Name: 단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 학습하세요 형광 금 나노클러스터를 이용한 단백질 표적 소분자 약물 검사 방법을. 이 기술은 약물-단백질 결합 친화력을 빠르게 측정하여 신약 개발 과정을 효율화합니다.

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Y.N.T.는 JCO CDA 보조금 13302FG063에 따른 재정 지원에 대해 싱가포르 A*STAR(Agency for Science, Technology and Research)에 감사드립니다.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 화학 물질의 안전 보건 자료 (SDS)를 참조하시기 바랍니다. 약물 스크리닝 실험은 대량의 대응에 비해 추가 위험이있을 수 있습니다 나노 물질의 합성 및 처리를 포함한다. 확인하십시오 모든 필요한 통제 조치는 엔지니어링 컨트롤 (흄 후드) 및 개인 보호 장비 (PPE, 예를 들어, 안전 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발, 내 화학성 장갑, 안전 고글)의 사용을 포함, 실험을하는 동안 연습을한다. 약물 검사 용 화학 시약 1. 준비 <ol><li> 금 나노 합성 전구체 <ol><li> 금 (III) 클로라이드 용액을 15 mm로 제조 초순수 6.9 ㎖에 금 (III) 클로라이드 용액 (99.99 % 미량 금속 기준으로, 묽은 염산 30 중량. %) 30 mg을 용해. 주의 : 금 염화물 용액은 부식성과 자극성이다. 눈과 피부에 직접 접촉을 방지하기 위해 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 디초순수 1 ㎖의 HSA 또는 BSA의 ssolve 74 mg을 74 밀리그램 / 단백질 원액 ml의 준비를한다. </li></ol></li><li> 약액 <ol><li> 목적하는 약물의 양, 예를 들면, (a) 이부프로펜 1.9 ㎎, (b) 와파린 2.8 ㎎, (c) 페니토인 2.3 ㎎, 450 mm의 제조 DMSO 20 μL의 (d) 술 파닐 아미드 1.5 ㎎을 용해 약물 재고 솔루션. 주 : 이들 약물은 소수성이고 물에 난 용성이 때문에 DMSO 용매로서 선택된다. </li></ol></li><li> 기타 시약 <ol><li> NaOH 용액 1.5 M을 제조 초순수 10ml에 수산화 나트륨 펠렛을 600 mg을 녹인다. 우레아 수용액의 20 M을 제조 초순수 2 ㎖에 우레아 2.4 g을 용해. </li></ol></li></ol> 단백질 템플릿 형태 금 나노 2. 합성 <ol><li> HSA-주형 금 나노 (HSA-금 나노) <ol><li> 두 개의 개별 온도 제어 자기 교반에 두 개의 유리 병, 거기에 마이크로 자기 교반 막대를 포함하는 각을 배치rers. </li><li> 60 ° C로 한 마그네틱 스터 러의 온도를 설정하고, &quot;60 ℃&quot;로 그 위에 유리 바이알 라벨; 다른 자기 교반기는 그 위에 유리 바이알 &quot;RT&quot;로 표시되는 상온 (RT)에서 유지된다. </li><li> 단백질 주형 내부 금 이온의 밀봉을 허용하도록 HSA 용액 200 μL, 초순수 200 μL, 및 (달리 명시하지 않는 한 360 RPM으로 설정) 일정한 교반 하에서 각각의 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 추가한다. </li><li> 금 나노 결정을 형성 HSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하도록 2 분 후에, 각각의 바이알에 NaOH 용액 20 μL를 추가한다. </li><li> 매 20 분, 384 웰 검은 판에 샘플의 각각의 솔루션의 50 μl를 그리는 마이크로 플레이트 리더와 발광 스펙트럼을 측정한다. 일반적인 스캔 설정 : - 850 nm의 λ 전 = 370 nm의은, λ EM은 410 =. </li><li> 100 분 후 자석 교반기를 중지합니다. </li><li> 싱크대에 흐르는 물에 유리 병을 쿨. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것. </li><li> 각 샘플은 다른 온도 조건에서의 Au 나노 결정의 형성이 반응 속도를 획득하기 위해 모든 시점에서 광전자 스펙트럼 플롯. </li></ol></li><li> BSA-주형 금 나노 (BSA-금 나노) <ol><li> 자기 교반기 위에 마이크로 자기 교반 막대를 함유하는 유리 바이알을 놓는다. 실내 온도와 같은 온도를 남겨주세요. </li><li> BSA 용액 200 μL, 우레아 200 μL, 일정한 교반하에 유리 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 혼합한다. </li><li> 2 분 후에, 금 나노 결정을 형성하기 위해 BSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하는 NaOH 용액 20 μL를 추가한다. 시간당 반응 혼합물의 광전자 스펙트럼을 측정한다. 주 : BSA - 금 나노 결정의 광전자 스펙트럼을 측정덜 빈번 BSA - 금 나노 결정의 형성 비율 인해 우레아 이하의 효과를 동일 온도에서 HSA-Au로보다 느리게하기 때문에 단백질을 전개한다. </li><li> 7 시간 후 자석 교반기를 중지합니다. 요소의 변성에 의해 금 나노 결정의 형성 반응 속도를 볼 수있는 모든 시간에 광전자 스펙트럼을 플롯. </li></ol></li></ol> 3. 