바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 기계적 조정 및 생리 활성 금속 비계의 제조

본 절차의 전반적인 목표는 생의학적 응용을 위해 기계적 조절이 가능하고 생체 활성을 갖는 금속 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이 방법은 약물 전달이 가능한 기계적 조절 금속 스캐폴드의 실현 가능성과 같이 정형외과용 임플란트 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 정밀화 방법은 단 하나의 제어 요소만을 필요로 하므로 간단합니다.

매개변수들은 기계적 강화와 지속 가능한 약물 방출을 모두 달성하며, 기능성이 부여된 다공성 구조를 제작할 수 있게 합니다. 먼저, 네 가지 초기 기공률을 가진 다공성 티타늄 스캐폴드를 만들기 위해 적절한 양의 티타늄 분말, 카페인 및 KD 4를 500 mL 폴리에틸렌 병에 혼합합니다. 볼 밀 오븐에서 병을 55 °C, 30 RPM의 속도로 30분 동안 회전시킵니다. 폴리에틸렌 병의 슬러리를 직경과 높이가 60 mm인 원통형 알루미늄 몰드에 붓습니다.

각 알루미늄 몰드를 알루미늄 커버 슬립으로 밀봉한 후, 볼 밀 오븐에서 55 °C의 온도로 30 RPM의 속도로 10분 동안 회전시킵니다. 이어서, 볼 밀 오븐의 온도를 44 °C로 낮추고 44 °C에서 30 RPM의 속도로 12시간 동안 연속적으로 회전시킵니다. 실온에서 1시간 동안 회전시켜 몰드를 냉각시킨 후, 볼 밀 오븐에서 꺼냅니다.

그런 다음 알루미늄 플런저를 사용하여 각 알루미늄 몰드에서 응고된 티타늄 카페인 그린 바디를 제거합니다. 이어서 응고된 티타늄 카페인 그린 바디를 고무 백에 넣고 끈으로 묶어 백을 완전히 밀봉합니다.

고정압 압축기의 수조에 고무 백을 넣고 200 megapascals의 등압력을 10분 동안 가합니다. 기기에서 고무 백을 꺼낸 후, 압축된 그린 바디를 고무 백에서 분리합니다. 티타늄 카페인 그린 바디를 Illumina 도가니로 옮깁니다.

도가니를 동결 건조기에 넣고 -40 °C에서 24시간 동안 동결 건조하여 카페인 상을 승화시킵니다. 동결 건조 후, Illumina 커버슬립으로 도가니를 닫습니다. 닫힌 도가니를 상온의 진공로에 넣습니다.

그 다음, 가열 속도를 분당 5 °C로 하여 전기로의 온도를 1300 °C까지 올립니다. 공기 건조된 성형체(green body) 시료는 보통 강도가 약해 무너지기 쉬우므로, 취급 시 각별한 주의가 필요합니다.

1300 °C에서 2시간 동안 온도를 유지한 후, 중심에 위치한 다공성 티타늄을 가열로 안에 6~7시간 동안 두어 가열로가 실온까지 완전히 냉각될 때까지 기다립니다. 가열로에서 샘플을 꺼낸 후, 더 작은 시편을 얻기 위해 샘플을 가공하고, 샘플을 유리 비커로 옮깁니다. 비커를 오토클레이브에 넣고 121 °C에서 15분 동안 샘플을 멸균합니다.

완료 후, 멸균된 시료를 증류수로 2회, 70% ethanol로 2회 세척하십시오. 그런 다음 다공성 티타늄을 페트리 접시에 넣고 UV 광원 아래 실온에서 시료를 공기 건조하십시오. 이때, 1 mL의 green fluorescence protein 또는 GFP를 9 mL의 ECCOs phosphate buffered saline solution과 혼합하여 100 µg/mL 농도로 희석합니다. 50 mL 멸균 폴리스티렌 튜브에 다공성 티타늄을 넣고 희석된 GFP 용액에 침지하여 실온에서 보관하십시오.

