Name: 상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 쥐 신장의 세포 외 기질 비계를 제거하고 인간 상피 세포로 다시 채우는 방법을. 생체 반응기 내 관류 배양을 통해 신장 조직 공학 및 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 Zell Family Foundation의 지원에 감사드립니다. 우리는 노스웨스턴 메모리얼 재단 딕슨 중개 연구 보조금 이니셔티브(Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative), 미국 이식 외과 의사 협회(American Society of Transplant Surgeon)의 교수진 개발 보조금(Faculty Development Grant) 및 일리노이 국립 신장 재단(National Kidney Foundation of Illinois)의 젊은 연구자를 위한 연구 보조금의 지원을 인정합니다. 로버트 R. 맥코믹 재단(Robert R. McCormick Foundation)의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 또한 NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. 이미징 및 조직학 코어의 지원을 받았습니다.이 연구에 사용된 이미징 및 조직학 코어는 마우스 조직학 및 표현형 분석 실험실, 전자 프로브 계측 센터(EPIC) 및 노스웨스턴 대학의 Simpson Querrey Institute 장비 코어 및 암 센터 지원 보조금(NCI CA060553)의 지원을 받았습니다. 저자는 설치류 신장 조달을 위한 Northwestern University Microsurgery Core에 감사를 표하고 싶습니다. P30 CA118100에서 지원하는 Fluorescence Microscopy Shared Resource에서 수행된 재세포화 후 신장 세뇨관 상피 형태 평가.

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<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
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<li>Bonandrini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+well-preserved+acellular+kidney+scaffold+using+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells.</a> Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).</li>
<li>Burgkart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+kidney+matrix+for+perfused+bone+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods.2%22%5BJournal%5D)">Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).</li>
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<li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-purpose+bioreactors+to+monitor+non-invasive+physical+and+biochemical+markers+of+kidney+and+liver+scaffold+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
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<li>Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+from+human+autosomal+dominant+polycystic+kidney+cysts.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology.</a> Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).</li>
</ol>

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탈세 포화 기재된 프로토콜 일관 혈관 내피 세포 7,17 이외에 (근위 및 원위 세관 모두 유래) 인간 신피질 관상 상피 세포의 배양을위한 3 차원 템플릿 역할 완전히 무 세포 신장 ECM을 생성한다. 삽관 신장 맥관 따라서 관류 탈세 포화, 세포 시딩 장기 관류 배양하고, 레사 주린 관류 프로토콜을 가능하게 바이오 리액터 셋업 내의 지지체 걸쳐 시약 및 세포의 균일 한 전달을위한 주요 기능으로 기능한다. 이전에 장기 관류에 신장 동맥의 등, 적절한 삽관이 중요하고 특별한주의가 신장 동맥이 차단되거나 손상 및 카테터가 확보되어 있는지되지 않도록주의해야합니다으로. 혈관 내 혈전이 ㄱ 할 수 없기 때문에 신장이 회수되는 스프 라그 돌리 쥐 체계적으로, 장기 구매시 혈관 내 응고를 방지하기 위해 헤파린해야E는 제거하고, 신장의 전체 탈세 포화를 억제 할 수있다. recellularized 신장의 관류 및 배양 접종에 사용 관류 생물 반응기는 17</su...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/53271/epithelial-cell-repopulation-preparation-rodent-extracellular-matrix">Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development</a>.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.&#160; Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

