Name: 엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 병원성 박테리아의 바이오필름을 쿼럼 퀜칭 락토나아제로 분해하는 방법을 A.baumannii S1을 사용하여 연구합니다. 이 기술은 항균 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 싱가포르 교육부 학술연구기금, 싱가포르 국립의학연구위원회(National Medical Research Council) 및 국립연구재단(National Research Foundation)의 보조금으로 지원되었습니다.

A의 biofilm 형성 1. 크리스탈 바이올렛 정량 baumannii가 S1 <ol><li> A의 5 ml의 문화를 성장 원성 국물에 baumannii가 S1 (LB) 16 시간 동안 진탕 배양기 (220 RPM)에서 30 ° C에서 (트립 톤 10g / L, 효모 추출물 5g / L). </li><li> A의 문화를 조정 원하는 OD 0.8 600 baumannii의 (S1). 96 웰 플레이트를 사용하여, 박테리아 배양 접종 : GKL 정제 효소 (40 ㎎ / ㎖) 10 ㎕를 함유 신선한 LB으로 (1 내지 100 희석); 새로운 문화의 최종 부피는 100 μL입니다. </li><li> 뿐만 아니라 제어 문화를 준비; 이 모든 효소가 포함되지 않습니다. 복제의 수를 수득 된 것과 유사한 조건을 반복한다. </li><li> 뚜껑 판을 덮고 밀봉 (10) L 플라스틱 용기에 넣습니다. 부드럽게 매체를 제거하기 전에 3 시간 동안 30 ℃에서 플레이트를 배양한다. </li><li> 잘 신선한 LB 배지의 또 다른 100 μl를 추가하고 30 ℃에서 21 시간 동안 접시를 품어. </li&gt; <li> 배양의 두 번째 기간 후, 부드럽게 모든 용지를 제거합니다. 200 μL 멸균 수와 플랑크톤 박테리아 세포를 씻으십시오. 세탁시 세포에 최소한의 방해가 있는지 확인합니다. </li><li> 각 웰에 1 % 크리스탈 바이올렛 용액 100 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 200 μL 멸균 수로 잘 세척하여 크리스탈 바이올렛 솔루션을 제거합니다. 두 번 이상 세척을 반복합니다. </li><li> 각 웰에 33 % 아세트산 100 μl를 추가하고 부드러운 동요와 15 분 동안 품어; 이는 염료를 용해한다. </li><li> 600 nm에서의 크리스탈 바이올렛의 흡광도를 측정함으로써 바이오 필름 형성의 양을 정량. 크리스탈 바이올렛의 양은 형성된 바이오 필름의 양에 비례한다. </li></ol> A. 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 baumannii가 S1 바이오 필름 <ol><li> A의 5 ml의 문화를 성장 16 시간 동안 진탕 배양기 (220 RPM)에서 30 ° C에서 LB에서 baumannii의 (S1). </li><li> 광고A의 바로 문화 원하는 OD 0.8 600 baumannii의 (S1). 35mm 유리 바닥 μ-접시를 사용하면, 세균 배양 접종 : 정제 GKL 효소 (40 ㎎ / ㎖)의 30 μl를 포함하는 신선한 LB에 (1 100 희석); 새로운 문화의 최종 부피는 1 ml의입니다. </li><li> 뚜껑 μ-접시를 덮고 밀봉 (10) L 플라스틱 용기에 넣습니다. 부드럽게 용지를 제거하기 전에 3 시간 동안 30 ° C에서 μ-접시를 품어. 1 ML의 총 부피에 데려 정제 GKL 효소와 신선한 매체의 30 μl를 추가합니다. 30 ° C에서 또 다른 21 시간 동안 품어. </li><li> 단계를 반복 2.3 및 30 ℃에서 또 다른 24 시간의 μ-접시를 품어. 그런 다음, 부드럽게 용지를 제거합니다. </li><li> μ-접시에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)에 용해 5 μg의 / ㎖ 알렉스 FLUO 488 - 복합 밀 배아 응집소 (WGA)의 500 μl를 추가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양; 이렇게 형성된 바이오 필름을 염색한다. T 염색 액을 제거하고 세척그는 μ-요리 HBSS 2 ㎖과 함께합니다. 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 3.7 % 포름 알데히드 HBSS에 용해시키고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양의 500 μl를 추가; 이 μ-요리 상 생물막을 수정합니다. HBSS 2 ㎖로 한 번 μ-접시를 세척 한 후 완전히 솔루션을 제거합니다. μ 디시 생물막 고정 전에 CLSM 촬상 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li><li> CLSM 이미징 및 분석을 위해, 스택 당 0.21 μm의 간격으로 이미지 당 97 스택을 생성하기 위해 63 배 배율을 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

