상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

이 절차의 전반적인 목표는 무세포 3차원 설치류 신장 세포 외 기질 골격을 인간 신장 상피 세포로 재증식하는 것입니다. 이것은 먼저 26시간 동안 신장 동맥을 통해 관류되는 일련의 세제 용액이 있는 호쥐 신장인 탈세포화에 의해 수행됩니다. 그런 다음 신장을 멸균하고 무세포 신장 세포외 기질 골격에 4,000만 개의 인간 신장 피질 세뇨관 상피 또는 RCTE 세포를 맞춤형으로 설계된 Biore 반응기 시스템 내에서 지속적인 전행성 동맥 관류로 주입합니다.

궁극적으로, RCTE 세포가 신장 골격을 다시 증식시키는 능력은 ER과 관류 분석 및 면역조직화학 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 이 3D 세포 배양 기술을 통해 연구자는 전체 장기 세포 외 기질을 다시 증식할 수 있습니다. 골격 세포는 세포 외 기질 내의 세뇨관 주위 공간 내에 증착되어 세포 성장, 분화 및 성숙에 영향을 미치는 조사 및 결합 인자를 조사할 수 있습니다.

합성 고분자 골격 제작과 같은 대체 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 신장 세포 외 기질이 자연 구조 단백질, 성장 인자 및 기타 생물학적 구성 요소의 복잡한 네트워크 내에서 관류된 세포의 접착, 증식 및 성숙을 촉진한다는 것입니다. 해동된 각 신장의 신장 동맥 카테터를 펌프에서 다운스트림의 관류 회로 튜브 끝에 연결하여 카테터에 기포가 갇히지 않도록 하여 탈세포화 절차를 시작합니다. 카테터에 기포가 있는 경우 200마이크로리터 마이크로 피펫을 사용하여 기포를 빼내고 카테터에 액체를 채웁니다.

신장 동맥이 꼬이거나 꼬이지 않도록 빈 5리터 비이커의 내벽을 따라 신장을 매달고 펌프 구동을 분당 5밀리리터로 조정합니다. 그런 다음 각 신장이 관류되고 있는지 확인한 후 시작을 눌러 장기 바닥과 각 신장에서 용액이 떨어지는 것을 관찰하고 관류 끝에 있는 순서도에 지정된 대로 적절한 용액을 사용하여 PBS의 탈세포화된 신장을 섭씨 4도 또는 최대 2도의 50ml 원추형 튜브에 저장합니다. 관류 회로를 조립한 후 생물 반응기 헤드의 빨간색 나사 캡을 제거하고 개구부를 통해 아세트산 당 0.1 %, 4 % 에탄올 용액 50 밀리리터를 피펫으로 주입합니다.

대형 펌프 카트리지를 사용하여 연동 펌프 튜브 세그먼트를 펌프 헤드에 연결합니다. 그런 다음 유속을 분당 5밀리리터로 조정합니다. 시작을 누르고 액체가 풍량 라인을 채우고 3방향 정지 코크의 나머지 열린 포트에 도달할 때 회로가 프라이밍되도록 합니다.

수 루어 플러그를 사용하여 포트를 연결하십시오. 관류 회로 튜브 또는 입구 내부에서 공기가 관찰되지 않을 때까지 회로가 완전히 프라이밍되도록 합니다. 루어 어셉터는 펌프의 유량을 일시적으로 증가시켜 관류 회로에서 기포를 배출합니다.

시스템이 완전히 프라이밍되면 펌프 드라이브를 중지하고 6인치 겸자를 살균합니다. 신장 동맥 카테터의 암 루어 끝을 남성 입구에 조심스럽게 삽입하려면 생물 반응기 헤드의 내부 표면에 수용체를 루어하여 연결이 단단히 되어 있고 카테터에 공기가 남아 있지 않은지 확인합니다. 신장이 신장 동맥 카테터에 부드럽게 매달려 신장 동맥이 뒤틀리거나 꼬이지 않도록 합니다.

그런 다음 생물 반응기 저장소가 단단히 밀봉되도록 생물 반응기 헤드와 몸체를 함께 고정하는 금속 클램프를 조이고 나사 캡을 닫습니다. 이제 아세트산 당 에탄올 용액을 분당 5 밀리리터로 실온 관류하여 신장을 살균합니다. 1시간 후 펌프를 멈추고 빨간색 나사 캡을 엽니다.

멸균 해충을 사용하여 피펫은 생물반응기 저장소에서 모든 용액을 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음 50ml의 새 PBS를 생물반응기 저장소에 피펫팅합니다. 나사 캡을 닫고 펌프를 시작하여 실온에서 분당 5밀리리터로 1시간 동안 3회 순차적으로 관류합니다.