말기 신부전을 앓고있는 환자의 수는 계속 증가 같이, 이식 가능한 도너 신장의 수가 증가하고 심각한 부족이있다. 후보자의 지속적 증가 수의 수요를 충족 할 수없는이 신장 이식을 위해 상장 기다립니다 수요 1, 2에 이식 신장 이식을 사용자 정의 개발하는 궁극적 인 목표와 신장 장기 공학 연구를 묻는 메시지가있다. 환자 자신의 세포에서 작동 신장 조직을 구축하면, 평생 면역 억제에 대한 필요성을 제거 환자 신장 이식을 기다리고 투석에 소요되는 시간을 감소시키고, 만성 신장 질환을 가진 더 많은 환자에 구명 이식을 연장한다. 환자 유래의 세포를 사용하여 신장 조직 생명 공학 첫 걸음 신장 실질위한지지 기판으로서 기능하는 지지체를 개발하는 것이다 (예를 들어 관형 epithelial), 기질 섬유 아세포, 혈관 세포 성장. 자연 장기 세포 외 기질 (ECM들)에서 유래 생체 재료 지지체는 천연 생체 조성를 포함한 조직 공학에 사용하기에 바람직 수있는 여러 가지 특성을 가지고; 적절한 거시 및 미세 생리 학적 기능을 부여하는 단계; 휴대 생체 적합성, 세포 부착, 이동, 3 개조 건설적인 조직을 홍보. 신장 조직 재생 용 지지체를 제조하는 유망한 방법은 신장 ECM (4)의 복합 천연 단백질 조성물의 대부분을 보존 기관의 고유의 구조적 복잡함을 유지하고, 상향식과 관련된 어려움을 극복 동종 또는 이종 신장의 탈세 포화를 통해 비계 recellularization 5 후 개발 세포에 혈관 공급을 제공함으로써 두께 cellularized 조직 공학입니다. 관류 탈세 포화는 과정에있다이는 세제, 효소, 또는 다른 세포 방해 솔루션은 균일 기관 (6)의 혈관 네트워크를 통해 전달됩니다. 이 전략은 폐기 인간의 신장 (9)에서 무 세포 신장 템플릿의 개발에 의해 입증, 전체 기관 공학 6-8 생물학적 템플릿 (3D) 입체로 무 세포 기관 기반의 ECM 발판을 유도 할 수있는 효율적인 프로세스로 설립되었습니다 대형 동물 (예 : 돼지 10, 염소 11)과 설치류 소스 (12)로부터 얻은 이종 신장. 특히, 설치류 등의 작은 동물 모델의 사용은 더 적은 세포 및 줄기 세포 유래의 조직의 경우와 같이, 세포 수는 일반적으로 제한되는 장기 recellularization 연구에 특히 유용 배지를 필요로한다. 탈세 포화 기재된 프로토콜의 목적은 신장 structur의 재생을 위해 3D 발판 시스템으로 사용할 수 무 세포 신장 ECM을 생성한다인간의 신장 피질 관 상피 (RCTE) 세포와 본 실시 예에 다시 채워되는 네프론의 세관을 포함, ES. 우리는 이전보다 빠르다 최적의 세제 기반 쥐의 신장 탈세 포화 프로토콜 (7), 이전에보고 된 다른 방법보다 (약 일)의 엄격한 평가를 설명 (로스 등 .- 오일 (12), 노래 등 .- 4.5 일 13), 및 앞서보고 12-15보다 탈세 포화 중에 변성제 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)의 상당히 낮은 농도 (0.1 %)로 장기를 공개한다. 연구의 제한된 수의 세포 다시 채우기위한 3D 발판으로 탈세 포화 이후 사용 쥐 신장의 사용을 설명했다 12-16 (다른 1 검토). 이 프로토콜에서는, 우리는 무 세포 신장 지지체를 제조하는 우리의 이전에 설립 된 최적의 탈세 포화 전략에 대한 자세한 설명을 제공스프 라그 돌리 쥐의 신장 7. 이중 파종 및 유지 보수 관류 문화 (17) 할 수있는 맞춤 디자인 관류 생물 반응기를 사용하여, 우리는 지속적으로 이러한 탈세 포화 행렬에 관 구성 요소를 다시 채울 증식하고, 주일 이상 관류 문화에서 살아 남기 인간 RCTE 세포와 무 세포 신장 발판을 recellularize. (17) 연구 이전에 세포 독성에 사용되는 비용이 들지 않는, 세포 독성, 비 침습적 대사 평가 - - 시간 7 위에 recellularized 신장 내 세포 생존 및 증식의 표시를 제공하기 위해 우리는 더 레사 주린 관류 분석의 우리의 사용을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, 단백질체학 등급, AMRESCO</td><td>VWR</td><td>M143-4L</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이트 용액, BioUltra, 분자 생물학용, H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>과아세트산 용액 20%, 푸럼, 아세트산(RT) 중 ~ 39%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240</td><td>Peracetic은 가연성이며 부식성입니다. 흄 후드 내에서 적절한 개인 보호 장비(예: 장갑, 고글)를 사용하여 준비하십시오.</td></tr><tr><td>200 proof 에탄올</td><td>VWR</td><td>V1001TP</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote, 유리 및 기타 표면 용 실리콘 화 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>생물 반응기 저장소 처리 용. 텍스트에서는 실리콘화 시약이라고 합니다.</td></tr><tr><td>DMEM/F12 매체</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, 100X 10,000 I.U. 페니실린 10,000 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express(1X), Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>텍스트에서 세포 해리 효소라고 합니다.</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>장비 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Masterflex L / S 디지털 드라이브, 600 RPM, 115/230 VAC</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>07519-05 및 -06 펌프 헤드 용 Masterflex L / S 대형 카트리지.</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-70</td><td>텍스트에서 대형 펌프 카트리지라고 합니다.</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 8채널, 4롤러 카트리지 펌프 헤드.</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-06</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 6" 표본 집게, 톱니 모양</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>*신장 관류 생물 반응기</td><td>WilMad Labglass</td><td>*맞춤형 디자인</td><td>생물 반응기는 WilMad Labglass에서 설명한 대로 생산됩니다. 설계는 이전 간행물에서 자세히 설명되었습니다.</td></tr><tr><td>관류 회로 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24G x 0.75인치 BD Vialon 생체 재료로 만든 BD Insyte Autoguard 차폐 IV 카테터(0.7mm x 19mm). 노치 바늘이 있습니다. (50/SP, 200/캘리포니아)</td><td>BD Biosciences</td><td>381412</td><td>텍스트에서 24 게이지 카테터로 언급됩니다.</td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT 튜빙, L/S #14, 25'Cole-Parmer</td><td></td> <td>HV-06508-14</td><td>텍스트에서 연동 펌프 튜빙이라고 합니다.</td></tr><tr><td>과산화물 경화 실리콘 튜브, 1/16" ID X 1/8" OD, 25피트/팩</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-06411-62</td><td>텍스트에서 1/16" ID 실리콘 고무 튜브라고 합니다.</td></tr><tr><td>Masterflex 백금 경화 실리콘 튜브, L/S 14, 25피트</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96410-14</td><td>텍스트에서 두꺼운 벽의 1/16" ID 실리콘 고무 튜브라고 합니다.</td></tr><tr><td>VWR 실리콘 튜브, 1/4" ID x 0.5" OD</td><td>VWR</td><td>89068-484</td><td></td></tr><tr><td>Acro 50 벤트 필터, Pall Life Sciences</td><td>VWR</td><td>28143-558</td><td>텍스트에서 0.2 미크론 벤트 필터라고 합니다.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer 어댑터, 1/8" ID의 남성 Luer Lock, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>T-45505-11</td><td>텍스트에서 1/8" 가시 어댑터에 대한 남성 Luer 잠금 장치라고 합니다.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer 액세서리, 남성 Luer 플러그, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-58</td><td></td></tr><tr><td>여성 루어 x 여성 루어 어댑터, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-22</td><td>텍스트에서 여성 Luer x 여성 Luer 어댑터라고 합니다.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer 액세서리, 여성 Luer Cap, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Smiths Medical 대형 보어 Hi-Flo 스톱콕 # MX4311L - 확장 남성 루어 잠금 장치가 있는 3-Way Hi-Flo 스톱콕, Non-DEHP 제형, 라텍스 프리(LF), 지질 저항성, Non-PVD, 50/cs</td><td>Careforde Healthcare</td><td>10254821</td><td>Smiths Medical(공급업체) 카탈로그 번호는 #MX4311L입니다.</td></tr><tr><td>기타 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok 일회용 주사기와 BD Luer-Lok&trade; 팁.</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Easy Grip Culture Dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td>세포 파종을 위해 세포 현탁액을 주사기로 끌어 당기는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

