 그 대사물을 추출합니다. 마지막 단계는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 제초제와 대사물을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 이 절단 잎 분석법은 서로 다른 잡초 집단 또는 종에서의 정확한 제초제 대사율을 결정하는 데 사용됩니다.이 기술 또는 잎이나 식물 전체에 방사성 표지 제초제를 점적하는 것과 같은 기존 방법의 주요 장점은, 유전적으로 동일하거나 조화로운 묘목을 독립적으로 분석하거나 식물 전체의 전이 과정을 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 잡초의 제초제 저항성 메커니즘이나 작물의 제초제 내성 메커니즘을 결정하는 것과 같이 식물 생화학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. HPRC 절차의 시연 과정이 평가될 것입니다.저희 실험실의 대학원생인 Skeleton이 준비 과정에서, 물냉이(waterhemp) 종자를 수집하여 수성 오거 배지에 현탁하였습니다. 그 후 종자의 휴면을 타파하여 발아율을 높이기 위해 해당 배지 내에서 4°C로 최소 30일 동안 보관하였습니다. 준비가 된 종자는 광주기 16/8시간, 주간 온도 28°C, 야간 온도 22°C 조건의 온실에서 발아시켰습니다.12 by 12 centimeter 트레이에 담긴 종자는 수은 결합 램프로부터 500 micromoles per square meter per second의 광자속에 해당하는 보조 광원을 제공받습니다. 실험적 변동성을 상쇄하기 위해 캐노피 수준에서 각 집단으로부터 6개의 유묘를 복제하여 준비합니다. 유묘의 높이가 2 centimeter가 되면 80 CC 화분으로 이식합니다.묘목의 높이가 4 cm가 되면, 상토, 피트, 모래를 3:1:1 비율로 혼합하여 준비합니다. 혼합토를 950 cc 화분에 채우고, 각 화분에 완효성 비료 알갱이 5 g을 추가합니다.그 다음, 화분당 한 포기씩 묘목을 이식합니다. 식물의 높이가 7cm가 되면, 정아우세성을 제거하고 클로닝을 위한 충분한 곁눈을 확보하기 위해 가장 어린 잎 3개가 포함된 줄기 끝부분의 정단부를 절단하여 제거합니다.이후 식물이 14 cm에 도달하면, 연구

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