작은 분자 약물 검사 <ol><li> HSA에 다른 작은 분자 약물의 화면 상대 결합력 <ol><li> 다섯 유리 병, 온도 제어 멀티 자석 교반기 위에 거기에 자기 교반 막대를 포함하는 각 놓습니다. A, B, C로이 병에 레이블을 각 약물, 즉 이부프로펜, 와파린, 페니토인, 그리고 설파 닐 아미드에 대한 각각 거라고. 제어 순수한 HSA와 함께 한 레이블. </li><li> 각 바이알에 HSA 200 μl를 추가합니다. 네 대응하는 유리 병에 약액의 1 μl를 추가합니다. 컨트롤에 DMSO의 1 μl를 추가합니다. 교반기 전환하고 360 회전 속도를 설정RPM 및 HSA에 결합하는 약물을 완료 할 수 있도록 1 시간 동안 품어. </li><li> 1 시간 후, 밀리 Q 물 200 μL와 일정한 교반하면서 각각의 유리 병에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μl를 추가합니다. 10 분 동안 일정하게 교반하면서 60 ℃로 온도를 설정합니다. 각 바이알에 1.5 M NaOH를 20 μl를 첨가하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작한다. </li><li> 신속하게 방출 스펙트럼을 (결과는 0 분으로 표시) 384 웰 블랙 플레이트에 각 바이알에서 용액 50 μL를 그리고 측정한다. 각 샘플마다 10 분의 발광 스펙트럼을 녹음. 네 개의 다른 시간에 적어도 네 개의 스펙트럼을 수집, 즉, 0, 10, 20, 및 30 분이다. </li><li> 일관된 추세에 결과를 얻기 위해 3.1.4 여러 번 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. 자석 교반기를 중지합니다. </li><li> (- D 및 제어) 각 샘플에 대한 시간 - 분해 광전자 스펙트럼 플롯. 다이에서의 Au 나노 결정의 형성 반응 속도를 비교하는 시간에 대한 모든 샘플 플롯의 피크 강도를 파악fferent 약물로드 단백질 템플릿. </li></ol></li><li> HSA에 특정 약물의 결합 상수를 측정 <ol><li> 3.1.4 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. (단 약물 로딩없이 HSA를 사용하여 제어 샘플 포함) 네 가지 농도에서 이부프로펜 솔루션 약물 솔루션을 교체합니다. 대응 약물 농도에 따른 유리 바이알에 라벨. </li><li> 10 분 후, 싱크대에서 흐르는 물에 유리 튜브를 냉각. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것. </li><li> 384 웰 검은 접시에 각각의 유리 병에서 위의 솔루션의 50 μL를 그리고, 발광 스펙트럼을 측정한다. </li><li> 다른 약물 농도 결과의 또 다른 두 세트를 얻기 위해 3.2.3 두 번 더 - 반복 3.2.1 단계를 반복합니다. </li><li> 자석 교반기를 중지합니다. 광전자 스펙트럼을 플롯 한 결과를 분석한다. <ol><li> 각각의 배치에서 얻어진 미가공 데이터를 위해, 각각의 광전자 스펙트럼 플롯소프트웨어 샘플 등 OriginPro의 소프트웨어와 같은 피크 강도를 찾을 수 있습니다. </li><li> 상대 형광 강도 계산 및 플롯 [(I 0 - I)을 / I 0] 나는 내가 각각 약물로드 HSA 순수한 HSA에 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 참조 0 약물 농도에 대하여. </li><li> 미카엘리스 - 멘텐 방정식을 사용하여 단일 부위 결합 모델에 데이터를 피팅함으로써 결합 상수를 계산한다 : R 최대가 최대 응답 신호가 나타내는 C / (K D + C) × Y = R 최대를, C는 리간드의 농도이고 D 및 K는 결합 상수이다. 이러한 OriginPro의 같은 소프트웨어에서이 작업을 수행합니다. 비선형 커브 피팅 피팅 메뉴 분석을 선택한 다음, 성장 / S 자형 범주에서 힐 기능을 선택합니다. 설정에서 : 기능 선택 페이지에서 장착 결과를 표시하는 맞춤을 클릭합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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이 방법으로 강조 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 다른 작은 분자 약물의 상대적 결합 친 화성을 심사의 프로토콜이 단계에서 3.1.2, 3.1.3 및 3.1.4은 상대 바인딩 강도 일관된 추세를 보여주는 좋은 결과를 얻을 중요하다. 이 단계에서, 측정 용 반응 액을 화학 물질을 첨가하여 드로잉 작업은 시간 지연 효과 및 일관성을 보장하기 위해 실시한다 측정 반응 액을 화학 물질을 첨가 및 도면의 동일한 시퀀스를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리해야한다. HSA에 이부프로펜의 결합 상수를 측정 프로토콜에서, 단계 3.2.4 K D의 측정 성공 향해 매우 중요하다. 이상의 농도 지점을 선택할 수 있지만, 측정하는 시료에 의한 더 많은 시간 지연 효과는 더 깊은된다. 시간 지연의 효과를 최소화하기 위해, 다양한 농도의 합성은 몇 differe로 분리 될 수있다병렬 NT 배치. 각 배치에서, 약물이없는 컨트롤은 일관성을 보장하고 가능한 시스템 오류를 제거하기 위해 포함되어야한다. <p class="jov...