이 프로토콜은 무 세포, 장기 스케일 조직 개발 소규모 모델 기판으로서 유용하다 아직 biofunctional, 신장 세포 외 기질 (ECM) 비계의 발생 사항​​. 스프 라그 돌리 래트 신장이 손상으로 그대로, 전체 신장 골격을 유도하기 26 시간에 걸쳐 신장 동맥에 도관을 삽입하여 캐 뉼러와 저농도의 세제 (트리톤 X-100 및 소듐 도데 실 설페이트 (SDS))의 일련의 관류 관류 혈관, 사구체, 신장 세뇨관. 탈세 포화 후, 신장 지지체는 주문 설계된 관류 생물 반응기 용기 내부에 배치되고, 신장 동맥 카테터 이루어진 관류 회로에 연결되어 연동 펌프; 튜브; pH를, 용존 산소, 압력에 대한 옵션 프로브를. 아세트산 및 에탄올의 pH (7.4)를 분산과 발판 살균 후 신장 지지체는 내 larg의 배지로 관류 시드 제조전자 용량 CO 2 인큐베이터를 37 ℃로 유지하고 5 %. 천만 신피질 관상 상피 (RCTE) 세포 생리 레이트 흐름을 감소하기 전에 15 분 동안 고 유량 하에서 지지체 (25 ㎖ / 분) 압력 (~ 230 mmHg로)를 통해 신장 동맥을 통하여 주입, 급속 관류 (4 ㎖ / 분). RCTE 세포는 주로 신장 피질 내에서 관 ECM 틈새를 채우는 확산 및 관류 문화 7 일 동안 관 상피 구조를 형성한다. 배지에서 44 μM의 레사 주린 용액 중에 세뇨관 세포 생존 및 증식 형광, 레 독스 계 대사 평가를 제공하기 위해 교환 매질 중에 1 시간 동안 신장을 관류한다. 신장 관류 생물 반응기는 생화학 적 평가를 위해 매체의 비 침습적 샘플링을 허용하고, 여러 입구 포트는 신장 정맥 또는 요관을 통해 대안 역행 파종 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 신장과 골격을 recellularize하는데 사용될 수있다이 시스템 내에서 신속한 평가를위한 혈관 내피, 관 상피와 기질 섬유 아 세포를 포함한 세포 유형의 다양한.

