Name: β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 배우세요 β-배럴 외부 막 단백질의 대량 생산 및 결정화 방법을. T7 발현 벡터 구축부터 IMAC 정제, 결정화까지 단계별 프로토콜을 통해 막 단백질 구조 생물학 연구의 핵심 기술을 익힐 수 있습니다.

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UV 이미지를 제공해 주신 CNRS의 Herve Celia와 SONICC 이미지를 제공해 주신 Purdue University 화학과의 Chris Dettmar와 Garth Simpson에게 감사드립니다. 미국 국립당뇨병·소화기·신장 질환 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)와 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 자금 지원에 감사드립니다. 또한, 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, A.M.S. 및 C.J.), 국립 알레르기 및 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, N.N. 1K22AI113078-01) 및 퍼듀 대학교 생명과학과(Department of Biological Sciences at Purdue University, N.N.)의 추가 자금 지원에 감사드립니다.

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
<li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnard%2C+TJ+%22Curr+Prot+in+Prot+Science%22">Curr Prot in Prot Science</a>. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383(2012).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000(2012).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes%3A+structure%2C+function+and+refolding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li>
<li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+folding+proteins+into+membranes%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+of+Biochem+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li>
<li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li>
<li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li>
<li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

β-배럴 OMPs는 세균, 미토콘드리아와 엽록체 그람 음성에 필수적인 역할을 제공하고 이러한 각각의 세포 기관의 외부 막에 필수적인 분자 메커니즘에 대한 풍부한 정보를 제공하는 구조 분석을위한 중요한 표적이다. 그러나, 구조 분석을 위해 충분한 샘플을 제조 항상 간단하지 않으며, 따라서, 일반적인 파이프 상세히의 결정 구조의 처리를 설명하는 구조 결정을위한 타겟 β 배럴 OMPs 충분한 양의 생산을 위해 제공된다. 이러한 프로토콜 테스트 및 그람 음성 박테리아에서 가장 OMPs 작동하는 것으로 확인되었지만, 그 한계는 표현과 정제를위한 다른 방법이 필요할 수 있습니다 특히 미토콘드리아와 엽록체에 대한 몇 가지 목표는, 거기에있다. 따라서, 여기에 방법은 대부분의 그람 음성 박테리아에서 OMPs을 포함 프로젝트, 아직 발현 수준에 적용해야정제 된 시료의 양 및 대상 OMP에 따라 달라질 것이다. 구조 연구를위한 β-배럴 OMPs의 발현에 대한 두 가지 일반적인 방법이있다 (1)...

β-배럴 OMPs은 미토콘드리아, 엽록체의 외부 세포막에서 발견, 및 그람 음성 박테리아 1-3 될 수있다. 그들은 α 나선 단백질와 유사한 역할을 제공하지만, 이들은 각 가닥은 속속들이 이웃하는 두 가닥에 연결되면서 8-26 역 평행 β 가닥 범위의 중앙 막 매립 β 배럴 도메인으로 구성된 매우 다른 스크롤을 (도 1 및도 2). β 배럴 영역의 처음과 마지막 스트랜드는 닫고 주위 막에서 β 배럴 영역을 밀봉한다 (미토콘드리아 VDAC 제외)를 역 평행 형태로 거의 독점적으로 서로 상호 작용한다. 모든 β 배럴 OMPs 이러한 루프 때때로 Neisserial의 트랜스페린 검색된 프로 바인딩 75 잔기로 대형 인 상태 리간드의 상호 작용 및 / 또는 단백질 - 단백질 연락처에 중요한 역할을하는 다양한 서열 및 길이의 세포 외 루프가TEIN A (TbpA) 4. β-배럴 OMPs 또한 단백질의 기능적인 목적으로 도메인을 추가로 제공 N- 말단 또는 C- 말단 주변 세포질 확장 할 수 있습니다 (예를 들어, 아저씨 5-7, FadL (10) 8,9, FimD). β-배럴 OMPs 많은 종류의 11 존재하지만,보다 일반적인 유형의 두 분야 (1) TonB 종속 운송 (2) autotransporters 덜 익숙한 사람들을 위해 예로서 아래에 설명되어 있습니다. TonB 종속 전송기 (예를 들면, FEPA, TbpA, BtuB, CIR, 등) 영양 오기 필수적이며, A는 C 말단 β- 22 가닥 안에 꿰매 발견 ~ 150 개의 잔기로 구성된 N - 말단 플러그 도메인을 포함 배럴 도메인 외막 (12) (도 3)에 매립. 이 플러그 도메인 자유롭게 배럴 영역을 통과 기질을 방지하는 동안, 기판은 결합 플러그 내의 도메인 번째 형태 변화를 유도리드에서 (플러그 재 배열하거나 플러그의 부분 / 전체 배출에 의해 하나)를 페리 플라 즘으로 외부 막에 걸쳐 기판 운반을 용이하게 할 수있다 형성 기공합니다. TonB 종속 전송기는 이러한 인간 숙주 단백질 4,13,14에서 직접 철 같은 영양소를 납치 전문 운송을 진화 나이 세리아 뇌수막염으로 그람 음성 박테리아의 일부 병원성 균주의 생존에 특히 중요하다. Autotransporters는에서 분비 또는 제시 중 하나 β-배럴 도메인 (ESTA와 ESPP와 같이 일반적으로 12 가닥)으로 구성 β-배럴 OMPs와 승객 도메인을 그람 음성 세균의 type V 분비 시스템에 속하고 있습니다 셀 (15, 16) (그림 3)의 표면. 이 β-배럴 OMPs는 종종 역할을하는 승객 도메인과 세포 생존 및 독성에 중요한 역할을 역할 중 하나 프로테아제, 어드, 및 / 또는 기타 EF 등fector 그 발병 기전을 매개. 이러한 X 선 결정학, NMR 분광법, 및 전자 현미경 (EM) 우리 차례가 외막에서 작동 정확히 해독하는데 사용할 수있는 원 해상도의 OMPs위한 모델을 결정하도록 허용하는 구성 방법. 이것은 귀중한 정보는 해당되는 경우 약물 및 백신 개발을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 트랜스페린 결합 단백질 A (TbpA)은 나이 세리아의 표면 상에 발견하고 직접 인간 트랜스페린 결합하고 추출 자체 생존 철 수입 때문에 발병 요구된다. TbpA없이, 나이 세리아 인간 호스트로부터 철을 청소할 수 없으며 비병원성 렌더링된다. TbpA 4에 결합 인간 트랜스페린의 결정 구조를 해결 한 후, 두 단백질이 관련된 얼마나 명확하게되었다 TbpA 어떤 영역의 상호 작용을 매개, TbpA 의해 철 추출 중요한 있었는지 잔기 및어떻게 하나 TbpA을 대상으로 나이 세리아에 대한 치료제를 개발하고 있습니다. 따라서, 생존 병인 그람 음성균에 β 배럴 OMPs의 중요성을 고려할뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 기능 및 추가 구조 막 단백질의 독특한 클래스에 대한 정보가 작동하는 시스템에 대한 필요 일반적으로 프로토콜은 표현 및 구조 방법에 의해 특성화에 대한 높은 수준의 목표 OMPs 정화의 전반적인 목표되게됩니다.