실험의 두 세트에서, A. baumannii의 S1은 박테리아 (15)에 의해 형성된 바이오 필름의 양을 줄일 수있다 높은 염 농도의 NaCl없이 LB 배지에서 배양 하였다. 이러한 인공물의 존재는 생물막의 형성 량뿐만 아니라 다른 처리 조건에 걸쳐 정수 담금질 효소의 영향을 과소 있었다. 촉매 비활성 효소의 사용은 효소 격리의 가능한 효과를 제거하기 위해 음성 대조군 중요하다. 비활성 효소 쿼럼 분자를 격리시키는 경우에도 1은 그림, 생물막 형성은 중단되지 않습니다. A. baumannii의 S1은 96 웰 플레이트의 웰에 공기와 액체의 계면 섬세 생물막 링형 구조를 형성한다. 따라서, 세균의 생물막 우발적 제거를 방지하기 위해 매체의 제거 및 세척 단계 동안 과도한 교반을 피하기 위해 중요하다. LB 미디어는 각 배양 후 제거플랑크톤 세포를 제거 할 수 있습니다. 또한, 96- 웰 플레이트에...

감염성 질환에 대한 치료 옵션은 항생제 1 광범위한 면역 다제 내성 박테리아에 급격한 증가에 의해 복잡 하였다. 내성 세균 - 매개 감염에서 높은 이환율 및 사망률, 신약 개발 과정을 확대 및 / 또는 치료 옵션을 향상시키기 위해 더 항균 대안을 모색 할 필요가있다. 최근에, 항 병원성 접근법 따라서 저항 메커니즘 (2)의 위험을 완화, 비 살균 방법을 통해 독성을 예방 가능성 주어진 관심을 얻고있다. 쿼럼 센싱 박테리아 독성이 신호 현상의 중단에 &#39;마스터 스위치&#39;는 발병 3에 대한 유망한 항 독성 방법이다. 세균 집단 임계 밀도에 도달 한 후 독성의 발현은 세포 외 환경에서 정수 분자의 축적을 필요로한다. 로 현럼 분자는 자신의 동족 수용체와 결합하면 독성 인자의 활성화뿐만 아니라 항생제 내성 및 biofilm 형성 (4)과 관련된 유전자지도, 세포 내 매트릭스로 다시 확산. 일반적으로, 정족수 감지 중단에 차 대사 경로에 영향을주지 않고 쿼럼 분자와 수용체의 상호 작용을 억제하는 것을 포함한다. 따라서,이 세포 성장에 직접적인 의미가 없습니다. 체력이 저하되지 않기 때문에, 발전 및 치료에 대해 5 저항을 얻기위한 최소한의 박테리아 선택 압력이 존재한다. 또한, 정수 감지 중단은 항균제으로부터 보호를 제공하고, 면역 반응을 호스팅 생물막 형성의 경우와 같이, 고유 세균성 보호 메커니즘을 방해 할 수있다. 그것은 지구에 미생물의 99 %가 일 이내 거주 미생물에 중요한 생존의 장점을 부여, 복잡한 바이오 필름 같은 행렬에 존재하는 것으로 추정된다ESE 구조 6. 더욱 중요한 것은,이 고착 영역의 형성은 가장 지속적인 만성 병원 내 감염 (7)의 원인이다. Acinetobacter baumannii의 글로벌 병원 내 감염과 연관되어 있고 그 독성이 크게 정수 감지에 기인 주요 인간 병원체 중 하나 인 - 매개 biofilm 형성 8. 정원 담금질 효소는 그람 음성균 (9)에 의해 생성되는 N 아실 호모 세린 락톤 (AHLs)로 공지 된 화합물의 그룹을 대상으로하여 정수 - 매개 신호 전달을 방해에서 성공적으로 사용되어왔다. 여러 연구는 또한 생물막 10,11 독성 인자의 발현 및 세포 수의 감소를 통해 박테리아 발병을 차단하는이 효소의 용도에 확대. 불행하게도, 세균성 병원체에 의한 바이오 필름 형성에 대한 쿼럼 담금질 효소의 효과적인 사용의 만져서 알 수있는 데모의 부족이 남아있다. 그만큼다시 A를 방해, 쿼럼 억제제 (AHL 유사체), 대신 쿼럼 담금질 효소를 사용하려고왔다 baumannii의 생물막 형성 (12). 