인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

이 실험의 전반적인 목표는 인간 중간엽 줄기세포 또는 MSC의 면역 조절 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 치료적 관련성이 있을 수 있는 과정인 인간 중간엽 줄기세포 면역조절과 관련된 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 effector의 발생, 백혈구 증식 및 세포 분열의 수를 모두 평가할 수 있다는 것이며, 이는 절차가 신발당 이루어질 것임을 입증할 수

우리 연구실의 기술자: pbmC를 분리하려면 50ml 원뿔형 튜브에 25ml의 헤파린화된 전혈 샘플을 25ml의 PBS로 희석하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 15ml의 파이를 추가하고 팩 밀도 구배를 새로운 50ml 튜브에 호출합니다. 그런 다음 튜브를 비스듬히 잡고 밀도 구배 위에 희석된 세포 현탁액을 천천히 층을 이룹니다.

이를 처리하면 레이어가 혼합되지 않습니다. 이 실험에서 가장 중요한 단계 중 하나는 밀도 구배를 방해하지 않고 혈액을 층을 이루는 것입니다. 이는 분리된 pbmc의 고순도 및 저적혈구 오염을 보장하기 위한 것입니다.

이제 원심분리로 세포를 분리합니다. 세 개의 뚜렷한 레이어가 분명해야 합니다. 상부 플라즈마 층, 하단 fial pack 밀도 구배 층 및 얇은 중간 PBMC 층.

PE 피펫을 사용하여 계면층을 흡인하지 않도록 주의하면서 상층을 제거합니다. 그런 다음 10ml 피펫을 사용하여 pbmc를 50ml 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 세포를 20ml의 PBS와 혼합한 다음 스핀다운하여 밀도 구배의 흔적을 제거합니다.

그런 다음 펠릿을 다른 20ml의 PBS로 세척하여 혈소판을 제거합니다. Resus는 두 번째 펠릿을 완전한 백혈구 배지에 1 밀리리터 당 7 번째 세포 농도의 1 배 10으로 현탁시킵니다. MSC 백혈구 공동 배양 사전 예열을 설정하려면 MSC 배지를 섭씨 37도에서 30분 이상 사용하지 않도록 완료합니다.

그런 다음 24개의 웰 플레이트에 웰당 완전한 MSC 배지 1밀리리터당 4번째 MSC를 5회 파종하여 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 부착하여 세포가 80% 합류점에 도달할 수 있도록 합니다. 다음 날 아침, 배지를 흡인하고 1ml의 완전한 백혈구 배지에 적절한 수의 CFSE 표지 P BMC를 MSC에 추가합니다. 1 대 10 MSC 대 PBMC 비율로 완전한 백혈구 배지 1밀리리터당 10마이크로그램의 PHA로 세포를 활성화합니다.

그런 다음 공동 배양 3일차와 5일차에 적절한 수의 공동 배양을 둥근 하단 팩스 튜브로 옮기고 유세포 분석을 통해 CFSE 표지 백혈구의 증식을 평가하여 효과기 억제 분석을 수행합니다. 2.5 곱하기 10으로 시연된 바와 같이 M-S-C-P-B-M-C 공동 배양을 설정하여 시작하여 250, 000 MSC와 6번째 p BMC 공동 배양을 설정합니다. 하위 개체군 선택을 위한 충분한 MSC 공동 배양 p BMC를 보장합니다.

섭씨 37도에서 48-72시간 후, 적절한 마그네틱 비드를 사용하여 관심 있는 MSC 유도 면역조절 백혈구를 선택합니다. 그런 다음 웰당 1ml의 완전한 백혈구 배지에 CFSE 표지된 동종 CD 4개의 양성 T 세포를 다양한 실험 비율로 첨가합니다. 다음으로, anti CD 3 28 conjugated microbeads를 1:1 B 대 세포 비율로 첨가하여 CD 4개의 양성 T 세포를 자극합니다.

공동 배양 3일째, 유세포 분석으로 CFSE 표지 CD 4개의 양성 T 세포의 증식을 평가합니다. MSC는 섬유아세포 방추체 모양의 형태를 가진 부착 세포입니다. 그리고 pbmc와 백혈구는 작고 둥글고 부착되지 않은 세포이기 때문에 이 두 세포 집단을 명확하게 구별할 수 있습니다. 공동 배양에서 증식이 없을 때 CFSE 표지된 세포는 세포가 활성화되었을 때 하나의 매우 양성적이고 날카로운 형광 피크로 관찰됩니다.

Proliferation은 Proliferation Suppression이 발생했을 때 형광 강도의 손실과 왼쪽 이동이 있는 여러 개의 작은 peaks로 나타납니다. 예를 들어, MSC 공동 배양에서 여러 개의 작은 피크는 피크가 오른쪽으로 이동하고 가장 오른쪽 피크의 선명도가 증가하는 것과 같이 형광 강도의 증가와 함께 수가 감소하며, 이는 effector 억제 분석에서 비분열 세포를 나타냅니다. CD 4 양성 T 세포 증식에 대한 MSC의 억제 효과는 용량 의존적 방식으로 추가로 평가할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 인간 중간엽 줄기세포 면역조절을 평가하는 방법을 잘 알게 되었을 것입니다. 인간 세포를 가지고 작업하는 것은 위험할 수 있으며 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.