신장 순차적 세제 용액을 물로 관류 희석 이전에 설정된 최적의 탈세 포화 프로토콜에 따라 (도 1a를 참조 B) (7)로, 26 시간에 걸쳐 점진적으로 더욱 투명하게 (트리톤 X-100, 0.1 % SDS 1 %) 도 2a에 도시. 그 결과 무 세포 신장 지지체는 세포의 결여이며, 관류 프로토콜 다음 손상되지 않은 그대로 신장 캡슐에 의해 지원 응집력 신장 ECM을 유지합니다. 최종 세제 관류 (SDS)에 의해, 신장의 혈관 네트워크는, 특히 interlobar 혈관이 눈에 띄게 네프론 세뇨관의 비교적 얇은 기저막 (상대 이러한 혈관의 큰 두께로 인하여, 탈세 포화 된 지지체에 표시되는 그림 2A, B)를 참조하십시오. 전체 기관은 사구체, 세관 및 COL의 손상 기저막 네트워크 뒤에 남겨두고, 기본 세포의 해제덕트 및 피질 interlobular 동맥의 내부와 외부 탄성 박판을 포함하여 탈세 포화 된 혈관의 ECM을...

이 프로토콜은 혈관 구조를 통한 세제의 사전 관류에 의한 Sprague Dawley 쥐 신장의 탈세포화를 설명하며, 인간 신장 상피 세포로 재증식하기 위한 템플릿 역할을 하는 무세포 신세포 외 기질을 생성합니다. 성장을 모니터링하기 위한 재세포화 및 레사주린 관류 분석법의 사용은 특별히 설계된 관류 생물반응기 내에서 수행됩니다.