<table><tbody>LCP 결정화 <tr><td>PCR 열순환기</td><td>Eppendorf, BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick, Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>분광계</td><td>Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr> 장치 BioRad 1645050, 1658005를 <tr>제외한 <td>결정화 로봇</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Any</td><td></td><td>가 여기에서 작동해야 합니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 및 네이티브 겔</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE</td><td></td> Healthcare-Microcentrifuge <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf-Centrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(low-medium speed)</td><td>Beckman-Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(high 속도)</td> <td>Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>로터</td><td>Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti 로터</td><td>Beckman-Coulter-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti 로터</td><td>Beckman-Coulter-Dounce</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>균질화</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP 도구</td><td>Hamilton, TTP Labtech-VDX</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>24웰 플레이트</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>샌드위치 플레이트</td><td>Hampton Research, 분자 치수</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace 결정화 시트</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sepharose 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>결정화 스크린</td><td>Hampton Research, Qiagen, Molecular</td> <td>Dimensions-Gas-tight</td><td></td></tr> <tr><td>syringe (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

막 단백질은 세포에서 영양소 수송, 운동성, 신호전달, 생존 및 독성과 같은 중요한 기능을 수행하지만 알려진 구조의 ~1%에 불과합니다. 막 단백질에는 α나선과 β-배럴의 두 가지 유형이 있습니다. α나선 막 단백질은 거의 모든 세포막에서 찾을 수 있지만 β배럴 막 단백질은 미토콘드리아, 엽록체 및 그람 음성 박테리아의 외막에서만 찾을 수 있습니다. 일반적으로 막 단백질의 구조 연구에서 일반적인 병목 현상 중 하나는 분석을 위해 충분한 순수 샘플을 얻는 것입니다. 선호하는 β-배럴 외막 단백질(OMP)의 구조를 해결하는 데 관심이 있는 사람들을 돕기 위해 X선 결정학 및/또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정에 유용한 수준에서 표적 β-배럴 OMP를 생산하기 위한 일반 프로토콜이 제시됩니다. 여기에서는 네이티브 발현과 봉입체로의 발현, 친화성 태그를 사용한 정제, 세제 스크리닝, 비셀 및 지질 입방상 기술을 사용한 결정화를 위한 구성 설계를 간략하게 설명합니다. 이러한 프로토콜은 테스트를 거쳐 그람 음성 박테리아의 대부분의 OMP에 효과가 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 특히 미토콘드리아와 엽록체에 대한 일부 표적은 발현 및 정제를 위해 다른 방법이 필요할 수 있습니다. 따라서 여기의 방법은 그람 음성 박테리아의 OMP와 관련된 대부분의 프로젝트에 적용할 수 있어야 하지만 정제된 샘플의 발현 수준과 양은 대상 OMP에 따라 다릅니다.

