약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 활성화된 인간 진피를 사용하여 유전적으로 변형된 유기형 피부 배양을 생성하여 변경된 유전자 발현이 표피 성장 및 분화에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 방법은 어떤 유전자가 에피 성장, 분화 및 질병 진행을 담당하는지 결정하는 것과 같은 피부과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 변형된 인간 피부가 며칠 이내에 생성된다는 것인데, 이를 통해 잠재적으로 임상적으로 관련이 있는 인간 샘플을 연구할 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 징글징글 할 것입니다. 얼어붙은 사람 피부를 받는 경우 조직을 조직 배양 후드에 3-5분 동안 넣어 해동합니다. 해동되면 크기에 따라 멸균 50ml 원추형 튜브 또는 125ml 병에 조직을 옮깁니다.

다음으로, 용기가 75% 찰 때까지 하나의 XPBS에 4개의 페니실린과 스트렙토마이신을 추가합니다. 용기의 뚜껑을 닫고 5분 동안 세게 흔듭니다. 항생제를 제거하고 이것을 반복하십시오.

마지막 세척 후 세 번 더 단계를 밟고 조직을 새 용기로 옮기고 새 항생제 용액을 추가합니다. 이 혼합물을 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 2주 동안 배양하여 표피에서 진피를 분리할 수 있도록 합니다. 2주가 지나면 집게를 사용하여 진피의 표피를 벗겨냅니다.

인체 조직을 다루기 위한 기관의 프로토콜에 따라 표피를 폐기하십시오. 항생제 용액이 담긴 용기에 진피를 넣고 이전과 같이 격렬하게 흔들어 씻어냅니다. 마지막 세척 후에, 항생제 해결책의 새로운 콘테이너로 진피를 옮기고 800의 조밀도, 우물 당 000의 세포로 6개의 우물 판으로 완전한 매체에 있는 transfection 씨 피닉스 세포를 사용하는 것이 준비되어 있을 때까지 4 섭씨 온도에 저장하십시오.

transfection 당일에 6마이크로리터의 transfection 시약과 100마이크로리터의 dmm을 혼합합니다. 각 웰을 형질주입하고 실온에서 5분 동안 배양할 수 있도록 각 웰에 대해 3마이크로그램의 레트로바이러스 벡터가 들어 있는 튜브에 혼합물을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 후, 이 전체 혼합물을 피닉스 세포의 각 웰에 적가하고 형질주입 다음날 밤새 세포를 배양합니다. 피닉스 세포에서 배지를 제거하고 같은 날에 2ml의 새로운 완전 배지를 추가합니다.

항생제를 가진 각질 세포 혈청 자유로운 매체에 있는 1 차적인 인간적인 keratinocytes를 재suspend하고 75의 조밀도로 6개의 벽 판으로 씨를 뿌려서, 웰 당 000개의 세포. 다음 날, 형질주입된 Phoenix 세포에서 바이러스 입자가 포함된 배지를 수확합니다. 주사기를 사용하여 0.45미크론 필터에 매체를 통과시켜 오염 세포를 제거합니다.

감염 과정을 중재하는 데 도움이 되는 여과된 바이러스 포함 배지에 헥사 디메틸 브로마이드 밀리리터당 5마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 전날 도금된 각질세포에 2밀리리터의 바이러스를 피펫으로 주입합니다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 200Gs의 원심분리기에서 6개의 벽판을 회전시킵니다.

스핀 후 바이러스가 포함된 미디어를 제거하고 폐기합니다. XPBS 1개로 세포를 한 번 세척한 다음 다음 날 새로운 K-C-S-F-M을 추가합니다. 방금 표시된 절차를 사용하여 동일한 배치의 각질세포를 바이러스로 감염시킵니다.

유기형 카세트를 만들기 위해. 소작기를 사용하여 3.5cm 조직 배양 접시의 뚜껑 중앙에서 1cm x 1cm 정사각형을 제거합니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 카세트 바닥에 사각형 못을 부착하고 매니큐어가 마를 때까지 5분 동안 기다립니다.

마지막으로 카세트를 뒤집고 카세트를 못 위에 놓은 상태로 6cm 접시에 넣습니다. 섭씨 4도의 저장고에서 진피를 채취하여 각질 세포 성장 용기로 옮깁니다. 중간 정도로 세탁할 수 있습니다.

세척을 반복한 후 진피를 신선한 KGM에 넣고 섭씨 37도에서 2일 동안 배양합니다. 배양 후에는 메스를 사용하여 진피를 1.5cm x 1.5cm 크기로 자릅니다. 그런 다음 organotypic의 사각형 구멍에 진피의 상단이 위를 향하도록 설정합니다.

겸자를 사용하여 진피를 포함하는 전체 유기형 카세트를 뒤집습니다. 진피 바닥에 갓 구운 세포외 기질 5방울을 떨어뜨리고 진피 전체에 고르게 분포되도록 약간 흔듭니다. 세포외 기질이 5분 동안 굳어지도록 한 후 집게를 사용하여 카세트를 다시 뒤집은 다음 6cm 접시에 KGM 4ml를 추가합니다.

다음으로, 유전자 변형 각질 세포를 채취하고 계수한 후 Resus는 90 마이크로리터의 KGM에 0.5-100만 개의 세포를 현탁시키고 세포를 진피에 분배합니다. 섭씨 37도에서 공동 배양을 배양합니다. 격일로 문화에 대한 미디어를 바꾸십시오.

표피의 완전한 층화와 분화는 일반적으로 5일 이후에 발생합니다. 조직은 도금 후 최대 14일까지 수확할 수 있습니다. 이 이미지는 organotypic의 hematin 및 eosin 염색을 보여줍니다.

피부 배양 재생 인간 피부에는 표피와 진피가 모두 포함되어 있습니다. 표피는 완전히 층화되고 분화되어 있으며, 미분화 기저층과 지층, 스피노섬, 라늄 및 수각층을 포함한 3개의 분화된 층을 포함한 4개의 뚜렷한 층으로 분화되어 있습니다. 이러한 면역형광 이미지는 오른쪽에 표시된 바와 같이 SNA i 2의 과발현이 분화를 위해 염색된 왼쪽에 표시된 대조 조직에 비해 표피 분화를 억제한다는 것을 보여줍니다.

단백질 케라틴 1 또는 K 1은 녹색으로 표시되고 핵은 파란색으로 표시됩니다. 조직을 과도하게 발현하는 대조군 LAC Z 및 S NNA I의 SNAI 2의 mRNA 수준을 측정하기 위한 RTQ PCR R 분석은 대조군에 비해 SNAI 2의 50배 이상의 발현을 보여줍니다. 마지막으로, 이 RTQ PCR R 분석은 SNA I 2의 과발현이 TGM 1 및 SPRR 1 A와 같은 분화 유도 구조 유전자의 발현 상실을 초래한다는 것을 보여줍니다.

경막외 성장 및 분화 메커니즘을 결정하기 위해 chipsy, immunofluorescence, RN, ae 또는 western blotting과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 피부과 분야의 연구자들이 유전자 기능 변경이 피부 항상성에 어떤 영향을 미치는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 각질 세포를 사용하여 유전자 변형 유기 인간 피부 배양을 생성하고 인간 진피를 개발하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.