그 후 즉시 샘플을 진공 데시케이터에 넣고 10분 동안 진공 상태로 유지합니다. GFP 용액이 다공성 티타늄의 기공에 더 효과적으로 침투할 수 있도록 데시케이터에서 유리 비커를 꺼냅니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 유리 비커에서 다공성 티타늄을 꺼냅니다.

GFP가 코팅된 다공성 티타늄을 10 cm 직경의 페트리 접시에 넣고 클린벤치 내 실온에서 하룻밤 동안 공기 건조시킨 후, 다음 날 유리 비커에서 ECCOs 인산염 완충 식염수 10 mL로 다공성 티타늄을 두 번 헹굽니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 다공성 티타늄을 10 cm 직경의 페트리 접시에 옮기고 클린벤치 내 실온에서 하룻밤 동안 공기 건조시킵니다. 이어서 다양한 높이의 GFP 코팅 다공성 티타늄 시료를 원통형 스틸 다이에 넣고, 스틸 다이의 상단 및 하단 구멍에 펀치 세트를 삽입합니다.

상온에서 샘플의 Z 방향으로 강철 다이 조립체 내의 다공성 티타늄을 압축합니다. 미리 결정된 인가 변형률에 대해 0.05에서 0.1 s⁻¹의 중간 변형률을 사용하여 프레스 기계로 압축합니다. 압력을 1분 동안 유지합니다.

프레스 기기에서 다이를 제거합니다. 다이 본체 바닥에 스틸 링을 배치하고 다이를 다시 프레스에 넣습니다. 다이를 뒤집은 후, 플런저가 고밀도 시료를 D bore 밖으로 밀어낼 때까지 천천히 압력을 가하고 프레스에서 다이를 제거합니다.

강철 금형에서 치밀화된 티타늄 시료를 꺼냅니다. 마지막으로, 비커에 담긴 10 milliliters의 ECCOs 인산염 완충 식염수로 치밀화된 시료를 두 번 세척한 후, 클린 벤치에서 상온으로 하룻밤 동안 자연 건조합니다. 기존의 동결 주조법으로 제작된 티타늄 기공 구조는 카페인의 수지상 성장으로 인해 불규칙한 모양의 기공을 가진 방향성 기공 배열을 보여줍니다.

동적 동결 주조(dynamic freeze casting)를 통한 시료 동결 과정에서 거의 구형의 기공들이 무작위로 분포되어 나타나며, 치밀화 정도가 증가함에 따라 기공의 형태는 납작해지고, 치밀화가 가장 높을 때는 인접한 기공들이 서로 접촉하면서 기공이 거의 사라집니다. 기공률이 서로 다른 4개의 시편은 치밀화 전에는 서로 다른 초기 높이를 보였으나, 치밀화 후에는 거의 동일한 높이를 나타냈습니다. 덴트(dent)와 다공성 티타늄 모두 초기 방출 효과(bursting effect)와 함께 GFP가 빠르게 방출되는 거동을 보였으며, 대부분의 GFP가 1주일 이내에 방출되었습니다.

치밀화된 다공성 티타늄은 최대 한 달 동안 지속적인 방출을 보이며, 한 달 후에도 표면에 GFP가 뚜렷하게 나타납니다. 더 치밀한 코어를 가진 스캐폴드의 경우, 기계 가공을 통해 외부 부분을 단축했습니다. 내부의 더 높은 부분을 선택적으로 치밀화한 후의 micro CT 영상은 서로 다른 공극률을 가진 스캐폴드의 내부 및 외부 부분을 보여줍니다. 외부 부분은 높고 내부 부분은 낮은 다공성 티타늄은 치밀화 후 더 치밀한 외부 부분을 형성하며, 이때 외부 부분의 공극률은 낮아진 반면 내부 부분은 초기 공극률이 유지되었습니다.

이 기술은 개발 후 적절하게 수행될 경우 72시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 기술은 생체 재료 분야의 연구자들이 척수 손상 치료를 위한 약물 전달 및 기계적 특성이 전환된 메타 구조(meta ology) 제작의 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 제작된 스캐폴드가 약물 전달 기능을 갖춘 인공 디스크 대체물로 작용할 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 척수 손상 치료까지 확대되었습니다.