Name: 인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 학습하세요 인간 중간 엽 줄기 세포(MSCs)의 면역 조절 특성을 공동 배양 시스템과 CFSE 표지를 활용하여 평가하는 방법을. 이 기술은 백혈구 증식과 면역 반응 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 NHRI(CS-104-PP-06에서 B.L.Y.)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

기관 심사위원회가 승인 한 환자 동의서는 인간 세포의 사용을 취득해야합니다. 사람 말초 혈액 단핵 세포의 1. 밀도 구배 분리 (PBMC를) <ol><li> 25 mL를 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 전체 혈액을 헤파린 25 ML을 추가합니다. <ol><li> 인산 완충 식염수 (PBS) 25 ㎖로 희석하여 세포. </li></ol></li><li> 새로운 50 ㎖ 튜브에 피콜 - 페이크 밀도 구배의 15 mL를 넣고 튜브 틸팅 동안 전혈의 믹싱으로 존재하지 않도록 매우 조심스럽게 천천히는 밀도 구배 위에 희석 세포 현탁액 25 ㎖에 추가 밀도 구배, 즉., 혈액 - 밀도 구배 인터페이스의 방해없이. </li><li> 원심 분리기 20 ° C에서 브레이크없이 30 온도 조절 스윙 버킷 로터에서 분 40 400 × g에서 1.2 단계에서 정지. 참고 : 세 가지 층은 원심 분리 후 명백하다 : 일즉 상층 존재 플라즈마; 바닥 클리어 층은 피콜 - 페이크 밀도 구배되며; 및 얇은 층은 중간 셀룰러 PBMC를 되 </li><li> 기음과는 단핵 세포 (즉, 림프구, 단핵구, 혈소판)의 계면 층을 방해하지 않도록주의로, 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 버린다. </li><li> 조심스럽게 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 10 ㎖ 피펫이 단핵 세포층을 수집한다. </li><li> , PBS의 20 ㎖와 튜브를 채우 잘 혼합하고, 20 ℃에서 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다. </li><li> 20 ℃에서 10 ~ 15 분 동안 200 × g에서 세포 PBS 20ml에 펠렛을 재현 탁하고 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다. 참고 :이 단계는 혈소판 - 원치 않는-내에서 PBMC를하다을 제거; 이 단계는 혈소판의 완전한 제거를 보장하기 위해 반복 될 수있다. </li><li> 특정 집단의 선택 범위가 없으면세포 수 (16)를 수행 한 후, 배양을 위해 바람직한, 백혈구 완전 배지에 재현 탁 된 세포 펠릿 (10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / RPMI-1640 배지에서 스트렙토 마이신)을 1 ml의 중단을 다음 단계로 진행하기 전에 10 7 PBMC를 당 매체. </li></ol> 백혈구 인구 2. 자기 라벨링 (특정 집단의 어떤 선택이 필요없는 경우 4 단계로 건너 뜁니다) <ol><li> 완전히 10 분, 흡인 상층 액 300 × g에서 원심 분리기 PBMC 서스펜션. </li><li> 10 7 총 세포 당 PBS의 80 μL에 재현 탁 세포 펠렛. </li><li> 10 7 총 세포 당 (T 림프구의 분리를위한 단핵 세포, CD4 자석 구슬의 격리를 위해 즉, CD14 자석 구슬) 지정된 자석 구슬의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어 냉장고에 8 ° C에 2에서 15 분 동안 품어. </li><li> 씻어 10 7 세포 당 PBS의 1-2 ML을 추가하고, 원심 분리기10 분 동안 300 × g에서. </li><li> 대기음 상층 액을 완전히 PBS 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁. </li></ol> 백혈구의 부분 집단 3. 자기 선택 참고 : 자기 비드 구분과 열의 다양한 제조 업체의 수와 세포 표면 마커에 의한 백혈구의 특정 인구의 분리에 사용할 수 있습니다. 격리 하나 또는 몇 가지 긍정적 인 마커 또는 원치 않는 인구의 고갈 후 음의 선택에 기반한 선택에 의해 할 수있다. (즉, 단핵구에 대한 CD4 T 헬퍼 림프구에 대한, 또는 CD14) 한 마커를 사용하여 긍정적 인 선택을 수행하는 일반적인 방법은 아래에 설명되어 있습니다. <ol><li> 준비 및 주요 마그네틱 분리기는 제조업체의 지침에 따라 분리 컬럼을 포함. </li><li> 표시 PBMC를의 샘플이 포함 튜브를 적용합니다. 긍정적으로 표지 및 unlabel의 수집이 15 ml의 원심 분리기 튜브를 제공합니다제조업체의 지침에 따라 에드 셀 분수,. </li><li> 107 세포 당 1 ml의 배지를 이용하여 세포 수를 카운트하고 15 백혈구 완전 배지에서 긍정적으로 선택된 백혈구 (예, CD4 + T 림프구 또는 CD14 + 세포)를 재현 탁. </li></ol> 대량 살상 무기 확산의 평가를위한 백혈구 4. CFSE 얼룩 주 : CFSE 널리 생체 내 및 시험 관내 연구에서 모두, 면역 학적 조사에 사용되었다. 우리의 프로토콜은 MSC / PBMC (또는 다른 백혈구)의 상호 작용의 체외 연구를 위해 최적화되었습니다. CFSE 체외 라벨을 수행에 관련된 일반적인 단계는 유사하지만, 프로토콜 (14)의 특정 용량과 타이밍의 차이가있을 수 있습니다. 이 때문에 다수의 인자, 즉, 사용 된 특정 세포 유형, 세포 수로 사용할 수 있고-있는 가능성 CFSE 형광 신호의 강도에 영향을 미칠 수있다. <ol&gt; <li> 10 μm의 (CFSE - 작업 솔루션)의 원하는 작업 농도로 PBS에서 CFSE 주식 솔루션 (10 mm)를 희석. CFSE-작동 용액으로 라벨링 10 7 세포 (즉, PBMC를 또는 T 세포)를 준비한다. </li><li> 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기는 세포 펠렛을 얻고 뜨는을 대기음합니다. </li><li> 부드럽게 예열 (37 ° C) CFSE-작동 용액 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 37 ℃에서 10 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 과량 CFSE을 씻어, 예비 냉각 (4 ℃) RPMI 배지를 10 % FBS를 함유하는 (부피 기준)으로 10 배의 세포 현탁액을 희석. 