인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)와 같은 혈청 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 혈액 구획의 삼투압을 유지하는데 중요한 역할을한다. 또한 스테로이드와 같은 낮은 수용해도의 소분자, 지방산, 갑상선 호르몬, 약물의 광범위한 담체 단백질로서 인식된다. 바인딩 재산권 알부민 혈청하는 이들 분자의 (예를 들어, 친 화성 또는 강도를 결합, 결합 부위)의 약동학에 중요한 주제를 형성한다. 1-4 여러 분석 방법과 같은, 알부민 혈청 상이한 약물의 결합 특성을 연구하기 위해 개발되어왔다 X 선 결정학, 5,6- 핵 자기 공명 (NMR), 7-11 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 12, 13 등 그러나, 이들 방법은 지루하고 시간 소모적 해석 처리 (하나에 의해 제한되는 예를 들면, X 선 crystallo위한 단결정 성장그래픽 연구), 전문 및 고가의 장비의 요구 사항 (SPR), 또는 검출을위한 비용이 많이 드는 동위 원소 표지 (NMR)을 필요로한다. 또한, 빨리 감기 직쇄, 비용 효율적인 방법으로 저분자 약물 스크리닝하는 다른 방법을 개발하는 것이 매우 바람직하다. 금 나노 클러스터 (금 나노)는 그들의 분리 및 크기에 의존하는 전자 구조, (18)에 그들은 광범위한 연구 관심을 받고있다 2 나노 미터. 14 ~ 17보다 작은 크기의 금속 원자의 수십 포함 된 나노 물질의 특별한 유형이다 20-23 이러한 독특한 재료의 특성, 특히 강한 형광이, 생물학적 시스템에서 감지 및 영상. 24-32 초소형 형광 금 나노 기능성 단백질을 사용하여 합성 할 수있는 등 다양한 응용 프로그램을 발견했다. (19)와 분자 등의 흡수 및 배출, 이러한 주형으로서 혈청 알부민 등. (33)의 전형적인 주형 단백질 합성<html> 금 나노 결정은, 금 염 일정량 제 단백질 안에 캡슐화되고이어서 단백질 자체에 의해 감소​​된다. 단백질의 환원 능력은 알칼리성 용액의 pH를 증가시킴으로써 활성화 될 수있는 기능성의 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신) 성분에 기인한다. 단백질 구조의 전개는 금 나노 결정의 형성을위한 중요한 단계로 고려된다. 전개 된 단백질, 더 환원 관능기 캡슐화 금 염에 노출 될 수 있기 때문이다. 단백질 변성제에 열처리 또는 노광에 의해 달성 될 수 흘러 가고. 작은 분자 약물의 도입은 또한 중간 변성 온도 및 전개의 엔탈피를 수정 즉 전개 과정에 영향을 미칠 수있다. (34, 35) 이러한 모든 요인의 효과를 차례로 형광 금 나노 결정의 형성 반응 속도에 의해 반사 될 수 있으며 각성 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도. 36 e_content는 &quot;&gt;이 비디오는 높은 온도 (60 ℃)에서 약물 - 로딩 알부민 단백질의 Au 나노 결정을 합성 또는 변성제 (예를 들면, 우레아) 얻어진 금 나노 결정의. 형광 강도의 존재 하에서 약물의 스크리닝 방법을 보여 신호 판독이다. 먼저, 금 나노가 금 나노. 초의 형성 반응 속도에 영향을 미치는 단백질 (열처리 또는 변성제에 의해 유도) 흘러 가고 방법을 보여 60 ℃에서 또는 우레아의 존재하에 처리 된 HSA 및 BSA 템플릿에서 합성되어, 금 나노 결정은 다른 약제와 함께 미리로드 단백질 템플릿을 합성하고, 얻어진 금 나노 결정의 상대적 형광 농도의 약물 로딩 효과는 상대적인 결합 강도의 측정을 제공하는 연구된다. 마지막으로, Au로 NC 약물 선별 프로토콜을 위해 수정 될 고정 된 농도의 단백질에 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)의 정량적 측정.

