β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

이 방법의 전반적인 목표는 결정화되고 분열될 외막 베타 배럴 단백질의 밀리그램 수량을 얻는 것입니다. 이 방법은 베타 배럴 단백질이 세포막에 삽입되는 방법과 같은 막 단백질 접힘 및 수송 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 베타 배럴 단백질에 대해 견고하다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 정제, 결정화 및 분열을 위한 세제를 선택하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. Susan Buchanan 실험실의 박사후 연구원인 Jeremy Guerin이 저와 실험실의 동료들과 함께 절차를 시연할 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 멤브레인에 대한 생체 내 발현을 위해 codon에 최적화된 표적 외막 단백질 또는 OMP 유전자를 포함하는 T7 발현 벡터를 구성하는 것으로 이 절차를 시작합니다.

1마이크로리터의 플라스미드를 50마이크로리터의 BL21(DE3) 화학적 수용 세포에 피펫팅하여 구성물을 발현을 위한 박테리아의 발현 균주로 변환하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 수조를 사용하여 섭씨 42도에서 30초 동안 가열 펄스를 가한 다음 다시 얼음 위에 1분 동안 놓습니다.

예열된 SOC 배지 1ml를 넣고 벤치탑 셰이커 인큐베이터를 사용하여 섭씨 37도에서 1000RPM으로 1시간 동안 흔듭니다. 배양 후 적절한 항생제가 함유된 LB 한천 플레이트에 100마이크로리터의 세포를 플레이트하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 뒤집어 배양합니다. 다음으로, 항생제 배양액이 포함된 LB 5ml를 단일 콜로니에 접종하여 소규모 발현 검사를 수행합니다.

5-10개의 콜로니에 대해 반복합니다. 섭씨 37도에서 약 영점 6의 600나노미터에서 광학 밀도로 흔들면서 성장합니다. 각 배양 튜브에 5마이크로리터의 1몰 IPTG를 첨가하여 타겟 OMP의 발현을 유도하고 추가로 1-2시간을 성장시킵니다.

모든 colonies를 위한 표정 수준을 비교하기 위하여는, 마이크로 분리기를 사용하여 15, 000 시간 G에 1 분 동안 각 배양물의 1 밀리리터를, 원심분리하십시오. 상층액을 제거하고 200마이크로리터의 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼에 세포를 재현탁합니다. 5 분 동안 100 섭씨 온도에 가열하고, 그 후에 15, 5 분 동안 000 시간 G에 다시 원심분리기를 하십시오.

SDS-PAGE를 사용하여 10% 겔의 각 웰에 20마이크로리터를 피펫팅하여 샘플을 분석합니다. 일정한 200볼트에서 35분 동안 젤을 실행합니다. 마지막으로, 10분 동안 6000배 G에서 원심분리하여 세포를 수확합니다.

용해 완충액에 세포를 세포 페이스트 1g당 5ml의 비율로 재현탁합니다. 프렌치 프레스 또는 세포 균질기를 사용하여 세포를 용해합니다. 그런 다음, 용해된 세포를 15, 000배 G로 섭씨 4도에서 30분 동안 회전시켜 용해되지 않은 세포와 세포 파편을 제거합니다.

상층액을 깨끗한 튜브에 옮기고 섭씨 4도에서 1시간 동안 고속으로 다시 원심분리합니다. 생성된 펠릿은 관심 단백질을 포함하는 막 분획입니다. Dounce 균질기를 사용하여 멤브레인 분획을 재현탁합니다.

먼저 멤브레인을 옮긴 다음 세제 없이 2X 농도의 가용화 완충액을 추가합니다. 재현탁된 멤브레인을 눈금이 매겨진 실린더에 붓고 1X 가용화 완충액의 최종 농도에 도달할 때까지 물을 추가합니다. 샘플을 비커로 옮기고 세제를 임계 미셀 농도의 약 10배의 최종 농도로 천천히 첨가합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 0.5-16시간 동안 저어주는데, 이는 표적 단백질이 막에서 얼마나 쉽게 추출되는지에 따라 다릅니다. 마지막으로, 300, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 solubilized 표본을 원심 분리하십시오. 1-5밀리리터 IMAC 컬럼을 준비하거나 사전 포장된 컬럼을 사용합니다.