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 세포 침전물과 상층 액을 버린다. 두 번 더 이런 방식으로 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 원심 분리하여 세포를 다시 펠렛 세포 수 (15)를 계산. 1 ㎖의 백혈구 데워진 신선한 완전 배지에서 10 7 세포 (PBMC를 또는 T 세포를) 재현 탁. </li></ol> M 5. 공동 문화백혈구 및 백혈구의 활성화와 희주 <ol><li> 이하에서 30 분 동안 37 ° C까지 미리 따뜻한 MSC 완전 배지 (최적 MSC 성장을위한 테스트 된 10 % FBS (), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / DMEM 낮은 포도당 배지에서 스트렙토 마이신). </li><li> 24 웰 플레이트에서 MSC 완전 배지 1 ㎖에 50,000 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 / ㎠)에서 시드 엽 줄기 37 ° C의 배양기에 부착 O / N에 대한, 줄기 세포 수는 80 % 합류에 도달한다. </li><li> 시드 MSC 번호를 기반으로 대기음 매체와는 CFSE 표지 PBMC를 추가 (이전에 표시된 제발 위의 프로토콜 4 단계 참조)에 백혈구 완전 배지 1 ㎖에 (24 웰 플레이트에 전날 시드) 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 1시 10분 (셀 비율)로 PBMC를 엽 줄기 세포의 공동 배양 비율. </li><li> 1 ㎖의 백혈구 완전 배지의 총 부피에서 10 μg의 / ml의 최종 농도로, 미토 겐의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA), 비특이적 백혈구 활성화 제를 추가 웰당. <ol><li> Alternativ엘리는, 구체적으로 T 림프구의 활성화를 자극하기 위해 : α-CD3 / 28 마이크로 비드를 사용하여 (1)의 비드 간 T 림프구의 비율을 얻기 위해 두 세포 공동 배양에 추가 1. </li></ol></li><li> 50 PBMC를 / 웰 음성 대조군, 플레이트 (; 세포 밀도 또는 특정 이펙터 백혈구 인구 : 25 만 백혈구 / ㎠)의 경우 만 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와 24 웰 플레이트에; 양성 대조군을 위해, 추가로, PBMC를 웰 / 동일한 수의 도금을 10 μg / ML의 최종 농도로 PHA를 추가한다. </li><li> 3와 공동 배양 실험 5 일에, 형광에 적합한 488 nm의 여기 및 방출 필터와 유세포 분석 (17)에 의해 CFSE 표지 백혈구의 증식 (둥근 바닥 튜브에 배치)을 평가한다. 주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 또한 MO 같은 백혈구 사이토 카인 발현 양상의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 이러한 CFSE로 표지 백혈구를 위해 수행 될 수있다중간 엽 줄기 세포에 의해 dulated. CFSE이 형광 용 필터에 적절한 평가되기 때문에, 항체는 각종 사이토 카인이 형광 또는 유사한 스펙트럼 이외의 형광 색소에 접합 될 필요가 평가하도록 선택 (즉, 피코 에리 트린, 엽록소 단백질 복합체 (를 PerCP) peridinin). </li></ol> 6. 변화 : 이펙터 억제 분석 마그네틱 활성화 CFSE 표지 이펙터 CD4 + T 세포에 면역 백혈구를 MSC 유도, 비드 선택 <ol><li> 6 웰 플레이트에 MSC 전체 매체의 3 ㎖에 25 만 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 / ㎠)에서 종자 중간 엽 줄기 세포 37 ° C 배양기에 부착 O / N를 들어, 줄기 세포 수는 80 %의 합류에 도달합니다. 적어도 3 개의 6- 웰 플레이트 모집단 선택 충분한 MSC-PBMC를 공 배양을 보장하기 위해 필요하다. </li><li> 대기음 매체는, 및 1 단계에 따라하지만 / 웰 (세포 밀도 2.5 × 10 6 세포에서 6 웰 플레이트에서 분리 PBMC를 추가 : 250,000 르를백혈구 전체 매체의 3 ㎖와 ukocytes / ㎠). 37 ° C 배양기에서 48 ~ 72 시간 동안 공동 문화. </li><li> 자기 섹션 2-3에 따라 MSC에 의한 면역 백혈구 (즉, CD14 + 세포)의 특정 인구 비드-선택합니다. 주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 백혈구 사이토 카인의 발현 프로필, 즉, 발현의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 수행 될 수있다 인터루킨 10와 같은 MSC들에 의해 변조. </li><li> 24 웰 플레이트 섹션 2-4에 따라 생성 된 동종 CD4 + T 세포를 CFSE 표지 된 추가 한 백혈구 완전 배지 (T 세포 밀도 250,000 세포 / ㎠) ml의 다양한 비율로 비드 선택된 MSC 유도 백혈구에 즉, 1:10, 1 : 5, 1 : 2, 1 : 1 비율 (셀로 셀). </li><li> CD4 + T 세포를 자극하기 위해, (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 28 공액 마이크로 비드를 추가 1. </li><li> 음성 대조군은 5 판00,000 CD4 + T 세포 / 웰로 24- 웰 플레이트 (T 세포 밀도 250,000 세포 / ㎠)에 단 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와; 양성 대조군을 위해, 추가로 (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 공액 마이크로 비드 (28)를 추가 / 웰의 CD4 + T 세포의 수를 동일한 도금 : 1이다. </li><li> 공동 배양 3 일째에, 플루오 레세 적합한 488 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 유세포 분석 (16)에 의해 (둥근 바닥 튜브에 배치) CFSE 표지 된 CD4 + T 세포의 증식을 평가. </li></ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+cells+of+mechanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Precursor cells of mechanocytes.