<table><tbody><tr><td>금 (III) 염화물 용액, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>부식성, 자극성</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>이부프로펜, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>와파린, 98%</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>페니토인</td><td>시그마-알드리치</td><td>PHR1139</td><td></td></tr>술<tr><td>파닐아미드, 99%</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마-알드리치</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td>221465</tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>384-well plate</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 공기 치환 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &#956; l 공기 변위 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; l 공기 치환 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,000 &#956; l Eppendorf 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &#956; l Eppendorf 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; l Eppendorf 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml 유리 바이알(나사 캡</td><td></td><td></td><td></td>포함</tr>) <tr><td>4 ml 유리 바이알(나사 캡</td><td></td><td></td><td></td> 포함</tr></tbody></table>)

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

우리는 금 나노 결정에서 방출되는 차동 형광 신호에 기초하여 약물 - 로딩 단백질 내의 형광 금 나노 클러스터 (금 나노)를 형성함으로써 표적 단백질에 작은 약물 분자의 결합 친화도를 결정하기위한 새로운 약물 스크리닝 방법을 보여준다. 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 단백질은 알부민 단백질 모델로서 선택된다. 4 개의 작은 분자 약물 알부민 단백질에 다른 결합 친화도의 (예를 들어, 이부프로펜, 와파린, 페니토인 및 설파 닐 아미드)를 시험한다. 이는 변성 조건 (즉, 60 ° C 또는 우레아의 존재하에)하에 약물로드 알부민 단백질 내부 형광 금 나노 결정의 형성 비율은 (약물)없이 깨끗 단백질에 형성된 것보다 느리다는 것을 발견 하였다. 또한, 상기와 같은 나노 결정 형성의 형광 강도는 반비례 알부민이 단백질 약물의 결합 친화도에 상관 관계가 발견된다. 특히,금 나노 결정 형성 속도 느린 약물 - 단백질 결합 친 화성이 높은, 이렇게 얻어진 금 나노 낮은 형광 강도가 관찰된다. 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도 테스트 따라서 다른 약물의 상대적인 결합 강도의 단순한 측정을 제공한다. 이 방법은 단순히 고정 된 단백질의 단백질 농도로 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써, 특정 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)를 측정하기 위해 연장된다. 측정 결과는 다른 프레스하지만 더 복잡한 방법을 이용하여 얻어진 값과 잘 일치.