최종 PBS 헹굼 후 저장소에서 식염수를 흡인하고 나사 캡을 닫은 상태에서 저장소에 50ml의 배지를 추가합니다. 관류 회로가 부착된 생물 반응기를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 대용량 인큐베이터로 옮깁니다. 그런 다음 생물반응기 관류 회로를 펌프에 연결하고 파종 전 최소 1시간 동안 분당 4밀리리터로 신장을 관류합니다.

세포화하기 위해 신장은 원하는 자리 집중을 위해 충분한 수의 배양 플라스크를 수집합니다. 다음으로, 각 플라스크에서 배양 배지를 흡인 한 후 적절한 세포 해리 효소 10ml를 사용하여 섭씨 37도의 플라스크에서 신장 피질 세뇨관 상피 세포를 들어 올립니다. 10분 후, 접힘 박리가 관찰될 때까지 2분마다 안면 조영 현미경으로 플라스크를 점검하기 시작합니다.

그런 다음 계수를 위해 소량의 세포 분취액을 취한 후 관련 세포 현탁액을 동일한 부피의 premed 배지로 희석하고 세포를 원심분리합니다. 적절한 부피의 배양 배지로 펠릿을 현탁시켜 밀리리터당 7번째 세포의 2배 10의 최종 농도를 얻습니다. 2밀리리터의 시트 서스펜션과 35mm 배양 접시를 옮긴 다음 2밀리리터 부피를 멸균 5밀리리터 주사기에 넣습니다.

관류 생물 반응기를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 스톱 콕 밸브를 돌려 착석 포트로의 흐름을 닫습니다. 수 루어 슬립을 제거하고 스톱 콕에서 플러그를 꽂고 주사기를 연결합니다. 그런 다음 관류 회로를 인큐베이터로 빠르게 다시 옮기고 대형 펌프 카트리지를 사용하여 연동 펌프 튜빙 세그먼트를 펌프 헤드에 고정하여 세포를 장착합니다.

펌프를 가리키는 스톱 콕 밸브 포트를 닫고 세포를 신장 골격에 천천히 주입합니다. 그런 다음 스톱콕 밸브를 돌려 주사기의 흐름을 차단하고 분당 25밀리리터로 펌프를 시작합니다. 15분 후 펌프 유량을 분당 4밀리리터로 낮추고 다음 날과 그 후 이틀에 한 번씩 매체를 교체합니다.

세포의 생존력과 증식을 평가하기 위해, 정확히 1시간 후에 신장 지지체를 분당 4ml의 관류를 위해 배양 배지를 10ml의 자린 작업 용액과 교환하고, 조건화 및 부분적으로 감소된 자린 용액을 수집하고 다시 분당 4mL 관류를 수행합니다. 100ml의 신선한 배양액을 통해 물과 묽은 세제 용액으로 순차적으로 주입된 중간 신장은 최종 세제 관류, 신장 혈관 네트워크, 특히 inter lober 혈관이 탈세포화된 골격에서 두드러지게 표시됩니다. 전체 장기에서 고유 세포가 제거되어 사구체 세뇨관과 수집 관의 손상되지 않은 기저막 네트워크와 탈세포화된 혈관의 세포 외 기질

더 큰 혈관 외에도 사구체 내의 미세혈관 기저막은 구조적 무결성을 유지합니다. 신장 골격에 파종된 RCTE 세포는 주로 신장 골격의 피질 부위에 서식하는 것으로 나타났으며, 여기서 그들은 우선적으로 송골 사구체 세뇨관을 다시 증식합니다. 파종 후 1일째에는 사구체 내에 삽입되는 세포가 거의 없으며, 7일째가 되면 사구체에는 세포가 거의 없는 반면 이러한 세포의 대다수는 신장 세포외 기질의 피질 영역을 차지합니다.

7일간의 전(前) 관류 배양 후, 많은 RCTE 라인 세뇨관이 외부 수질 및 유두 세뇨관에 존재하며 RCTE 세포 재증식 및 1주일의 관류 배양 후 오리를 수집합니다. 그러나 탈세포화(decellularization) 이후 관찰된 투명도는 사라지고 화된 신장은 불투명하고 원래 상태에 더 가깝게 보입니다. 이 절차에 따라 컨디셔닝 배양 배지의 면역화학적 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 세포의 대사 또는 표현형 상태가 신장 세포외 기질 내에서 어떻게 변하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

세포외 골격을 개발하고 기질에 기증자 판매를 다시 추가할 수 있는 능력을 통해 연구자들은 자연 신장 엑소 매트릭스 골격 내에서 성장과 성숙을 3차원으로 묘사할 수 있습니다. 궁극적인 목표는 이 기술을 신장 복구 및 재생의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 도구로 사용하는 것입니다.