작은 분자 억제제를 사용하는이 방법은 유효한 방법이지만, 병진 용도에서의 생체 이용률을 유지하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 효소는 치료 효과에 대한 생의학 장치의 표면에 고정화 향해 더 의무만큼 반대로, 촉매 정수 담금질 효소의 사용은 생체 이용률 문제를 회피 할 수있다. 여기, 우리는 크리스탈 바이올렛 염색 및 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)를 사용하여, Geobacillus의 kaustophilus (GKL) 세균 바이오 필름 ​​형성에 13에서 설계 쿼럼 담금질 lactonases의 효과에 대한 평가에 대해 설명합니다. 이 연구는 임상 적으로 A의 생물막 중단되는 최초의 성공적인 데모입니다 쿼럼 담금질 효소를 사용하여 baumannii의 S1 변형. 방법 설명본 연구에서 병원성 그람 음성 세균에 대한 후속 치료 개발 노력에 다른 쿼럼 담금질 효소의 효능을 평가하는 데 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>트립톤&nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>실험실-스캔</td><td>PLA00654X</td><td>주의: 가연성</td></tr><tr><td>&mu;-dish</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-conjugated WGA</td><td>인비트로젠</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>행크' S 균형 잡힌 소금 용액&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>F8775</td><td>주의: 부식성&nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 도립 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

엔지니어링 정원 담금질 lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

다제내성 박테리아의 급속한 출현으로 생명을 위협하는 감염에 대응하기 위한 새로운 치료법의 필요성이 가속화되었습니다. 박테리아 감염의 지속성은 종종 정족수 감지 매개 생물막 형성과 관련이 있습니다. 따라서 이 신호 회로의 붕괴는 매력적인 독성 방지 전략을 제시합니다. Quorum-quenching lactonase는 Quorum-sensing 회로의 효과적인 교란자인 것으로 보고되었습니다. 그러나 박테리아 생물막 형성을 방해하는 데 이러한 효소를 효과적으로 사용한다는 보고는 거의 없습니다. 이 프로토콜은 엔지니어링된 정족수 소멸 락토나제를 사용하여 임상적으로 관련된 A. baumannii S1 균주에서 생물막 형성을 방해하는 방법을 설명합니다. 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 전 세계적으로 심각한 병원 감염과 관련된 주요 인간 병원체이며, 이 바이러스의 독성은 주로 생물막의 끈기에 기인합니다. 엔지니어링된 락토나제 처리는 상당한 A. baumannii S1 생물막 감소를 달성했습니다. 이 연구는 또한 생물막 매개 세균성 질병의 미래 치료에서 조작된 정족수 소멸 효소를 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 마지막으로, 이 방법은 유망한 정족수 담금질 효소의 능력을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