단백질의 반응성 작용기 (예를 들어, 티로신 잔기)가 캡슐화 된 금 이온을 감소시키고 이에 따라 금 나노 결정의 형성 비율을 가속 노출 될 수 있기 때문에, 전개 된 단백질들은 단백질 주형의 Au 나노 결정의 형성에 중요한 절차이다. 가열 및 외부 변성제는 단백질 전개 과정을 촉진하기 위해 두 가지 일반적인 방법이다. (1)는 모델 단백질로서 HSA를 사용하여, 금 나노 결정의 형성 동력학 가열 효과 및 부가 외부 변성 화제를 보여주고있다. 금 나노 결정의 형성 동력학 가열 효과는 광 발광 제 스펙트럼의 경시 진화 (도 1a 및도 1b)을 측정함으로써 조사 하였다. 반응은 60 ℃에서 수행 될 때 progressi 증가 광전자 스펙트럼 33, 36의 670 nm에서 중심 분명한 피크로 확인 된 바와 같이, 적색 발광의 Au 나노 빠르게, 시간 (100 분)의 짧은 시간에 형성된다vely 시간 <stro...

약물 적재 단백질을 주형으로 사용하는 초소형 형광 금 나노클러스터(Au NC)의 현장 합성을 기반으로 하는 소분자 약물 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 단백질 템플릿 Au NC에서 방출되는 가시적인 형광 신호에 의해 표적 단백질에 대한 약물의 결합 친화도를 간단하게 결정할 수 있습니다.

