형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

이 절차의 전반적인 목표는 유전자 특이적 형광 나노 입자의 적용을 통해 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현을 직접 분석하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자에서 적절한 표적 염기서열을 정의함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 특정 포획 및 리포터 가닥을 가진 나노 입자를 제조하는 것입니다.

다음으로, 나노 입자를 살아있는 세포의 배양 배지에 직접 첨가합니다. 마지막 단계는 가습 분위기에서 섭씨 37도, CO2 5%에서 하룻밤 동안 나노 입자가 있는 세포를 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경 검사는 살아있는 표적 세포에서 유전자 특이적 형광을 시각화하는 데 사용되며, 유세포 분석은 형광 세포의 수를 정량화하는 데 사용됩니다.

면역조직화학(immunohistochemistry), 분자 비콘(molecular beacons) 또는 PCR 분석과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 세포 배양을 조작하지 않고도 살아있는 세포에서 유전자 발현을 시각적으로 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 생물학자이자 우리 실험실의 박사 과정 학생인 Martina Teresa인 Lynette Henkel이 유세포 분석을 위해 시연할 것입니다. 표적 염기서열을 결정한 후, 상업적으로 이용 가능한 공급원에서 동결건조된 금 나노입자를 주문합니다.

이러한 입자는 포획 가닥에 공유 연결된 중앙 금 입자로 구성되며, 이 입자는 리포터 가닥에 결합됩니다. 타겟 mRNA가 포획 가닥에 결합하면 리포터 가닥과 연결된 형광단이 용액으로 방출되어 Fluor four가 형광을 방출할 수 있습니다. 재구성 전.

나노 입자는 판지 상자에 넣어 어둠 속에서 섭씨 4도에서 보관해야 합니다. 금 나노 입자를 재구성하기 위해 20 마이크로 리터의 이중 증류수를 첨가하여 최종 농도가 100 나노 어금니가됩니다. 재구성된 나노입자는 실온에서 암흑 속에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다.

적용 당일, 금 나노 입자의 원액을 PBS의 20 x 작업 용액으로 희석하고, 세포 배양 인큐베이터에서 HEK 2 93 세포를 포함하는 24 웰 플레이트를 제거하고, 배지를 흡인 한 다음 237.5 마이크로 리터의 신선한 배양 배지를 첨가 한 다음 나노 입자의 작업 용액 12.5 마이크로 리터를 준비된 각 웰에 피펫팅하고 플레이트를 소용돌이 시켜 나노 입자의 균일 한 분포를 보장한다. 가습된 분위기에서 섭씨 37도, 5%CO2에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날.

유세포 분석을 위해 세포를 준비하기 위해 표준 형광 현미경을 사용하여 유전자 특이적 부위 3 형광에 대한 세포 배양을 분석합니다. PBS로 3면 유도 형광을 표시하는 HEK 2, 9, 3 셀을 PBS로 한 번 세척하고 0.05% 트립신 EDTA 1밀리리터를 첨가하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 0.5 밀리리터의 CO 배지와 피펫을 위아래로 첨가합니다.

그런 다음 세포를 15ml 튜브로 옮깁니다. 3 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 300 회 G.Next에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 세이트를 제거하고 200 마이크로 리터의 얼음 차가운 팩스 버퍼에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 1.5ml 튜브로 옮기고 분석할 때까지 어두운 곳에서 얼음 위에 보관합니다.

팩스 분석 전에 30마이크로미터 필터를 통해 셀을 통과시켜 셀 응집을 방지합니다. 그런 다음 최소 2분 동안 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도로 프로피듐 요오드화물을 세포에 첨가하고 세포를 유세포 분석기 와류로 가져온 다음 샘플 튜브를 장치에 로드합니다. SI 3 개의 양성 세포를 검출합니다.

처리되지 않은 대조 세포를 사용하여 전방 산란 또는 FSC 영역 대 측면 산란 또는 SSC 영역 부분 집합의 계층 게이트, FSC 높이 대 FSC(하위 집합 포함) 및 SSE 높이 대 SSE(부분 집합 포함)의 계층 게이트를 설정하여 세포 파편 및 uns 산란 세포를 제외합니다. PE Texas Red Channel에 대해 PE 채널을 표시하여 propidium iodide 염색을 기반으로 한 분석에서 dead cell을 제거한 다음 현장에서 3개의 PE positive cells를 최종 분류 게이트를 수행합니다. GA dh의 감지.

실험적 타당성을 검증하기 위해 HEK 2 93 세포에서 구성적으로 발현된 하우스키핑 유전자를 수행했습니다. 스크램블 음성 대조군 나노 입자는 형광이 거의 또는 전혀 나타나지 않는 반면 영구적으로 형광 양성 흡수를 나타냅니다. 컨트롤은 하룻밤 배양 후 강한 신호를 보여줍니다.

이러한 나노 입자는 인간 및 돼지 유도 만능 줄기 세포 또는 IPC를 미러링할 때 만능 줄기 세포 마커, 나노 및 GDF 3 유전자 발현을 특이적으로 검출하는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은 이러한 마커가 IPC에서만 검출되고 IPS 세포 배양 중 공급층 역할을 하는 섬유아세포 세포에서는 검출되지 않았다는 것입니다. 유세포 분석을 통한 시각적 및 정량 분석을 모두 사용하여 0에서 1000까지의 나노 입자 등급 판의 GA DH 나노 입자의 라벨링 효율을 평가했습니다.

PICO 어금니는 HEK 2 93 세포로 수행되었으며, 이는 형광의 농도에 따른 명확한 증가를 보여주었습니다. 그런 다음 쥐 배아 줄기 세포에서 정량 분석을 수행했으며, 400 PICOMOLAR GA DH 나노 입자 에디션에 따라 약 40 % CY 3 양성 세포를 보여주었습니다. 다능성 마커에 대해서도 유사한 값이 얻어졌습니다.

나노와 GDF 3 한 번 마스터했습니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 16시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 현미경 검사를 통해 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현을 직접 검출하기 위해 유전자 특이적 나노 입자를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.