야생형 GKL 및 개선 GKL 이중 돌연변이 (E101G / R230C를) 크리스탈 바이올렛 정량 실험에서는 두 정수 담금질 효소 생물막 형성에 방해 가능성을 보여주기 위해 사용되었다. 두 효소 lactonase 대해 활성을 보여주기 위해 도시 한 3- 하이드 록시 데카 노일-L 호모 세린 락톤 (3-OH-10 C -HSL), A.에 의해 사용되는 주요 정수 분자 baumannii가 (S1) (14). 생물막 중단의 올바른 평가를 위해, (이전 AHL 리간드를 격리시키는하지 않음) 각각의 촉매 비활성 효소는 즉시 컨트롤 (GKL의 D266N 돌연변이와 GKL E101G / R230C / D266N 돌연변이)로 하였다. 야생형 A.를 사용 게다가 baumannii가 S1, 돌연변이 Δ abaI 변형 (AHL 합성 효소 결핍)의 생물막 형성 능력도 테스트...

정족수 소멸 효소는 항생제 내성 및 생물막 형성과 관련된 독성 인자 및 유전자의 발현을 방지함으로써 내성 발생 위험 없이 발병을 완화할 수 있는 항독성 및 항균 옵션입니다. 이 연구에서는 박테리아 생물막 파괴에서 정족수 소멸 효소의 효능을 입증하는 방법을 보고합니다.

엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

본 실험의 전반적인 목적은 세균 바이오필름 붕괴에 있어 쿼럼 퀜칭(quorum-quenching) 효소의 효능을 입증하는 것입니다. 이 방법은 항균 치료제 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 것이며, 바이오필름 환경 내의 병원성 세균에 대한 쿼럼 퀜칭 락토네이즈(lactonase)의 영향을 이해하는 데 기여할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 쿼럼 퀜칭 락토네이즈를 인비트로(in vitro) 환경에 직접 첨가할 수 있다는 점입니다.따라서 바이오필름 파괴에 미치는 영향을 쉽게 정량화할 수 있습니다. 이 절차를 시연할 사람은 우리 실험실의 테크니션인 Terrence Tay입니다. 우선, A.baumannii S1 5 mililiter 배양액을 LB 배지에서 30 degrees Celsius의 진탕 배양기로 16시간 동안 배양합니다.배양액의 OD 600을 0.8로 조정합니다. 그 다음, 4 mg/mL의 정제된 GKL 효소가 포함된 신선한 LB 배지를 사용하여 배양액을 1:100로 희석합니다. 그리고 96-well 플레이트의 각 well에 100 µL씩 분주합니다.뚜껑을 사용하여 플레이트를 덮고, 이를 10 liter 플라스틱 용기에 넣습니다. 용기를 밀봉하고 30 °C에서 3시간 동안 배양한 후, 배지를 조심스럽게 제거합니다. 웰에 신선한 LB 배지 100 µL를 추가하고, 플레이트를 30 °C에서 21시간 동안 배양합니다.배지를 조심스럽게 제거한 후, 200 µL의 멸균수를 사용하여 부유 세균 세포를 가볍게 세척합니다. 피펫 팁을 웰 바닥에 위치시키고 액체 배지를 조심스럽게 제거하여 기액 계면에 형성된 바이오필름에 가해지는 교란을 최소화합니다. 그런 다음 각 웰에 1% crystal violet 용액 100 µL를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양합니다.멸균수를 200 µL 사용하여 웰을 3회 세척함으로써 크리스탈 바이올렛 용액을 제거합니다. 각 웰에 33% 아세트산을 100 µL씩 첨가하고, 염료를 용해시키기 위해 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. 600 nm에서 크리스탈 바이올렛의 흡광도를 측정하여 바이오필름의 양을 정량화합니다.크리스탈 바이올렛의 양은 형성된 바이오필름의 양에 비례합니다. A.baumannii S1 바이오필름의 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 분석을 수행하려면, LB 배지에서 A.baumannii S1 5 mL 배양액을 30 °C 진탕 배양기에서 16시간 동안 배양하