</a> Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Yen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+cells+from+human+term+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent cells from human term placenta.</a> Stem Cells. 23, 3-9 (2005).</li>
<li>Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+cells+in+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.</a> Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).</li>
<li>Chang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-derived+multipotent+cells+exhibit+immunosuppressive+properties+that+are+enhanced+in+the+presence+of+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma.</a> Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).</li>
<li>Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+properties+of+human+adult+and+fetal+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).</li>
<li>Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMuul%2C+LM+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Chen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+immunomodulatory+monocytes+by+human+mesenchymal+stem+cell-derived+hepatocyte+growth+factor+through+ERK1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2.</a> J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).</li>
<li>Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOughton%2C+JA+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).</li>
<li>Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhelan%2C+MC+%22Curr+Protoc+Cytom%22">Curr Protoc Cytom</a>. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).</li>
<li>Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+capacity+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.</a> Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+treatment+of+steroid-resistant%2C+severe%2C+acute+graft-versus-host+disease%3A+a+phase+II+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study.</a> Lancet. 371, 1579-1586 (2008).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307, 1169-1177 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+inhibit+and+stimulate+mixed+lymphocyte+cultures+and+mitogenic+responses+independently+of+the+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.</a> Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+in+vitro+impairs+the+immunosuppressive+activity+of+mesenchymal+stem+cells+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells.</a> Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?</a> Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+accumulation+mediates+differentiation+capacity+alteration%2C+but+not+proliferative+decline%2C+in+senescent+human+fetal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).</li>
</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