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

이 절차의 전반적인 목표는 무세포 3차원 설치류 신장 세포외 기질 스캐폴드에 인간 신장 상피 세포를 재배양하는 것입니다. 이는 먼저 26시간 동안 신동맥을 통해 일련의 세제 용액을 관류시켜 털이 없는 쥐의 신장을 탈세포화함으로써 수행됩니다. 그 후 신장을 멸균하고, 맞춤 설계된 바이오리액터 시스템 내에서 지속적인 순행성 동맥 관류 하에 4,000만 개의 인간 신장 피질 세뇨관 상피 세포(RCTE cells)를 무세포 신장 세포외 기질 스캐폴드에 주입합니다.최종적으로, RCTE 세포가 신장 스캐폴드를 재정착시키는 능력은 ER 및 관류 분석과 면역조직화학 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 이 3D 세포 배양 기술을 통해 연구자는 전체 장기의 세포외 기질을 재정착시킬 수 있습니다. 스캐폴드 세포는 세포외 기질 내의 세뇨관 주변 공간에 배치되어 세포 성장, 분화 및 성숙에 영향을 미치는 결합 인자들에 대한 연구가 가능하도록 합니다.합성 고분자 지지체 제작과 같은 대체 방법보다 이 기술이 가지는 주요 장점은, 신장 세포외 기질이 천연 구조 단백질, 성장 인자 및 기타 생물학적 구성 요소로 이루어진 복잡한 네트워크 내에서 관류된 세포의 부착, 증식 및 성숙을 촉진한다는 점입니다. 해동된 각 신장의 신동맥 카테터를 펌프 하류의 관류 회로 튜브 끝에 연결하여 탈세포화 과정을 시작하되, 카테터 내에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 카테터에 기포가 있는 경우, 200 µL 마이크로 피펫을 사용하여 기포를 뽑아내고 카테터를 액체로 채우십시오.신동맥이 꼬이거나 말리지 않도록 빈 5L 비커의 내벽에 신장을 매달고, 펌프 구동 속도를 5mL/min으로 조절합니다. 그 다음, 장기 하단에서 용액이 떨어지는 것을 관찰하여 각 신장에 관류가 이루어지고 있음을 확인한 후 시작 버튼을 누릅니다. 관류 흐름도 끝부분에 지정된 적절한 용액들로 각 신장을 처리한 후, 탈세포화된 신장을 50mL 원뿔형 튜브의 PBS에 담아 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다. 관류 회로를 조립한 후, 바이오리액터 헤드의 빨간색 스크류 캡을 제거하고 개구부를 통해 0.1% 과초산 및 4% 에탄올 용액 50mL를 배지 저장조에 피펫팅합니다.대형 펌프 카트리지를 사용하여 연동 펌프 튜브 세그먼트를 펌프 헤드에 연결합니다. 그런 다음 유량을 분당 5mL로 조정합니다. 시작 버튼을 누르고 액체가 관류 라인을 채워 3방향 스톱콕의 나머지 개방된 포트에 도달할 때까지 회로를 프라이밍합니다.수컷 루어 플러그를 사용하여 포트를 막습니다. 관류 회로 튜브나 입구 내부에 공기가 보이지 않을 때까지 회로가 완전히 프라이밍되도록 기다립니다. 펌프의 유량을 일시적으로 높여 루어 어셉터로부터 관류 회로의 기포를 배출하십시오.시스템 프라이밍이 완료되면 펌프 구동을 중단하고 6인치 포셉을 멸균합니다. 신동맥 카테터의 암컷 루어 끝단(female lure end)을 바이오리액터 헤드의 내측 표면에 있는 수컷 입구 루어 어셉터(male inlet, lure acceptor)에 조심스럽게 연결하며, 연결 부위가 단단히 밀착되고 카테터 내에 공기가 남아 있지 않은지 확인합니다. 신동맥이 꼬이거나 꺾이지 않도록 신장이 신동맥 카테터에 부드럽게 매달려 있게 합니다.그런 다음 바이오리액터 헤드와 본체를 고정하는 금속 클램프를 조여 바이오리액터 저장조를 밀봉하고 스크류 캡을 닫습니다. 이제 과초산 에탄올 용액을 분당 5 mL의 속도로 상온에서 관류시켜 신장을 멸균합니다. 1시간 후, 펌프를 멈추고 빨간색 스크류 캡을 엽니다.멸균된 피펫을 사용하여 바이오리액터 저장조의 용액을 모두 조심스럽게 흡입합니다. 그 다음, 50 milliliters의 신선한 PBS를 바이오리액터 저장조에 피펫팅합니다. 스크류 캡을 닫고, 상온에서 5 milliliters per minute의 속도로 1시간씩 3회 연속으로 관류를 시작합니다.마지막 PBS 세척 후, 리저버에서 식염수를 흡입하여 제거하고 스크류 캡을 닫은 상태로 리저버에 50 milliliters의 배지를 추가합니다. 관류 회로가 연결된 바이오리액터를 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건의 대용량 인큐베이터로 옮깁니다. 