단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

이 새로운 형광 측정 약물 스크리닝 방법의 전반적인 목표는 약물이 로딩된 단백질 템플릿 내에서 형광 금 나노클러스터를 형성함으로써 표적 단백질에 대한 소분자 약물의 결합 친화도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 약물 분자의 결합 강도가 단백질의 언폴딩(unfolding) 방지 안정성에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 이것이 어떻게 서로 다른 강도의 형광 금 나노클러스터 형성으로 이어지는지와 같은 단백질 표적 약물 발견 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정교한 장비나 번거로운 라벨링 단계 없이도 표적 단백질을 형광 바이오센서로 전환하여 소분자 약물을 빠르게 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

공동 저자의 발견과 저의 지식을 결합하여, 단백질을 로딩했을 때 플라스모닉 나노입자에 뚜렷한 안정화 효과가 있음을 확인하였으며, 이는 본 방법의 아이디어로 이어졌습니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 약물 스크리닝을 위한 화학 시약 준비 단계부터 이 절차를 시작하십시오. 인간 혈청 알부민 또는 HSA 템플릿 금 나노클러스터를 준비하기 위해, 마이크로 마그네틱 Stir bar가 각각 들어있는 두 개의 유리 바이알을 온도가 조절 가능한 두 개의 개별 마그네틱 교반기 위에 놓으십시오.

마그네틱 스터러 한 대의 온도를 60 °C로 설정합니다. 다음으로, 금 이온이 단백질 템플릿 내에 캡슐화될 수 있도록 지속적으로 교반하면서 각 바이알에 human serum albumin 용액 200 µL, 초순수 200 µL 및 염화금 용액 200 µL를 첨가합니다. 2분 후, 각 바이알에 수산화나트륨 용액 20 µL를 첨가하여 human serum albumin의 환원 능력을 활성화함으로써 금 나노 클러스터를 형성시킵니다. 0분부터 시작하여 20분마다 반응 시간을 기록합니다.

각 샘플을 50 µL씩 취하여 384-well 블랙 플레이트에 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 방출 스펙트럼을 측정합니다. 100분 후 마그네틱 교반을 중단합니다.

싱크대에서 흐르는 물에 유리 바이알을 식힙니다. 다양한 온도 조건에서 금 나노 클러스터의 형성 속도론을 확보하기 위해 각 샘플의 광 방출 스펙트럼을 지속적으로 측정합니다. 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA 템플릿 금 나노 클러스터를 준비하려면, 마이크로 자석 교반자가 들어 있는 유리 바이알을 마그네틱 스터러 위에 놓습니다.

온도를 실온으로 유지하십시오. 유리 바이알에 BSA 용액 200 µL, urea 200 µL, gold chloride 용액 200 µL를 넣고 지속적으로 교반하며 혼합하십시오. 2분 후 수산화나트륨 용액 20 µL를 첨가하십시오.

금 나노 클러스터를 형성하기 위해 BSA의 환원 능력을 활성화하고, 반응 시간을 0분으로 하여 기록하기 시작합니다. 반응 혼합물의 광방출 스펙트럼을 매시간 측정하십시오. 마그네틱 바가 들어 있고 약물 또는 순수 HSA가 미리 라벨링된 5개의 유리 바이알을 온도 조절이 가능한 다지점 마그네틱 교반기 위에 배치하십시오.

각 바이알에 HSA 200 µL를 추가합니다. 그다음, 이전에 준비한 각 약물 솔루션 1 µL를 해당되는 4개의 바이알에 추가합니다. 또한, 교반기의 대조군 스위치에 DMSO 1 µL를 추가합니다.

회전 속도를 360 RPM으로 설정하고 1시간 동안 배양하여 약물이 HSA에 결합하도록 합니다. 1시간 후, 지속적으로 교반하면서 각 바이알에 milli Q water 200 µL와 염화금 용액 200 µL를 첨가합니다. 온도를 60 °C로 설정하고 10분 동안 지속적으로 교반합니다. 10분 후, 각 바이알에 1.5 M 수산화나트륨 20 µL를 첨가하고 반응 시간을 0분부터 기록하기 시작합니다.