YiuR는 예 르시 니아 페스티에 대해 추정 백신 대상인 TonB 종속 철 수송한다. 원래는 마이크로 어레이 분석을 사용하여 확인 하였다. 여기서, X 선 결정학을 이용 YiuR의 구조를 결정하기 위해 수행 된 단계 (도 9)를 설명한다. 클로닝, YiuR의 DNA 서열 (마이너스 N 말단 신호 서열) PCR은 게놈 DNA의 증폭 및 TEV 단백질 분해 효소 사이트 다음에 N 말단 pelB 신호 서열 및 10 배 - 히스티딘 친 화성 태그를 함유하는 벡터에 서브 클로닝. 표현의 경우, YiuR 포함하는 플라스미드 ~ 0.5 (600) 중독에 BL21 (DE3) 유능한 세포와 5 ml의 스타터 문화를 성장하는 데 사용되는 하나의 식민지로 변신했다. TB 배지 750 ml를 함유 십이 플라스크는 스타터 배양액 1mL를 접종하고 (220 rpm에서 진탕) 20 ºC에서 3 일 동안 성장시켰다....

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

이 방법의 전반적인 목적은 결정화 및 회절이 가능한 밀리그램 단위의 외막 베타-배럴 단백질을 얻는 것입니다. 이 방법은 베타-배럴 단백질이 세포막에 어떻게 삽입되는지와 같이 막 단백질 접힘 및 수송 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 베타-배럴 단백질에 대해 매우 안정적이라는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 정제, 결정화 및 탈분획(defraction)을 위한 계면활성제 선택이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. Susan Buchanan 실험실의 박사후 연구원인 Jeremy Guerin이 저와 실험실 동료들과 함께 절차를 시연할 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 막으로의 in vivo 발현을 위해 코돈이 최적화된 표적 외막 단백질(outer membrane protein, OMP) 유전자를 포함하는 T7 발현 벡터를 구축하는 것으로 본 절차를 시작하십시오.1 µL의 플라스미드를 50 µL의 BL21(DE3) 화학적 컴피턴트 세포(chemically competent cells)에 피펫팅하여 발현용 박테리아 균주로 형질전환시키고, 피펫으로 위아래로 섞어 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 항온수조(water bath)를 사용하여 42 °C에서 30초 동안 열 충격(heat pulse)을 가한 다음, 다시 얼음 위에 1분 동안 둡니다.미리 데워둔 SOC 배지 1 mL를 추가하고, 벤치탑 셰이커 인큐베이터를 사용하여 37 °C에서 1000 RPM으로 1시간 동안 흔들어 줍니다. 배양 후, 적절한 항생제가 포함된 LB Agar 플레이트에 세포 100 µL를 도말하고, 뒤집은 상태로 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 단일 콜로니를 항생제가 포함된 LB 배양액 5 mL에 접종하여 소규모 발현 테스트를 수행합니다.5~10개의 콜로니에 대해 동일한 과정을 반복합니다. 600 nm에서의 광학 밀도가 약 0.6이 될 때까지 37 °C에서 진탕 배양합니다. 각 배양 튜브에 1 M IPTG 5 µL를 첨가하여 표적 OMP의 발현을 유도하고, 1~2시간 더 배양합니다.모든 콜로니의 발현 수준을 비교하기 위해, 마이크로원심분리기를 사용하여 각 배양액 1 mL를 15,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 200 µL의 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼에 다시 현탁합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용 lipidic mesophases의 막 단백질의 높은 처리량 결정에 로봇 접근 방식을 설명합니다. 방법 통합 점성과 끈적 끈적한 단백질을이고 mesophase을 처리 할 수​​있는 로봇을 소개합니다.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용하기 위해 lipidic 입방와 스폰지 단계에서 재배 수확 및 cryo-시원한 막 단백질 결정에 대한 구조 및 기능 생물학 그룹 팀장 막에서 구현 절차를 설명합니다.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

우리는 큰 코일 영역의 특성화 및 결정화를 안내하기 위해 간단한 생화학 및 컴퓨터 분석을 통합한 프레임워크를 설명합니다. 이 프레임워크는 구형 단백질에 맞게 조정하거나 다양한 고처리량 기술을 통합하도록 확장할 수 있습니다.

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

이 방법은 엑스레이 결정학 및 소 각 x 선 산란 (SAXS), 복제, 표현, 및 구조 결심을 위한 재조합 Nsa1의 정화를 설명 하 고 다른 단백질의 하이브리드 구조 분석에 대 한 적용 둘 다를 포함 하는 주문 하 고 도메인을 난잡.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

배우세요 β-배럴 외부 막 단백질의 대량 생산 및 결정화 방법을. T7 발현 벡터 구축부터 IMAC 정제, 결정화까지 단계별 프로토콜을 통해 막 단백질 구조 생물학 연구의 핵심 기술을 익힐 수 있습니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

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