점점 더 MSC의 면역 조절 특성이 이러한 줄기 세포의 다계통 용량보다 더 빠르게 임상 사용으로 전환되고 있습니다18-20. 따라서 MSC와 백혈구의 공동 배양 기술 및 면역 기능을 평가하기 위한 분석은 효과적인 치료 적용을 최적화하기 위해 이러한 특성과 관련된 특정 메커니즘을 추가로 설명하는 데 중요합니다. 
이러한 분석의 성공을 위한 가장 중요한 기술적 측면 중 하나는 적절한 PBMC 수를 갖는 것이며, 이는 헤파린화된 전혈 샘플의 시작 세포 수와 밀도 구배 분리 후 PBMC 순도에 따라 달라집니다(단계 1.3). 전혈과 밀도 구배 사이에 혼합되지 않도록 전혈을 밀도 구배에 조심스럽게 겹쳐 놓는 것은 적혈구와 혈소판을 배제하는 데 중요합니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 강력한 증식을 위해 이펙터 백혈구의 적절한 활성화가 필요하다는 것이며, 그렇지 않으면 억제를 식별하기 어렵습니다. 이는 순도뿐만 아니라 인간 백혈구 시작의 품질에 따라 달라지며, 이는 분석...

인간 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 몇 extramesodermal 계통 5뿐만 아니라, 뼈, 연골 및 지방 조직 1-4의 근축 중배엽 계통으로 분화 할 수 체세포 조상이다. 먼저 성인의 골수에서 분리,이 multilineage 조상은 지금 임상 응용 프로그램 9-12에 매우 의무 표시 강한 면역 특성을 보여, 예기치 않게, 많은 조직 6-8에서 발견되었다. 면역 효과에 관련된 자세한 메커니즘은 적극적으로 특정 질병의 실체에 효과적인 적용을 위해 연구되고있다. 면역을 평가하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이펙터 백혈구 증식 (13)의 억제에 대해 평가하는 것이다. 자극 또는 활성화되면 이러한 T 림프구 및 단핵구와 같은 대부분의 이펙터 백혈구는 비범 증식. 면역 기능이 평가 될 수있는 경우의 진압확산은 입증된다. 전통적으로, 이펙터 백혈구 증식 DNA에 [3 H] 티미 딘의 결합 검출에 의해 평가되었다. 그러나,이 방법은 복사 현상 및 후 처리의 이용에 상당한 관심 단점뿐만 아니라, 필요한 복잡한 장비를 갖는다. 세포 증식을 평가하기위한 비 방사능 분석이 있지만, 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 분석은 여러 유형의 세포를 포함하는 공동 배양 실험에 특히 유용하다 특정 세포 개체수의 식별을 허용하는 다른 이점을 갖는다. CFSE은 유세포 분석에 의해 평가 될 수 셀룰러 형광 염료이다. 세포 분열,이 휴대 라벨의 강도는 비례 적으로 감소된다; 이뿐만 아니라 전반적인 세​​포 증식의 판정을 가능하게 할뿐만 아니라 형광 DET 곤란해진다 전에 8 분할 최대 세포 분열 횟수에 평가를 허용요법 배경 신호에 대하여. 또한, 형광 CFSE의 안정성은 많은 세포가 14 개월까지 가시화 될 수있는 표지 된 세포를 생체 내 추적을 허용한다. 이 분석은 또한 이펙터 백혈구 또는 특정 집단의 면역 기능의 특정 유형을 평가하기 위해 변화 될 수의 자성 비드 표면 마커의 선택을 행함으로써 면역 백혈구 - 인터루킨 10 (IL-10)의 제조 CD14 + 단핵구 15를 MSC를 유발 이전에 또는 적절한 공동 배양 한 후 관심의 세포 집단. 우리 프로토콜 (흐름도가 도시는 (플로우 차트는도 1에 도시) 이펙터 백혈구에서 중간 엽 줄기 세포의 면역 조절 효과를 평가의 기본적인 분석 및 동종 CD4 + 이펙터 T 림프구에 MSC 유도 백혈구 면역 평가를위한 기본적인 분석의 변형을 설명 그림 4).

