마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가

본 프로토콜의 전반적인 목표는 자가 조직화, 축 신장 및 현탁 배양이 이루어지는 균일한 마우스 배아 줄기 세포 응집체를 생성하는 것입니다. 이 방법은 가스트룰레이션(gastrulation)과 같은 과정에서의 조직 상호작용이 축 지정 및 자가 조직화에 미치는 역할과 같이, 발생 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 응집 전 단계에서 배아 외부의 새로운 해체적 관점으로 발생 사건들을 연구할 수 있다는 점입니다.

응집체 생성을 위해 젤라틴 코팅된 25 square centimeter 조직 배양 처리 플라스크의 ES.Lift 배지에서 생쥐 배아 세포 또는 M MECs를 유지합니다. 세포가 40~60% Confluence 상태인 조직 배양 플라스크에서 시작하여 배지를 흡입하고 플라스크를 두 번 헹굽니다. PBS로 헹군 후, 0.25% trypsin EDTA 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 약 5분 동안 배양하여 플라스크에서 세포를 분리합니다.

다음으로, 분리된 세포 현탁액에 Es.Lift 배지 5 mL를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 세포를 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 세포 수를 측정하기 위해 1 mL의 분주액을 취합니다. 5 × 10⁴개의 세포를 따뜻한 PBS 5 mL에 넣고 170 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

펠렛이 흐트러지지 않도록 용액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 PBS 5 mL를 조심스럽게 첨가하고 원심분리를 반복합니다. 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 가능한 최대 부피의 용액을 흡입하여 제거합니다.

PBS의 잔류를 방지하기 위해, 세포 펠렛을 1 mL의 따뜻한 N2B27 배지에 다시 현탁합니다. P1000 피펫으로 잘 섞어 균질한 세포 현탁액을 만듭니다.

그런 다음 N2 B27 배지 4 mL를 추가하여 희석합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 멸균 리저버로 옮깁니다. 세포를 충분히 혼합한 후, 리저버에서 세포 현탁액 40 µL를 취해 조직 배양 처리가 되지 않은 u-bottom 플레이트의 각 웰에 분주합니다.

96웰 플레이트. 세포가 플레이트에 부착되는 것을 최소화하기 위해 비조직 배양 플레이트를 특별히 사용합니다. 세포 응집이 일어날 수 있도록 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 48시간 동안 배양합니다.

플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 도립 현미경으로 세포를 관찰하고 응집체의 존재를 확인합니다. warm N two B 27에 10 millimolar CHI 9 9 0 2 1 스톡 솔루션을 첨가하여 최종 농도가 3 micromolar가 되도록 만듭니다. 이것은 세포 자극을 위한 2차 배지입니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 2차 배지 150 µL를 분주합니다. 부착된 응집체를 떼어낼 수 있도록 충분한 힘을 가합니다. 배양 후 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣어 24시간 동안 배양합니다.

세포 응집체가 흡입되지 않도록 주의하여 배지를 제거합니다. 각 웰에 150 µL의 신선한 N two B 27을 첨가하되, 부착된 응집체가 떨어질 수 있을 정도의 충분한 힘으로 가합니다. 이 과정을 24시간마다 반복하여 총 약 5일 동안 배양합니다.

응집체를 고정하기 위해 준비하려면, 먼저 피펫을 30도 각도로 유지한 채 각 웰에서 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 세포 응집체가 함께 흡입되는 것을 방지하기 위해, 각 웰에 150 µL의 PBS를 추가합니다. 응집체가 바닥에 가라앉을 때까지 몇 분간 기다린 후 PBS를 흡입하여 제거합니다.

멸균 가위를 사용하여 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. P 1000 피펫 팁의 분출구에서 약 3mm 위쪽 지점을 자릅니다. 이 팁으로 액체의 소량을 피펫팅하여 웰에 분주하며 마무리합니다.

응집체를 흔들어 웰 바닥에서 떼어냅니다. 그런 다음 팁으로 응집체를 빨아들여 유리 초파리 해부 접시로 옮깁니다. 동일한 절차를 사용하여, 동일한 면역염색 과정을 거칠 모든 응집체를 하나의 해부 접시에 모읍니다.

해부용 웰을 현미경 아래에 놓고, 응집체들이 중심부로 이동하도록 가볍게 흔들어 줍니다. 그다음 웰의 가장자리에서 PPS를 조심스럽게 흡입합니다. 이때 응집체가 제거되지 않도록 주의하십시오.