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Tay, S. B. 외 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 병원성 박테리아에서 바이오필름 생체량을 정량화하는 방법을 시연하며, 처리되지 않은 대조군과 쿼럼 소환 효소로 처리된 샘플을 비교합니다. 이 효소는 초기 배양 과정에서 박테리아의 신호를 방해하여 세포 부착을 감소시킵니다. 세척 후 추가 배양 후 대조 우물은 밀도가 높은 바이오필름을 형성하는 반면, 처리된 우물은 형성이 감소합니다. 양이온염료를 사용해 바이오필름을 염색하고, 흡수도를 측정하여 생체량을 평가합니다.

병원성 박테리아에서 효소 유도 바이오필름 억제의 정량화

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효소 매개 바이오필름 형성 억제의 현미경 평가

본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

생물막 감염은 화학요법에 대한 내성이 높습니다. 단일 분석법으로 생물막의 복잡성을 파악할 수 없습니다. 대신, 보완적인 분석이 필요합니다. 우리는 생존력, 바이오매스 및 생물막 매트릭스에 대한 분석을 결합한 스크리닝 플랫폼(S. aureus를 위해 개발됨)을 제시합니다. 이를 통해 장기적인 화학 요법 효과 평가를 포함한 항생물막 약물 발견을 할 수 있습니다.

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

녹농균 생물막 구조에 대한 항균 유도 변화는 낭포성 섬유증 및 만성 폐 감염 환자로부터 배양한 임상 분리물 간에 다릅니다. 컨포칼 현미경 검사 후 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 항감염제의 효능을 평가하기 위해 개별 분리체에 대한 생물막 구조(예: 표면적, 두께, 바이오매스)의 변화를 정량화할 수 있습니다.

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

이 프로토콜은 고처리량 96웰 고정 뚜껑 정적 생물막 스크리닝을 위해 자체 조립된 딥 웰 PCR 플레이트 장치를 사용하여 생물막 성장 및 바이오매스 측정을 수행하는 방법론을 제시합니다.

PCR-플레이트 딥웰 마이크로플레이트 장치를 이용한 더 큰 박테리아 바이오필름 바이오매스의 생성

이 프로토콜은 낙농 산업에서 생물막을 박멸하기 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하기 위해 정적 및 동적 방법을 결합한 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 또한 생물막을 제어하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형의 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다.

정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가

티오펜설폰아미드 화합물은 Vibrio quorum sensing regulator LuxR/HapR의 강력하고 특이적인 억제제로서 생체 내 활성을 차단하여 독성, 운동성 및 생물막에 대한 유전자의 전사를 방지합니다. 이 프로토콜은 이러한 화합물을 합성하고, 실리코로 모델링하고, LuxR/HapR에 대한 활성을 위해 생체 내에서 분석하는 방법을 자세히 설명합니다.

Vibrio Quorum Sensing Inhibitors의 합성 및 분석

이 프로토콜의 목적은 생리 활성 화합물에 의한 쿼럼 감지 억제를 평가하기 위한 프록시로서 Chromobacterium violaceum ATCC 12472에 의한 비올라세인 생산을 정량화하는 것입니다.

Chromobacterium violaceum에서 Violacein의 정량화 및 생리 활성 화합물에 의한 억제

이 프로토콜은 박테리아 활성 모델링과 조합적 상호작용 분석법을 사용하여 식물화학물질이 전통적 살균제의 살균 효과를 어떻게 증진할 수 있는지 체계적으로 평가하는 틀을 제공하며, 이는 미생물 방제를 개선하고 전체 살균제 사용을 줄이는 시너지 혼합물을 식별하는 것을 목표로 합니다.

시험관 내 식물유래 분자가 기존 살생물에 미치는 증강 효과 평가

배우세요 병원성 박테리아의 바이오필름을 쿼럼 퀜칭 락토나아제로 분해하는 방법을 A.baumannii S1을 사용하여 연구합니다. 이 기술은 항균 치료 전략 개발에 활용됩니다.

엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단

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