후속 크로마토그래피 단계를 섭씨 4도에서 수행합니다. 방부제의 흔적을 제거하기 위해 물로 씻어내십시오. 자동 정제 시스템을 사용하는 경우 제조업체의 지침에 따라 컬럼을 설치하십시오.

이미디졸이 없는 IMAC 완충액 A 500밀리리터와 이미디졸 1몰로 IMAC 완충액 B 250밀리리터를 준비합니다. 10 컬럼 부피의 IMAC 완충액 A를 사용하여 IMAC 컬럼을 평형화합니다.단백질 샘플에 이미디졸을 최종 농도 25밀리몰까지 추가하고 혼합합니다. 그런 다음 평형을 이룬 IMAC 컬럼에 시료를 분당 2밀리리터로 로드합니다.

플로우 스루를 수집합니다. 다음으로, 완충액 B.Collect 2 밀리리터 분획을 사용하여 각각 증가하는 이미디졸 농도의 5 컬럼 부피로 IMAC 컬럼을 세척합니다. 5 컬럼 부피에 대해 250 millimolar의 최종 농도로 샘플을 용리하고 용리된 샘플을 2 ml 분획으로 수집합니다.

280나노미터에서의 흡광도를 기반으로 SDS-PAGE 분석을 사용하여 flow-through, 세척 분획 및 용리 분획을 분석합니다. SDS-PAGE 분석으로 확인된 바와 같이 타겟 beta-barrel OMP를 포함하는 분획을 풀링합니다. 그런 다음 풀링된 샘플에 TEV 프로테아제를 첨가하고 섭씨 4도에서 부드러운 흔들림으로 밤새 배양하여 6X 히스타딘 태그를 제거합니다.

샘플 프로테아제 용액을 IMAC 컬럼에 다시 로드하여 절단된 태그 및 절단되지 않은 샘플에서 타겟 베타 배럴 OMP를 분리합니다. 플로우 스루(flow-through)에는 태그가 없는 절단된 샘플이 포함됩니다. 결정화를 준비하려면 샘플을 겔 여과 컬럼에 로드하여 결정화에 사용할 세제가 들어 있는 버퍼에 넣습니다.

1밀리리터 분획을 수집하고 280나노미터에서의 흡광도를 기반으로 SDS-PAGE 분석을 사용하여 분석합니다. 표적 단백질을 함유하고 있는 분획을 모은 다음 밀리리터당 약 10mg으로 농축합니다. 샘플을 준비하기 전에 겔 장치를 조립하십시오.

미리 냉각된 젤 러닝 버퍼를 사용하거나 차가운 방에서 젤을 실행하십시오. 0.22미크론 원심 필터를 사용하여 샘플을 필터링하여 미립자와 침전물을 제거합니다. 그런 다음 시료 0.25마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브 2개에 피펫팅합니다.

하나는 boiled"로, 다른 하나는 RT"로 표시합니다.그런 다음 각 튜브에 9.75 마이크로 리터의 샘플 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 두 샘플 모두에 10마이크로리터의 2X SDS 로딩 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 끓인 "샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 끓이고 RT" 샘플은 실온에 둡니다.

그런 다음 삶은 "샘플을 짧게 돌립니다. 다음으로, 두 샘플의 20마이크로리터를 사전 조립된 기본 겔에 로드합니다. 150볼트의 일정한 온도에서 60분 동안 젤을 작동시킨 후 젤을 제거하고 염색 용액에 담그면 결과를 시각화할 수 있습니다.

이전에 발표된 Jove 방법을 사용하여 세제, 이중 세포 및 지질 입방상에서 결정화 시험을 진행합니다. 결정화 헤드는 UV 현미경으로 시각화하여 결정이 실제로 단백질이고 용해되지 않은 지질 또는 세제인지 확인합니다. 납 결정은 가정용 소스를 사용하거나 싱크로트론에서 스크리닝하여 결정이 분리되는지 확인합니다.

잘 굴절되는 결정의 데이터를 수집한 후 HKL2000와 같은 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다. 구조 결정을 위해 결과 파일을 Phoenix Suit와 같은 소프트웨어 제품군으로 전송하고 초기 위상 조정 및 구조 결정을 위한 분자 교체를 수행합니다. YIUR의 결정 구조는 이 방법을 사용하여 2.6 옹스트롬 분해능으로 측정되었습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2주 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 구조 연구를 위해 박테리아 외막 단백질을 발현하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.