응집체를 고정하기 위해 갓 조제한 4% formaldehyde 용액 1 mL를 첨가하고, 4 °C에서 오비탈 쉐이커를 이용해 2시간 동안 배양합니다. 이때 속도는 낮게 설정하십시오. 응집체가 흡입되지 않도록 주의하여 formaldehyde 용액을 제거한 다음, 웰에 PBS 1 mL를 첨가합니다.

플레이트를 오비탈 셰이커에 넣고 10분 동안 흔들어 줍니다. 웰에서 PBS를 제거하고 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 다음으로, P-B-S-F-T 용액 1 mL를 추가하고 플레이트를 오비탈 셰이커에 올려 10분 동안 흔들어 줍니다.

용액을 흡입하여 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 비특이적 면역 반응으로 인한 응집체 형성을 차단하기 위해 웰당 1 mL의 PBS-FT를 첨가합니다. 플레이트를 4 °C에서 저속으로 회전시키는 오비탈 셰이커에 1시간 동안 둡니다.

배양 후, 웰에서 블로킹 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 P-B-S-F-T에 희석한 1차 항체 500 microliters를 첨가합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라폼으로 밀봉하고, 저속 오비탈 쉐이커에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 그다음, 1차 항체 용액을 미리 냉각시킨 P-B-S-F-T로 교체합니다.

플레이트를 오비탈 셰이커(orbital shaker) 위에 올려 응집체를 세척합니다. 4 °C에서 저속으로 5분 동안 설정합니다. 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.

오비탈 쉐이커를 사용하여 4°C의 저속에서 P-B-S-F-T로 두 번의 세척 사이클을 추가로 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 대로, 세척액을 제거하고 P-B-S-F-T에 희석한 2차 항체 500 µL와 함께 반응시킵니다. 핵을 시각화하기 위해 1 µg/mL의 herst를 첨가하고, 빛이 차단된 상태에서 자이레이터 로터를 이용해 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

호일로 감싼 상자 속에 넣어 빛을 차단한 상태로 4°C에서 PBS FT로 세척 과정을 한 번 더 수행합니다. 0.2% FBS와 0.2% Triton X 100이 포함된 PBS 또는 PBT 버퍼를 사용하여 실온에서 추가 세척을 수행합니다. 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 응집체를 PBT와 1:1 비율로 혼합한 글리세롤 1 mL와 함께 실온의 암실에서 30분 동안 인큐베이션합니다.

그 다음, 7:3 비율의 glycerol과 PBT 혼합액 1 mL와 함께 30분 동안 배양합니다. 공초점 이미지 촬영을 위한 시료 준비를 위해 glycerol-PBT 용액을 흡입하여 제거하고, 이를 마운팅 용액(mounting medium) 1 mL로 교체합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드 위에 응집체들을 17 µL 방울 형태로 마운팅합니다.

피펫 팁을 사용하여 양면 테이프 조각을 네 번 접어 스페이서를 준비합니다. 그런 다음 슬라이드 상의 응집물 양쪽에 스페이서를 하나씩 배치하고, 커버 글라스를 뒤집어 스페이서 위에 얹은 후 공초점 현미경을 사용하여 응집물을 촬영합니다. 플레이팅 48시간 후에 매끄러운 경계를 가진 직경 약 150 µm의 응집물이 형성됩니다.

반면, 배지의 품질 저하, 부적절한 세포 수 분주 또는 세포 부착 불량은 응집체의 적절한 형성을 방해할 수 있습니다. 글리코겐 합성효소 인산화효소 3 억제제인 CHI 9 9 0 2 1로 120시간 동안 지속적으로 처리하면 구형의 응집체가 길쭉한 형태로 변합니다. 또한, 처리 후 응집체의 한쪽 끝에 SOX GFP 양성 세포가 뚜렷하게 국소화되며, 처리 조건에 따라 단일 응집체의 형태 및 형광 마커의 형태적 변화가 다르게 나타납니다.

응집체 내의 국소화는 시간에 따라 추적할 수 있습니다. 숙련된 연구자라면 적절한 절차를 통해 약 45분 이내에 응집체를 생성할 수 있을 것입니다. 응집체가 형성된 후에는 응집체 내의 유전자 발현 변화를 조사하기 위해 면역 염색 대신 Q-R-T-P-C-R과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, MECs로부터 응집체를 형성하고, 특정 자극을 가하며, 면역 염색 및 공초점 현미경 분석을 위해 응집체를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.