엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단

이 실험의 전반적인 목표는 박테리아 생물막 파괴에서 정족수 소멸 효소의 효능을 입증하는 것입니다. 이 방법은 항균 치료제 분야의 주요 질문에 답하고 생물막 환경 내에서 병원성 박테리아에 대한 정족수 소멸 락토나제의 영향을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 정족수 소멸 락토나제를 in vitro 환경에서 직접 추가할 수 있다는 것입니다.

따라서, 생물막 파괴에 대한 영향은 쉽게 정량화됩니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 기술자인 Terrence Tay입니다. 먼저 진탕 인큐베이터에서 섭씨 30도의 LB에서 16시간 동안 A.baumannii S1의 5mililit 배양액을 배양합니다.

배양권을 OD 600 0.8로 조정합니다. 그런 다음 정제 된 GKL 효소의 밀리리터 당 4 밀리그램을 함유 한 신선한 LB를 사용하여 배양액을 100으로 희석합니다. 그리고 100웰 플레이트의 웰에 96마이크로리터를 추가합니다.

뚜껑을 사용하여 접시를 덮고 10리터 플라스틱 용기에 넣습니다. 용기를 밀봉하고 섭씨 30도에서 3시간 동안 배양한 후 배지를 부드럽게 제거합니다. 웰에 100마이크로리터의 새로운 LB 배지를 더 추가하고 플레이트를 섭씨 30도에서 21시간 동안 배양합니다.

매체를 부드럽게 제거한 후 200마이크로리터의 멸균수를 사용하여 플랑크톤 박테리아 세포를 부드럽게 씻습니다. 피펫 팁을 웰 바닥에 놓고 액체 매체를 조심스럽게 제거하여 공기와 액체 계면 사이에 이물질이 있는 생물막의 섭동을 최소화합니다. 그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 1% 크리스탈 바이올렛 용액을 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

200마이크로리터의 멸균수를 사용하여 우물을 세 번 세척하여 크리스탈 바이올렛 용액을 제거합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 33% 아세트산을 넣고 염료를 녹이기 위해 15분 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 600나노미터에서 크리스탈 바이올렛의 흡광도를 측정하여 생물막의 양을 정량화합니다.

크리스탈 바이올렛의 양은 형성된 생물막의 양에 비례합니다. A.baumannii S1 생물막의 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 수행하려면 진탕 인큐베이터에서 섭씨 30도의 LB에서 16시간 동안 A.baumannii S1의 5밀리리터 배양물을 배양합니다. A.baumannii S1의 배양을 OD 600 0.8로 조정합니다.

그런 다음 정제 된 GKL 효소의 밀리 리터 당 1.2 밀리 그램을 함유 한 신선한 LB를 사용하여 배양액을 1에서 100으로 희석하고 35 밀리리터 유리 바닥 마이크로 디쉬에 1 밀리리터를 첨가합니다. 마이크로디쉬를 뚜껑으로 덮고 10리터 플라스틱 용기에 넣고 밀봉한 후 섭씨 30도에서 3시간 동안 배양합니다. 배지를 부드럽게 제거한 후 30 마이크로 리터의 정제 된 GKL 효소를 함유 한 신선한 배지 1 밀리리터를 첨가 한 다음 섭씨 30도에서 21 시간 동안 더 배양합니다.

배지를 두 번째로 부드럽게 제거하고 새 배지에서 다른 1 밀리리터의 GKL 효소로 교체하십시오. 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지를 부드럽게 제거하고 HBSS에 용해된 Alexa Fluor 488 공액 밀 배아 응집소 500 미크론을 밀리리터당 5 마이크로 리터로 첨가합니다.

마이크로디쉬를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 생물막을 염색합니다. 생물막을 고정하려면 HBSS에 용해된 3.7% 포름알데히드 500마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. HBSS 2밀리리터를 사용하여 마이크로디쉬를 한 번 씻은 다음 용액을 완전히 제거합니다.

CLSM 이미징 전에 섭씨 4도의 어두운 곳에 접시를 보관하십시오. CLSM 이미징 및 분석의 경우 63X 대물렌즈를 사용하여 스택당 0.21미크론 간격으로 이미지당 97개의 스택을 생성합니다. 결정 바이올렛 정량 실험에서, Wild-type GKL과 개선된 GKL 이중 돌연변이 quorum-quenching 효소는 3개의 hydroxydecanoyl l homoserine lactone 또는 3OHC10HSL, A.baumanii가 사용하는 주요 정족수 분자에 대한 락토나제 활성을 위해 사용되었으며, S1.As 두 효소 모두 전처리된 Wild-type A.baumanii S1에서 생물막 형성을 크게 감소시킬 수 있었습니다. 두 효소에 의한 생물막 파괴의 정도는 3OHC10HSL에 대한 효능에 비례하지 않습니다.

이 표에서 볼 수 있듯이 돌연변이 GKL의 회전율은 3OHC10HSL에 대해 야생형 GKL보다 6배 빠릅니다. 그러나 효소 간의 생물막 파괴 정도의 차이는 두 가지에 불과합니다. 이 실험에서는 개선된 GKL 돌연변이 효소와 catecholy 비활성 효소를 비교에 사용했습니다.

이 DIC 이미지는 개선된 GKL 돌연변이 효소로 처리한 결과 비활성 효소에 비해 생물막 크기가 감소했음을 보여줍니다. 형광 이미지를 분석한 결과, 개선된 GKL 돌연변이 효소로 처리했을 때 표면적, 바이오매스 및 바이오필름의 평균 두께가 감소한 것으로 나타났습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 잠복기를 제외하고 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세척 단계에서 생물막의 제거 및 중단을 최소화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 계수 및 효소 안정성 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이것은 생물막 내의 세포 집단에 대한 정족수 소멸 락토나제의 영향 및 작용 기간과 같은 추가 질문에 답할 것입니다.

개발 후 이 기술은 감염병 치료 분야의 연구자들이 병원성 박테리아가 생산하는 생물막에서 잠재적인 정족수 소멸 락토나제의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 크리스털 바이올렛 염색에 의한 생물막 파괴를 정량화하는 방법과 컨포칼 이미징을 통해 생물막의 형태학적 변화를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 적절한 생물학적 위험 억제 시설을 사용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.