β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

이 방법의 전반적인 목적은 결정화 및 회절이 가능한 밀리그램 단위의 외막 베타-배럴 단백질을 얻는 것입니다. 이 방법은 베타-배럴 단백질이 세포막에 어떻게 삽입되는지와 같이 막 단백질 접힘 및 수송 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 베타-배럴 단백질에 대해 매우 안정적이라는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 정제, 결정화 및 탈분획(defraction)을 위한 계면활성제 선택이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. Susan Buchanan 실험실의 박사후 연구원인 Jeremy Guerin이 저와 실험실 동료들과 함께 절차를 시연할 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 막으로의 in vivo 발현을 위해 코돈이 최적화된 표적 외막 단백질(outer membrane protein, OMP) 유전자를 포함하는 T7 발현 벡터를 구축하는 것으로 본 절차를 시작하십시오.

1 µL의 플라스미드를 50 µL의 BL21(DE3) 화학적 컴피턴트 세포(chemically competent cells)에 피펫팅하여 발현용 박테리아 균주로 형질전환시키고, 피펫으로 위아래로 섞어 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 항온수조(water bath)를 사용하여 42 °C에서 30초 동안 열 충격(heat pulse)을 가한 다음, 다시 얼음 위에 1분 동안 둡니다.

미리 데워둔 SOC 배지 1 mL를 추가하고, 벤치탑 셰이커 인큐베이터를 사용하여 37 °C에서 1000 RPM으로 1시간 동안 흔들어 줍니다. 배양 후, 적절한 항생제가 포함된 LB Agar 플레이트에 세포 100 µL를 도말하고, 뒤집은 상태로 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 단일 콜로니를 항생제가 포함된 LB 배양액 5 mL에 접종하여 소규모 발현 테스트를 수행합니다.

5~10개의 콜로니에 대해 동일한 과정을 반복합니다. 600 nm에서의 광학 밀도가 약 0.6이 될 때까지 37 °C에서 진탕 배양합니다. 각 배양 튜브에 1 M IPTG 5 µL를 첨가하여 표적 OMP의 발현을 유도하고, 1~2시간 더 배양합니다.

모든 콜로니의 발현 수준을 비교하기 위해, 마이크로원심분리기를 사용하여 각 배양액 1 mL를 15,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 200 µL의 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼에 다시 현탁합니다. 100 °C에서 5분 동안 가열한 후, 15,000 ×g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.

10% 젤의 각 웰에 20 µL씩 분주하여 SDS-PAGE로 샘플을 분석합니다. 200 V의 정전압에서 35분 동안 젤을 전기영동합니다. 마지막으로, 6000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다.

세포 페이스트 1g당 5mL의 비율로 용해 버퍼에 세포를 재현탁합니다. French press 또는 세포 균질기를 사용하여 세포를 용해합니다. 그 다음, 용해된 세포를 4°C에서 15,000 ×g로 30분 동안 원심분리하여 용해되지 않은 세포와 세포 파편을 제거합니다.

상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 4°C에서 1시간 동안 다시 고속 원심분리합니다. 이렇게 얻은 펠렛은 목적 단백질을 포함하는 막 분획입니다. Dounce 호모게나이저를 사용하여 막 분획을 재현탁합니다.

먼저, 막을 옮긴 후 세제(detergent)가 포함되지 않은 2배 농도의 가용화 완충액(solubilization buffer)을 첨가합니다. 재현탁된 막을 메스실린더에 붓고, 최종 농도가 1배 가용화 완충액이 될 때까지 증류수를 추가합니다. 샘플을 비커로 옮기고, 최종 농도가 임계 미셀 농도(critical micelle concentration)의 약 10배가 되도록 세제를 천천히 첨가합니다.

그런 다음, 표적 단백질이 막에서 얼마나 쉽게 추출되는지에 따라 4°C에서 0.5~16시간 동안 교반합니다. 마지막으로, 가용화된 시료를 4°C에서 300,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 1~5 mL IMAC 컬럼을 준비하거나 미리 충전된 컬럼을 사용하십시오.

이후의 크로마토그래피 단계는 4°C에서 수행하십시오. 보존제의 흔적을 제거하기 위해 물로 세척하십시오. 자동 정제 시스템을 사용하는 경우, 제조업체의 지침에 따라 컬럼을 설치하십시오.

