형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

이 절차의 전반적인 목표는 유전자 특이적 형광 나노입자를 적용하여 살아있는 세포 내에서 세포 내 유전자 발현을 직접 분석하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자에서 적절한 표적 서열을 정의함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 특정 캡처 및 리포터 가닥을 가진 나노입자를 제조하는 것입니다.

다음으로, 나노입자를 살아있는 세포의 배양 배지에 직접 첨가합니다. 마지막 단계는 습윤한 환경의 37°C, 5% CO2 조건에서 세포를 나노입자와 함께 밤새 배양하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 살아있는 표적 세포 내의 유전자 특이적 형광을 시각화하고, 유세포 분석을 통해 형광 세포의 수를 정량화합니다.

이 기술이 면역조직화학, 분자 비콘 또는 PCR 분석과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 세포 배양의 어떠한 조작 없이도 살아있는 세포 내의 유전자 발현을 시각적으로 관찰할 수 있다는 점입니다. 절차 시연은 저희 실험실의 생물학자이자 박사 과정 학생인 Martina Teresa와 유세포 분석을 담당할 Lynette Henkel이 진행하겠습니다. 표적 서열을 결정한 후, 상용 판매처에서 동결건조된 금 나노입자를 주문하십시오.

이 입자들은 포획 가닥(capture strand)이 공유 결합으로 연결된 중앙의 금 입자로 구성되며, 이 포획 가닥은 리포터 가닥(reporter strand)과 결합되어 있습니다. 표적 mRNA가 포획 가닥에 결합하면, 리포터 가닥과 이에 연결된 형광체가 용액 속으로 방출되어 Fluor four가 형광을 발하게 됩니다. 재구성 전 상태입니다.

나노입자는 골판지 상자에 넣어 4°C의 암소에 보관해야 합니다. 금 나노입자를 재구성하려면 20 µL의 2중 증류수를 첨가하여 최종 농도가 100 nM이 되도록 합니다. 재구성된 나노입자는 실온의 암소에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다.

처리 당일에 금 나노입자 스톡 용액을 PBS로 희석하여 20배 농도의 작업 용액으로 만듭니다. HEK 2 93 세포가 들어 있는 24-웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 꺼내 배지를 제거한 후, 신선한 배양액 237.5 µL를 추가합니다. 그런 다음 준비된 각 웰에 나노입자 작업 용액 12.5 µL를 피펫으로 넣고 플레이트를 흔들어 나노입자가 고르게 분포되도록 합니다. 습윤 상태의 37 °C, 5% CO2 환경에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날.

유세포 분석을 위한 세포 준비를 위해, 표준 형광 현미경을 사용하여 유전자 특이적 사이트 3 형광에 대한 세포 배양물을 분석하십시오. 사이트 3 유도 형광을 나타내는 HEK 2 9 3 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 0.05% trypsin EDTA 1 mL를 첨가한 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 3분 동안 세포를 배양하십시오. 배양 후, CO 배지 0.5 mL를 첨가하고 피펫으로 상하 혼합하십시오.

그 다음 세포를 15 mL 튜브로 옮깁니다. 배양액 3 mL를 추가하고 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이어서 상층액을 제거하고 세포를 얼음처럼 차가운 FACS 버퍼 200 µL에 재현탁합니다. 세포를 1.5 mL 튜브로 옮겨 분석 전까지 암소의 얼음 위에 보관합니다.

유세포 분석 전, 세포 응집을 방지하기 위해 세포를 30 µm 필터에 통과시킵니다. 그런 다음 propidium iodide를 최종 농도가 2 µg/mL가 되도록 세포에 첨가하고 최소 2분 동안 반응시킨 후, 세포를 유세포 분석기로 가져가 샘플 튜브를 장치에 장착합니다. SI3 양성 세포를 검출합니다.

처리되지 않은 대조군 세포를 사용하여 전방 산란광(forward scatter) 또는 FSC area 대 측방 산란광(side scatter) 또는 SSC area 서브셋, FSC height 대 FSC width 서브셋, 그리고 SSC height 대 SSC width 서브셋에 계층적 게이트를 설정하여 세포 파편과 비특이적 산란 세포를 제외합니다. PE 채널을 PE Texas Red 채널에 대해 표시하여 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide) 염색을 기반으로 죽은 세포를 분석에서 제거한 다음, site three PE 양성 세포에 대해 최종 소팅 게이트를 수행합니다. GA dh 검출.

실험적 타당성을 검증하기 위해 HEK 293 세포에서 상시 발현되는 하우스키핑 유전자를 사용하였습니다. 스크램블 음성 대조군 나노입자는 형광이 거의 또는 전혀 나타나지 않는 반면, 양성 흡수군은 영구적인 형광을 나타냅니다. 대조군은 하룻밤 동안 배양 후 강한 신호를 보입니다.

이 나노입자들은 인간 및 돼지 유도만능줄기세포(iPSCs 또는 IPCs)에서 만능줄기세포 마커인 nano 및 GDF3 유전자 발현을 특이적으로 검출하는 것으로 나타났습니다. 중요한 점은, 이러한 마커들이 IPCs에서만 검출되었으며, iPS 세포 배양 중 피더층(feeder layer)으로 사용된 섬유아세포에서는 검출되지 않았다는 것입니다. 0에서 1000까지 농도별로 구분된 GA DH 나노입자의 표지 효율을 평가하기 위해 시각적 분석과 유세포 분석을 통한 정량적 분석이 모두 사용되었습니다.

PICO molar 실험을 HEK 2 93 세포를 대상으로 수행하였으며, 그 결과 형광 강도가 농도에 따라 뚜렷하게 증가하는 것이 확인되었습니다. 이후 마우스 배아 줄기 세포에서 정량 분석을 수행한 결과, 400 PICOMOLAR GA DH 나노입자를 처리했을 때 약 40%의 세포가 CY three 양성으로 나타났습니다. 다능성 마커에서도 이와 유사한 수치가 얻어졌습니다.

나노 및 GDF 3 단계를 숙달하면, 적절히 수행했을 때 이 기술을 16시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 내에서 유전자 특이적 나노입자로 세포 내 유전자 발현을 직접 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.