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AG</td><td>말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리를 위한 밀도 그랑ientVibrant</td></tr> <tr><td>CFDA-SE 세포 추적 키트(CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>V12883</td><td>세포 분열 검출용 세포 라벨</td></tr><tr><td>Phytoagglutininin(PHA)</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>인간 PBMC의 활성화</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/28</td><td>Life Technologies</td><td>111.32D</td><td>인간 T 림프구의 활성화, 예: CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, etc.</td></tr><tr><td>autoMACS&trade; 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>autoMACS&trade; 분리기</td><td>자기 기반 셀 분리기</td></tr><tr><td>autoMACS&reg; 열</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td>분리 열</td></tr><tr><td>CD14 마이크로비즈, 인간&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>PBMC CD4 마이크로비즈에서 CD14+ 인간 단핵구 및 대식세포의 긍정적인 선택을 위해</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>PBMC에서 CD4+ 인간 T 림프구의 양성 선택을 위해</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td>인간 PBMC/백혈구 배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM, 저포도당, 피루브산</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>인간 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>MSC 완전 배지</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15070-063</td><td>보충 PBMC/백혈구 및 MSC 완전 배지</td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td>에 대한 보충1<td>) Hyclone, MSC 배양용&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2) Life Technologies, 다른 모든 세포 (즉, PBMC, 특정 백혈구 집단)</td><td>1) SH30070.03M 2) MSC</td><td>in vitro 배양</td></tr><tr><td>24-웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>COR3524</td><td>Co-culture plate</td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>Ficoll-Paque PLUS 15 ml 원심분리기 튜브에 의한 전혈 분리 PBMCs 지원을</td></tr> 위한 10091-148 사전 테스트 로트<tr><td>;</td><td>Corning</td><td>430766</td><td>표지 및 표지되지 않은 세포 분획 수집</td></tr><tr><td>둥근 바닥 튜브</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>352008</td><td>유세포 분석을 위한 세포 수집</td></tr></tbody></table>

인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (mscs)의 평가

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

다계통 인간 중간엽 줄기세포(MSC)의 면역조절 특성은 광범위한 면역 관련 질병에 대한 임상적 사용과 매우 관련이 있는 것으로 보입니다. 관련된 메커니즘이 점점 더 밝혀지고 있으며, 이 기사에서는 effector 백혈구 증식 억제를 위한 분석을 통해 MSC 면역조절을 평가하는 기본 실험에 대해 설명합니다. 활성화를 나타내는 백혈구 증식은 여러 기술로 평가할 수 있으며, 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석을 통해 백혈구를 표지하기 위해 형광 세포 염료인 carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 방사능 없이 증식을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 발생한 세포 분열의 수를 평가할 수 있을 뿐만 아니라 증식하는 세포의 특정 집단 및 세포 내 사이토카인/인자 발현을 식별할 수 있습니다. 또한, MSC와 공동 배양하기 전에 단일 말초 혈액 단핵 세포 집단의 자기 비드 표면 마커 선택을 통해 효과기 백혈구의 특정 집단을 평가하도록 분석을 조정할 수 있습니다. 이 공동 배양 분석의 유연성은 MSC와 백혈구 간의 세포 상호 작용을 조사하는 데 유용합니다.

