인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

본 실험의 전반적인 목표는 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)의 면역 조절 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 치료적 관련성이 있을 수 있는 과정인 인간 중간엽 줄기세포의 면역 조절에 관여하는 메커니즘을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작동 세포(effector cell)의 백혈구 증식 발생과 세포 분열 횟수를 모두 평가할 수 있어, 해당 절차가 효율적임을 입증할 수 있다는 점입니다.

실험실 기술자가 PBMC를 분리하기 위해, 먼저 50 mL 원뿔형 튜브에 헤파린 처리된 전혈 샘플 25 mL와 PBS 25 mL를 넣고 희석합니다. 다음으로, 새로운 50 mL 튜브에 Ficoll-Paque 밀도 구배 용액 15 mL를 넣습니다. 그런 다음 튜브를 기울인 상태에서 희석된 세포 현탁액을 밀도 구배 층 위에 천천히 층을 이루도록 쌓습니다.

주의를 기울이면 층이 섞이지 않습니다. 이 실험에서 가장 중요한 단계 중 하나는 밀도 구배를 흐트러뜨리지 않고 혈액을 층층이 쌓는 것입니다. 이는 분리된 PBMC의 고순도를 보장하고 적혈구 오염을 최소화하기 위함입니다.

이제 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 세 개의 뚜렷한 층이 나타나야 합니다. 상단의 혈장층, 하단의 피콜(fial pack) 밀도 구배층, 그리고 그 사이의 얇은 PBMC 층입니다.

PE 피펫을 사용하여 중간층(interphase layer)을 흡입하지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 그런 다음 10 mL 피펫을 사용하여 PBMC를 50 mL 원뿔형 튜브(conical tube)로 조심스럽게 옮깁니다. 세포를 20 mL의 PBS와 혼합한 후, 원심 분리하여 밀도 구배의 잔여물을 제거합니다.

그런 다음 20 mL의 PBS로 펠릿을 다시 세척하여 혈소판을 제거합니다. 두 번째 펠릿을 1 × 10⁷ cells/mL 농도의 완전 백혈구 배지에 재현탁합니다. MSC-백혈구 공동 배양을 준비하기 위해, 완전 MSC 배지를 37 °C에서 30분 이내로 예열합니다.

그 다음, 24웰 플레이트의 각 웰에 웰당 1 mL의 완전 MSC 배지와 함께 5 × 10⁴개의 MSC를 분주하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 80% 밀도(confluence)에 도달하도록 합니다. 다음 날 아침, 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 완전 백혈구 배지에 포함된 적절한 수의 CFSE 표지 PBMC를 MSC가 있는 웰에 추가합니다. MSC와 PBMC의 비율을 1:10으로 하여, 완전 백혈구 배지 1 mL당 10 µg의 PHA를 첨가해 세포를 활성화합니다.

그 후 공동 배양 3일째와 5일째에 적절한 수의 공동 배양물을 라운드 바텀 팩스 튜브(round bottom fax tubes)로 옮기고, 유세포 분석을 통해 CFSE로 표지된 백혈구의 증식 정도를 평가하여 작동 세포 억제 분석(effector suppression assay)을 수행합니다. 앞서 시연한 것과 같이 pBMC 2.5 × 10⁶개를 MSC 250,000개와 함께 공동 배양하여 MSC-pBMC 공동 배양을 설정하는 것으로 시작하십시오. 이는 하위 집단 선택을 위한 충분한 MSC 공동 배양 pBMC를 확보하기 위함입니다.

37°C에서 48~72시간 배양 후, 적절한 자기 비드를 사용하여 관심 있는 MSC 유도 면역조절 백혈구를 선택합니다. 그런 다음, 다양한 실험 비율에 따라 웰당 1 mL의 완전 백혈구 배지에 CFSE 표지된 동종 CD4 양성 T 세포를 추가합니다. 다음으로, CD4 양성 T 세포를 자극하기 위해 anti-CD3/28 접합 마이크로비드를 B 세포 대 세포 비율 1:1로 추가합니다.

공동 배양 3일 차에 유세포 분석법으로 CFSE 표지된 CD4 양성 T 세포의 증식을 평가합니다. MSC는 섬유아세포 모양의 방추형 형태를 가진 부착성 세포입니다. 반면 PBMC와 백혈구는 작고 둥근 비부착성 세포이므로, 이 두 세포 집단을 명확하게 구분할 수 있습니다. 공동 배양 시, 세포가 활성화되었으나 증식이 일어나지 않은 경우 CFSE 표지 세포는 하나의 매우 강한 양성 반응을 보이는 날카로운 형광 피크로 관찰됩니다.

증식이 억제되면 형광 강도가 감소하고 왼쪽으로 이동하며 여러 개의 작은 피크로 나타납니다. 예를 들어, MSC 공배양 시, 이펙터 억제 분석(effector suppression assay)에서 비분열 세포를 나타내는 가장 오른쪽 피크가 더 날카로워지고 피크가 오른쪽으로 이동하며 형광 강도가 수반되어 증가함에 따라 여러 개의 작은 피크 수가 감소합니다. CD4 양성 T 세포 증식에 대한 MSC의 억제 효과는 용량 의존적 방식으로 추가 평가할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 인간 중간엽 줄기세포의 면역 조절 능력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 인간 세포를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로 항상 주의 사항을 준수해야 함을 잊지 마십시오.