이미다졸이 포함되지 않은 IMAC 완충액 A 500 mL와 1 M 이미다졸이 포함된 IMAC 완충액 B 250 mL를 준비합니다. IMAC 컬럼 부피의 10배에 해당하는 IMAC 완충액 A를 사용하여 IMAC 컬럼을 평형화합니다. 단백질 시료에 이미다졸을 최종 농도 25 mM이 되도록 첨가하고 혼합합니다. 그런 다음, 평형화된 IMAC 컬럼에 시료를 분당 2 mL의 속도로 로딩합니다.

통과액을 수집합니다. 다음으로, buffer B를 사용하여 이미다졸의 농도를 점진적으로 높여가며 IMAC 컬럼을 각각 5컬럼 부피(column volume)만큼 세척합니다. 세척액은 2mL 분획으로 수집합니다. 최종 농도가 250mM인 용액으로 5컬럼 부피만큼 샘플을 용출시키고, 용출된 샘플을 2mL 분획으로 수집합니다.

280nm에서의 흡광도를 기준으로 SDS-PAGE 분석을 통해 flow-through, 세척 분획 및 용출 분획을 분석합니다. SDS-PAGE 분석으로 확인된 표적 beta-barrel OMP가 포함된 분획들을 모읍니다. 그런 다음, 모은 시료에 TEV protease를 첨가하고 4°C에서 완만한 rocking 상태로 하룻밤 동안 배양하여 6X histadine 태그를 제거합니다.

표적 beta-barrel OMP를 절단된 태그 및 절단되지 않은 샘플로부터 분리하기 위해 샘플 프로테아제 용액을 IMAC 컬럼에 다시 로딩합니다. 통과액(flow-through)에는 태그가 없는 절단된 샘플이 포함되어 있습니다. 결정화를 준비하기 위해, 결정화에 사용될 계면활성제가 포함된 버퍼가 들어있는 젤 여과 컬럼에 샘플을 로딩합니다.

1mL씩 분획을 수집하고, 280nm에서의 흡광도를 기준으로 SDS-PAGE 분석을 통해 분석합니다. 표적 단백질이 포함된 분획들을 모은 후, 약 10mg/mL로 농축합니다. 시료를 준비하기 전에 겔 장치를 조립하십시오.

미리 냉각시킨 겔 전개 완충액을 사용하거나 저온실에서 겔을 전개하십시오. 0.22 micron 원심분리 필터를 사용하여 샘플을 여과함으로써 입자와 침전물을 제거하십시오. 그 다음, 샘플 0.25 microliters를 두 개의 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 분주하십시오.

하나에는 "boiled", 다른 하나에는 "RT"라고 표시합니다. 다음으로, 각 튜브에 9.75 µL의 샘플 버퍼를 넣고 피펫팅하여 혼합합니다. 두 샘플 모두에 10 µL의 2X SDS 로딩 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. "boiled" 샘플은 95 °C에서 5분 동안 가열하고, "RT" 샘플은 실온에 둡니다.

그런 다음, 가열한 시료를 짧게 원심 분리합니다. 이어서, 미리 준비된 네이티브 겔에 두 시료를 각각 20 µL씩 로딩합니다. 150 V의 정전압으로 60분 동안 겔 전기영동을 수행한 후, 겔을 꺼내 염색액에 담가 결과를 시각화합니다.

이전에 발표된 JoVE 방법을 사용하여 세제, bi-cells 및 지질 입방상(lipidic cubic phase)에서 결정화 시험을 진행합니다. 결정이 실제로 단백질이며 염, 지질 또는 세제가 아님을 확인하기 위해 UV 현미경으로 결정 헤드를 관찰합니다. 결정의 회절 여부를 확인하기 위해 자체 광원 또는 싱크로트론을 사용하여 주요 결정을 스크리닝합니다.

회절이 잘 되는 결정의 데이터 수집 후, HKL2000과 같은 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다. 결과 파일을 Phoenix Suit와 같은 구조 결정 소프트웨어 제품군으로 전송하고, 초기 위상 결정 및 구조 결정을 위해 분자 교체법을 수행합니다. YIUR의 결정 구조는 이 방법을 통해 2.6 Angstrom 해상도로 결정되었습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 2주 안에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 구조 연구를 위해 박테리아 외막 단백질을 발현하고 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.