그 다음 바이오리액터 관류 회로를 펌프에 연결하고, 세포 파종 전 최소 1시간 동안 4 milliliters per minute의 속도로 신장을 관류합니다.세포화를 위해, 원하는 도말 농도에 필요한 충분한 수의 배양 플라스크를 신장에서 수집합니다. 다음으로, 각 플라스크에서 배양액을 흡입하여 제거한 후, 37°C에서 10 mL의 적절한 세포 해리 효소를 사용하여 플라스크로부터 신장 피질 세뇨관 상피 세포를 떼어냅니다. 10분 후, 세포의 박리가 관찰될 때까지 2분마다 위상차 현미경으로 플라스크를 확인하기 시작합니다.그 다음, 세포 수 측정을 위해 소량의 세포 분액을 취한 후, 해당 세포 현탁액을 동일한 부피의 premed 배지로 희석하고 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 펠렛을 적절한 부피의 배양 배지로 재현탁하여 최종 농도가 2 × 10⁷ cells/mL가 되도록 합니다. 35 mm 배양 접시에 세포 현탁액 2 mL를 옮긴 후, 멸균된 5 mL 주사기로 해당 2 mL 부피를 흡입합니다.관류 바이오리액터를 생물안전작업대(BSC)로 옮기고 스톱콕 밸브를 돌려 시팅 포트(seating port)로 가는 흐름을 차단합니다. 스톱콕에서 수컷 루어 슬립 플러그를 제거하고 시린지를 연결합니다. 그런 다음 관류 회로를 신속하게 인큐베이터로 다시 옮기고, 대형 펌프 카트리지를 사용하여 연동 펌프 튜브 세그먼트를 펌프 헤드에 고정하여 세포를 안착시킵니다.펌프 방향을 향하는 스톱콕 밸브 포트를 닫고 세포를 신장 스캐폴드 내로 천천히 주입합니다. 그다음 스톱콕 밸브를 돌려 시린지로부터의 흐름을 차단하고 펌프를 25 milliliters per minute로 가동합니다. 15분 후, 펌프 유량을 4 milliliters per minute로 낮추고, 다음 날부터 2일 간격으로 배지를 교체합니다.세포의 생존력과 증식을 평가하기 위해, 무균적으로 배양액을 10 mL의 zarin 작업 용액으로 교체하고 신장 스캐폴드를 분당 4 mL 속도로 관류합니다. 정확히 1시간 후에, 조건화 및 부분적으로 환원된 zarin 용액을 수집하고 다시 분당 4 mL 속도로 관류를 수행합니다. 100 mL의 신선한 배양액을 사용하여 물과 희석된 세제 용액으로 순차적으로 관류한 신장은 26시간에 걸쳐 점진적으로 더 투명해졌습니다. 마지막 세제 관류 시점에는 신장의 혈관 네트워크, 특히 엽간 혈관이 탈세포화된 스캐폴드 내에서 뚜렷하게 나타납니다. 장기 전체에서 천연 세포가 제거되어 사구체, 세뇨관 및 집합관의 온전한 기저막 네트워크와 탈세포화된 혈관의 세포외 기질만 남게 됩니다.더 큰 혈관들과 더불어, 사구체 내의 미세혈관 기저막 또한 구조적 무결성을 유지합니다. 방금 시연한 바와 같이 신장 스캐폴드에 파종된 RCTE 세포들은 주로 신장 스캐폴드의 피질 영역에 정착하며, 이곳에서 우선적으로 사구체 주변 세뇨관을 재집락화합니다. 파종 후 1일 차에는 사구체 내에 매립된 세포가 거의 없으며, 7일 차가 되면 이러한 세포들의 대부분이 신장 세포외 기질의 피질 영역을 차지함에 따라 사구체 내에는 세포가 거의 존재하지 않게 됩니다.7일간의 순방향 관류 배양 후, RCTE 세포 재집락화와 1주일의 관류 배양을 거치면 외수질과 유두관 및 집합관에 많은 RCTE 세포 라인 세뇨관이 존재하게 됩니다. 하지만 탈세포화 이후에 관찰되었던 투명도는 사라지며, 재세포화된 신장은 불투명해져 천연 상태에 더 가까운 모습이 됩니다. 이 과정 이후에는, 이러한 세포들의 대사적 또는 표현형적 상태가 신장 세포외 기질 내에서 어떻게 변화하는가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 조건화 배양액의 면역화학적 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.세포외 스캐폴드를 개발하고 공여 세포를 매트릭스에 다시 추가하는 능력은 연구자들이 천연 신장 세포외 기질 스캐폴드 내에서 3차원적인 성장과 성숙 과정을 규명할 수 있게 합니다. 최종 목표는 이 기술을 도구로 활용하여 신장 수복 및 재생 기전을 더 깊이 이해하는 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 광범위한 분자 생물학 및 세포 배양 연구를 위해 신장 세뇨관 상피 세포를 분리하고 정제하는 단계를 보여줍니다.