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

이 새로운 형광 측정 약물 스크리닝 방법의 전반적인 목표는 약물이 로딩된 단백질 템플릿 내에서 형광 금 나노클러스터를 형성함으로써 표적 단백질에 대한 소분자 약물의 결합 친화도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 약물 분자의 결합 강도가 단백질의 언폴딩(unfolding) 방지 안정성에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 이것이 어떻게 서로 다른 강도의 형광 금 나노클러스터 형성으로 이어지는지와 같은 단백질 표적 약물 발견 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정교한 장비나 번거로운 라벨링 단계 없이도 표적 단백질을 형광 바이오센서로 전환하여 소분자 약물을 빠르게 스크리닝할 수 있다는 점입니다.공동 저자의 발견과 저의 지식을 결합하여, 단백질을 로딩했을 때 플라스모닉 나노입자에 뚜렷한 안정화 효과가 있음을 확인하였으며, 이는 본 방법의 아이디어로 이어졌습니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 약물 스크리닝을 위한 화학 시약 준비 단계부터 이 절차를 시작하십시오. 인간 혈청 알부민 또는 HSA 템플릿 금 나노클러스터를 준비하기 위해, 마이크로 마그네틱 Stir bar가 각각 들어있는 두 개의 유리 바이알을 온도가 조절 가능한 두 개의 개별 마그네틱 교반기 위에 놓으십시오.마그네틱 스터러 한 대의 온도를 60 °C로 설정합니다. 다음으로, 금 이온이 단백질 템플릿 내에 캡슐화될 수 있도록 지속적으로 교반하면서 각 바이알에 human serum albumin 용액 200 µL, 초순수 200 µL 및 염화금 용액 200 µL를 첨가합니다. 2분 후, 각 바이알에 수산화나트륨 용액 20 µL를 첨가하여 human serum albumin의 환원 능력을 활성화함으로써 금 나노 클러스터를 형성시킵니다. 0분부터 시작하여 20분마다 반응 시간을 기록합니다.각 샘플을 50 µL씩 취하여 384-well 블랙 플레이트에 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 방출 스펙트럼을 측정합니다. 100분 후 마그네틱 교반을 중단합니다.싱크대에서 흐르는 물에 유리 바이알을 식힙니다. 다양한 온도 조건에서 금 나노 클러스터의 형성 속도론을 확보하기 위해 각 샘플의 광 방출 스펙트럼을 지속적으로 측정합니다. 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA 템플릿 금 나노 클러스터를 준비하려면, 마이크로 자석 교반자가 들어 있는 유리 바이알을 마그네틱 스터러 위에 놓습니다.온도를 실온으로 유지하십시오. 유리 바이알에 BSA 용액 200 µL, urea 200 µL, gold chloride 용액 200 µL를 넣고 지속적으로 교반하며 혼합하십시오. 2분 후 수산화나트륨 용액 20 µL를 첨가하십시오.금 나노 클러스터를 형성하기 위해 BSA의 환원 능력을 활성화하고, 반응 시간을 0분으로 하여 기록하기 시작합니다. 반응 혼합물의 광방출 스펙트럼을 매시간 측정하십시오. 마그네틱 바가 들어 있고 약물 또는 순수 HSA가 미리 라벨링된 5개의 유리 바이알을 온도 조절이 가능한 다지점 마그네틱 교반기 위에 배치하십시오.각 바이알에 HSA 200 µL를 추가합니다. 그다음, 이전에 준비한 각 약물 솔루션 1 µL를 해당되는 4개의 바이알에 추가합니다. 또한, 교반기의 대조군 스위치에 DMSO 1 µL를 추가합니다.회전 속도를 360 RPM으로 설정하고 1시간 동안 배양하여 약물이 HSA에 결합하도록 합니다. 1시간 후, 지속적으로 교반하면서 각 바이알에 milli Q water 200 µL와 염화금 용액 200 µL를 첨가합니다. 온도를 60 °C로 설정하고 10분 동안 지속적으로 교반합니다. 10분 후, 각 바이알에 1.5 M 수산화나트륨 20 µL를 첨가하고 반응 시간을 0분부터 기록하기 시작합니다.측정을 위한 혼합 반응 용액은 약물 첨가 순서를 동일하게 따라야 하며, 시간 지연 효과를 최소화하기 위해 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다. 각 바이알에서 50 µL의 용액을 빠르게 취하십시오. 이를 384-웰 블랙 플레이트로 옮겨 방출 스펙트럼을 측정합니다. 10분 간격으로 각 샘플의 방출 스펙트럼을 기록하여, 서로 다른 네 시점에서 최소 4개의 스펙트럼을 수집하십시오.일관된 경향성의 결과를 얻기 위해 이 단계들을 여러 번 반복하십시오. 각 시료에 대해 시간 분해 광전자 방출 스펙트럼을 작성하십시오. 모든 시료의 피크 강도를 확인하고 이를 시간에 따라 도식화하여, 서로 다른 약물이 로딩된 단백질 템플릿 내에서 금 나노 클러스터의 형성 속도론을 비교함으로써 각 약물과 HSA 사이의 결합 상수를 측정하십시오.약물 용액을 네 가지 서로 다른 농도의 ibuprofen 용액으로 교체합니다. 10분 후, 싱크대에서 흐르는 물에 유리 바이알을 식힙니다. 각 바이알에서 위 용액 50 µL를 취해 384-well 블랙 플레이트에 넣고 방출 스펙트럼을 측정합니다.자기 교반을 멈추기 전, 서로 다른 약물 농도에서 두 세트의 결과를 추가로 얻기 위해 이 단계들을 두 번 더 반복하십시오. 그 후, 각 개별 배치에서 얻은 원시 데이터에 대해 광방출 스펙트럼을 도식화하고 결과를 분석하십시오. Origin Pro와 같은 소프트웨어를 사용하여 각 시료의 광방출 스펙트럼을 도식화하고 피크 강도를 결정하십시오.약물 농도에 따른 상대적 형광 강도를 계산하고 그래프로 나타내십시오. 그런 다음, 단일 부위 결합 모델(single site binding model)에 데이터를 피팅하여 결합 상수를 계산하십시오. Origin Pro와 같은 소프트웨어에서 Mics cementin 방정식을 사용하여 이를 수행하십시오.메뉴에서 분석의 비선형 곡선 피팅(non-linear curve fit)을 선택한 다음, 설정 함수 선택 페이지의 성장 시그모이드(growth sigmoidal) 카테고리에서 hill 함수를 선택하십시오. 피팅(fit)을 클릭하여 표시합니다. 여기에 표시된 피팅 결과는 서로 다른 단백질 변성 조건에서 생성된 금 나노 클러스터의 시간 분해 광방출 스펙트럼의 대표적인 결과입니다.금 나노 클러스터는 온도가 높을수록 더 빠르게 형성되는 것을 관찰할 수 있습니다. 요소 변성 조건 또한 BSA 단백질을 템플릿으로 사용하여 금 나노 클러스터를 직접 합성하는 것을 촉진할 수 있습니다. 약물이 적재된 HSA를 템플릿으로 사용하여 금 나노 클러스터의 형광 강도를 기반으로 한 신속 형광 약물 스크리닝의 전형적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.형광 강도가 높을수록 HSA에 대한 약물 분자의 결합력이 약함을 의미합니다. 이 스펙트럼들은 ibuprofen이 적재된 HSA 내부에서 형광 금 나노 클러스터의 형성 속도에 약물 적재 농도가 미치는 영향을 보여줍니다. 약물 농도가 높을수록 결과물인 금 나노 클러스터의 형광 신호가 낮아지며, 여기에 제시된 내용은 단백질-약물 결합 상수를 결정한 대표적인 결과입니다.이는 다양한 농도의 이부프로펜 약물이 미리 로딩된 HSA 템플릿 내에서 합성된 금 나노 클러스터의 상대적 형광 강도를 MICUs cementin 방정식에 대입하여 계산합니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 여러 약물에 대한 스크리닝을 병렬로 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 약물이 로딩된 단백질 내에서 금 나노 클러스터를 합성하는 방법과, 결과물인 금 나노 클러스터에서 방출되는 형광 신호를 통해 표적 단백질에 대한 약물의 결합 친화도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 형광단 태그가 지정된 Shwachman-diamond syndrome(SBDS) 단백질과 신장 인자 유사 1 GTPase(EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 이방성 기술에 대해 설명합니다. EFL1의 농도가 점차적으로 증가하는 SBDS 단백질을 배양할 때 이방성의 꾸준한 증가가 관찰되어 두 단백질 간의 성공적인 상호 작용을 나타냅니다.

Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

시차 주사 형광 측정법은 단백질과의 상호 작용을 위해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 여기에서는 이러한 분석을 확장하여 작은 분자와 단백질 파트너 사이의 해리 상수를 추정하는 간단한 방법을 제시합니다.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

본 프로토콜은 다운스트림 기능 및 구조 분석을 위한 품질을 평가하기 위해 막 단백질에 대해 형광 크기 배제 크로마토그래피(FSEC)를 수행하는 절차를 설명합니다. 세제 가용화 및 세제가 없는 조건에서 여러 G-단백질 결합 수용체(GPCR)에 대해 수집된 대표적인 FSEC 결과가 제시됩니다.

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

여기에 사용된 실험은 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 세포 열 이동 분석과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound(단백질 표적 예측 및 저분자 화합물의 검증)

정량적 비가역적 테더링(qIT) 분석은 표적 단백질과 선택적으로 결합하는 공유 단편을 식별하는 형광 기반 방법입니다. 여기에는 qIT 분석을 설명하기 위한 자세한 프로토콜이 요약되어 있으며 결과 예가 포함되어 있습니다.

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

학습하세요 형광 금 나노클러스터를 이용한 단백질 표적 소분자 약물 검사 방법을. 이 기술은 약물-단백질 결합 친화력을 빠르게 측정하여 신약 개발 과정을 효율화합니다.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

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