측정을 위한 혼합 반응 용액은 약물 첨가 순서를 동일하게 따라야 하며, 시간 지연 효과를 최소화하기 위해 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다. 각 바이알에서 50 µL의 용액을 빠르게 취하십시오. 이를 384-웰 블랙 플레이트로 옮겨 방출 스펙트럼을 측정합니다. 10분 간격으로 각 샘플의 방출 스펙트럼을 기록하여, 서로 다른 네 시점에서 최소 4개의 스펙트럼을 수집하십시오.

일관된 경향성의 결과를 얻기 위해 이 단계들을 여러 번 반복하십시오. 각 시료에 대해 시간 분해 광전자 방출 스펙트럼을 작성하십시오. 모든 시료의 피크 강도를 확인하고 이를 시간에 따라 도식화하여, 서로 다른 약물이 로딩된 단백질 템플릿 내에서 금 나노 클러스터의 형성 속도론을 비교함으로써 각 약물과 HSA 사이의 결합 상수를 측정하십시오.

약물 용액을 네 가지 서로 다른 농도의 ibuprofen 용액으로 교체합니다. 10분 후, 싱크대에서 흐르는 물에 유리 바이알을 식힙니다. 각 바이알에서 위 용액 50 µL를 취해 384-well 블랙 플레이트에 넣고 방출 스펙트럼을 측정합니다.

자기 교반을 멈추기 전, 서로 다른 약물 농도에서 두 세트의 결과를 추가로 얻기 위해 이 단계들을 두 번 더 반복하십시오. 그 후, 각 개별 배치에서 얻은 원시 데이터에 대해 광방출 스펙트럼을 도식화하고 결과를 분석하십시오. Origin Pro와 같은 소프트웨어를 사용하여 각 시료의 광방출 스펙트럼을 도식화하고 피크 강도를 결정하십시오.

약물 농도에 따른 상대적 형광 강도를 계산하고 그래프로 나타내십시오. 그런 다음, 단일 부위 결합 모델(single site binding model)에 데이터를 피팅하여 결합 상수를 계산하십시오. Origin Pro와 같은 소프트웨어에서 Mics cementin 방정식을 사용하여 이를 수행하십시오.

메뉴에서 분석의 비선형 곡선 피팅(non-linear curve fit)을 선택한 다음, 설정 함수 선택 페이지의 성장 시그모이드(growth sigmoidal) 카테고리에서 hill 함수를 선택하십시오. 피팅(fit)을 클릭하여 표시합니다. 여기에 표시된 피팅 결과는 서로 다른 단백질 변성 조건에서 생성된 금 나노 클러스터의 시간 분해 광방출 스펙트럼의 대표적인 결과입니다.

금 나노 클러스터는 온도가 높을수록 더 빠르게 형성되는 것을 관찰할 수 있습니다. 요소 변성 조건 또한 BSA 단백질을 템플릿으로 사용하여 금 나노 클러스터를 직접 합성하는 것을 촉진할 수 있습니다. 약물이 적재된 HSA를 템플릿으로 사용하여 금 나노 클러스터의 형광 강도를 기반으로 한 신속 형광 약물 스크리닝의 전형적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

형광 강도가 높을수록 HSA에 대한 약물 분자의 결합력이 약함을 의미합니다. 이 스펙트럼들은 ibuprofen이 적재된 HSA 내부에서 형광 금 나노 클러스터의 형성 속도에 약물 적재 농도가 미치는 영향을 보여줍니다. 약물 농도가 높을수록 결과물인 금 나노 클러스터의 형광 신호가 낮아지며, 여기에 제시된 내용은 단백질-약물 결합 상수를 결정한 대표적인 결과입니다.

이는 다양한 농도의 이부프로펜 약물이 미리 로딩된 HSA 템플릿 내에서 합성된 금 나노 클러스터의 상대적 형광 강도를 MICUs cementin 방정식에 대입하여 계산합니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 여러 약물에 대한 스크리닝을 병렬로 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 약물이 로딩된 단백질 내에서 금 나노 클러스터를 합성하는 방법과, 결과물인 금 나노 클러스터에서 방출되는 형광 신호를 통해 표적 단백질에 대한 약물의 결합 친화도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.