쥐 신장 세포 분리: 신장 세뇨관 상피 세포의 1차 배양을 분리하고 생성하는 기술

전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

이 프로토콜은 탈세포 쥐 신장을 사용하여 발판을 개발하는 방법을 소개합니다. 이 프로토콜에는 생체 이용률을 확인하기 위한 탈세포화 및 재세포화 프로세스가 포함됩니다. 탈세포화는 트리톤 X-100 및 나트륨 도데킬 황산염을 사용하여 수행됩니다.

쥐에 있는 세포탈구형 신장 비계의 준비

이 기사에서는 반고체 기저막 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 기저막 매트릭스 구축물은 오가노이드 발달 연구 또는 생체 내 이식 및 조직 재생 연구를 위한 3차원 배양에 사용할 수 있습니다.

쥐 비장 조직 형성을 조사하기 위한 Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

여기에서는 신장 피질에서 인간 신장 세뇨관 상피 세포(HRTEC)의 1차 배양을 얻어 세포외 기질(3D-HRTEC)에서 단층 및 3차원 배양을 개발하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Development of human renal tubular epithelial cell primary cultures in monolayers and three-dimensional conditions(단층 및 3차원 조건에서의 인간 신장 세뇨관 상피 세포 1차 배양 개발)

배우세요 쥐 신장의 세포 외 기질 비계를 제거하고 인간 상피 세포로 다시 채우는 방법을. 생체 반응기 내 관류 배양을 통해 신장 조직 공학 및 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

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