도 1은 실험의 전반적인 스키마를 나타내고,도 2는 위상차 도립 현미경으로 가시화로서 다양한 세포 배양 조건의 모양을 보여준다. PBMC를하고 백혈구가 작은 원형 비 부착 세포 반면 중간 엽 줄기 세포는 섬유 모세포, 스핀들 모양의 형태와 부착 세포이다. 이 두 형태 학적으로 상이한 세포 유형은 명확 공존 배양에서 볼 수있다. 시험의 끝에, PBMC를 (또는 leuckotyes)를 유세포위한 흡인 될 때 점착성 엽 줄기 세포가 우연히 평가 아무런 문제가 없을 것, (열악한 부착 또는 격렬한 흡인 탈락에, IE)에 포함되는 경우에도, 분석 이 세포 이후 PBMC / 백혈구 분획 CFSE으로 표시됩니다. 더 확산이없는 경우, CFSE 표지 세포에 대한 히스토그램 결과는 하나 매우 긍정적이고 날카로운 피크로 볼 수 있습니다; 활성화가 발생한 경우에는, 확산이 발현 된 B로서 명백 할 것이다손실 및 형광 강도의 왼쪽 시프트 (그림 3)와 Y 여러 개의 작은 봉우리....

인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 면역 특성은 임상 응용 프로그램에 대해 점점 더 관련이 나타납니다. 형광 염료 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 미리 염색 엽 줄기 세포 및 말초 혈 백혈구의 공존 배양 시스템을 사용하여, 우리는 이펙터 백혈구 증식 및 특정 부분 집단에 MSC의 면역의 시험 관내 평가를 설명한다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

본 실험의 전반적인 목표는 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)의 면역 조절 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 치료적 관련성이 있을 수 있는 과정인 인간 중간엽 줄기세포의 면역 조절에 관여하는 메커니즘을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작동 세포(effector cell)의 백혈구 증식 발생과 세포 분열 횟수를 모두 평가할 수 있어, 해당 절차가 효율적임을 입증할 수 있다는 점입니다.실험실 기술자가 PBMC를 분리하기 위해, 먼저 50 mL 원뿔형 튜브에 헤파린 처리된 전혈 샘플 25 mL와 PBS 25 mL를 넣고 희석합니다. 다음으로, 새로운 50 mL 튜브에 Ficoll-Paque 밀도 구배 용액 15 mL를 넣습니다. 그런 다음 튜브를 기울인 상태에서 희석된 세포 현탁액을 밀도 구배 층 위에 천천히 층을 이루도록 쌓습니다.주의를 기울이면 층이 섞이지 않습니다. 이 실험에서 가장 중요한 단계 중 하나는 밀도 구배를 흐트러뜨리지 않고 혈액을 층층이 쌓는 것입니다. 이는 분리된 PBMC의 고순도를 보장하고 적혈구 오염을 최소화하기 위함입니다.이제 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 세 개의 뚜렷한 층이 나타나야 합니다. 상단의 혈장층, 하단의 피콜(fial pack) 밀도 구배층, 그리고 그 사이의 얇은 PBMC 층입니다.PE 피펫을 사용하여 중간층(interphase layer)을 흡입하지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 그런 다음 10 mL 피펫을 사용하여 PBMC를 50 mL 원뿔형 튜브(conical tube)로 조심스럽게 옮깁니다. 세포를 20 mL의 PBS와 혼합한 후, 원심 분리하여 밀도 구배의 잔여물을 제거합니다.그런 다음 20 mL의 PBS로 펠릿을 다시 세척하여 혈소판을 제거합니다. 두 번째 펠릿을 1 × 10⁷ cells/mL 농도의 완전 백혈구 배지에 재현탁합니다. MSC-백혈구 공동 배양을 준비하기 위해, 완전 MSC 배지를 37 °C에서 30분 이내로 예열합니다.그 다음, 24웰 플레이트의 각 웰에 웰당 1 mL의 완전 MSC 배지와 함께 5 × 10⁴개의 MSC를 분주하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 80% 밀도(confluence)에 도달하도록 합니다. 다음 날 아침, 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 완전 백혈구 배지에 포함된 적절한 수의 CFSE 표지 PBMC를 MSC가 있는 웰에 추가합니다. MSC와 PBMC의 비율을 1:10으로 하여, 완전 백혈구 배지 1 mL당 10 µg의 PHA를 첨가해 세포를 활성화합니다.그 후 공동 배양 3일째와 5일째에 적절한 수의 공동 배양물을 라운드 바텀 팩스 튜브(round bottom fax tubes)로 옮기고, 유세포 분석을 통해 CFSE로 표지된 백혈구의 증식 정도를 평가하여 작동 세포 억제 분석(effector suppression assay)을 수행합니다. 앞서 시연한 것과 같이 pBMC 2.5 × 10⁶개를 MSC 250,000개와 함께 공동 배양하여 MSC-pBMC 공동 배양을 설정하는 것으로 시작하십시오. 이는 하위 집단 선택을 위한 충분한 MSC 공동 배양 pBMC를 확보하기 위함입니다.37°C에서 48~72시간 배양 후, 적절한 자기 비드를 사용하여 관심 있는 MSC 유도 면역조절 백혈구를 선택합니다. 그런 다음, 다양한 실험 비율에 따라 웰당 1 mL의 완전 백혈구 배지에 CFSE 표지된 동종 CD4 양성 T 세포를 추가합니다. 다음으로, CD4 양성 T 세포를 자극하기 위해 anti-CD3/28 접합 마이크로비드를 B 세포 대 세포 비율 1:1로 추가합니다.공동 배양 3일 차에 유세포 분석법으로 CFSE 표지된 CD4 양성 T 세포의 증식을 평가합니다. MSC는 섬유아세포 모양의 방추형 형태를 가진 부착성 세포입니다. 반면 PBMC와 백혈구는 작고 둥근 비부착성 세포이므로, 이 두 세포 집단을 명확하게 구분할 수 있습니다. 공동 배양 시, 세포가 활성화되었으나 증식이 일어나지 않은 경우 CFSE 표지 세포는 하나의 매우 강한 양성 반응을 보이는 날카로운 형광 피크로 관찰됩니다.증식이 억제되면 형광 강도가 감소하고 왼쪽으로 이동하며 여러 개의 작은 피크로 나타납니다. 예를 들어, MSC 공배양 시, 이펙터 억제 분석(effector suppression assay)에서 비분열 세포를 나타내는 가장 오른쪽 피크가 더 날카로워지고 피크가 오른쪽으로 이동하며 형광 강도가 수반되어 증가함에 따라 여러 개의 작은 피크 수가 감소합니다. CD4 양성 T 세포 증식에 대한 MSC의 억제 효과는 용량 의존적 방식으로 추가 평가할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후에는 인간 중간엽 줄기세포의 면역 조절 능력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 인간 세포를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로 항상 주의 사항을 준수해야 함을 잊지 마십시오.

assessment-immunomodulatory-properties-human-mesenchymal-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 중간엽 줄기세포(MSC)가 effector T 세포 증식에 미치는 면역조절 영향을 조사하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 이 분석에는 MSC와 PBMC를 공동 배양하여 단핵구 집단이 면역조절 표현형을 획득하도록 유도하여 인터루킨-10(IL-10)의 분비를 유도하는 것이 포함됩니다. 활성화된 CD4+ T 세포를 배양한 후, 유도된 단핵구는 T 세포 증식을 효과적으로 억제합니다.

백혈구 증식에 대한 단핵구의 면역조절 효과를 평가하기 위한 체외 분석

여기에서는 인간 골수(hBM)에서 중배엽 전구 세포(MPC)를 분리하기 위한 최적화되고 재현성이 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. MPC는 유세포 분석과 nestin 발현을 특징으로 했습니다. 그들은 혈관 형성 잠재력을 유지하면서 기하급수적으로 증가하는 MSC와 같은 세포 배양을 일으킬 수 있는 능력을 보여주었습니다.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

중간엽 줄기세포/기질세포(MSC)의 치료 가능성은 잘 문서화되어 있지만, 환자를 위해 세포를 준비하는 가장 좋은 방법은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 여기에서는 실험 및 임상 적용을 위해 이종이 없는 조건에서 프라이밍된 MSC의 치료용 구형 응집체 또는 '스페로이드'를 효율적으로 생성하고 관리하기 위한 프로토콜을 전달합니다.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

장 염증의 모델에서 murine 연구 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 작은 비율 (1 ~ 5%) 또는 정 맥 주입 intraperitoneally 집 염증이 콜론과1,2에 설명 했다. 이 연구는 MSCs의 초음파 유도 intracardiac 주사 소장을 증가 지역화 될 보여줍니다.

초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.

대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

학습하세요 인간 중간 엽 줄기 세포(MSCs)의 면역 조절 특성을 공동 배양 시스템과 CFSE 표지를 활용하여 평가하는 방법을. 이 기술은 백혈구 증식과 면역 반응 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

더 많은 동영상 탐색