Name: 약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 학습하세요 유전자 변형된 인간 피부 모델을 생성하는 방법을 약화된 진피와 각질형성세포를 사용하여. 이 기술은 피부 성장과 분화에 영향을 미치는 유전자 기능을 연구하고 피부 질환의 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 미국 암 학회 (American Cancer Society) 연구 학자 그랜트 (RSG-12-148-01-DDC) 및 CIRM 기본 생물학 상 (RB4-05779) supportedby했다.

인간의 피부 프로토콜 캘리포니아 대학, 샌디에고의 연구 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 인간의 피부는 폐기 수술 샘플에서 얻은 또는 (피부 은행이 소재 / 장비의 표에 나와있는) 피부 은행에서 구입하실 수 있습니다. 피부 또는 기증자의 나이 파생 위치는 실험만큼 진피의 기저막 영역 단백질 (콜라겐 / 라미닌)에 중요하지 않은 것은 성능이 저하되지 않습니다. 약화 된 인간의 진피 1. 준비 <ol><li> 인간의 피부를 수신하면, (~ 3-5 분) 해동 조직 배양 후드에서 조직을 배치. 피부의 크기에 따라, 일회용 무균 50 ㎖ 원뿔형 튜브 또는 125 ml의 용기에 해동 조직을 배치. 피부 은행에서 피부의 전형적인 크기는 0.75 평방 피트입니다. </li><li> 1X PBS에서 4 배 페니실린과 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄 구균)와 75 %의 전체 컨테이너를 채 웁니다. 격렬하게 흔들어5 분 및 액체 폐기하십시오. 이 단계를 3 번​​ 이상 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 후, 새로운 튜브 / 병에 조직을 전송하고 컨테이너의 75 %를 채우기 위해 신선한 배 펜 / 패 혈성 / PBS를 추가합니다. 2 주부터 표피 진피의 분리를 허용하기 위해 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서이 혼합물을 배양한다. </li><li> 무균 조건에서, 진피에서 표피를 벗겨 집게를 사용합니다. 표피는 기증자 (그림 1A)의 인종에 따라 색상이 반면 진피는 완전히 흰색입니다. 인체 조직을 다루는 기관의 프로토콜에 따라 표피를 폐기하십시오. </li><li> 관 또는 병에 진피를 놓고 (4 시간 5 분 세척) 활발한 진탕 1X PBS에 희석 배 펜 / 연쇄상 구균에 씻는다. 마지막 세척 후 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 4 배 펜 / 1X PBS에 희석 연쇄 구균과 상점에서 새로운 튜브 / 병에 진피를 전송합니다. 진피 년까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></OL&gt; 2. 유전자 수정 기본 인간의 각질 형성 세포 주 : 차 인간 각화 세포를 감염 바이러스를 생산하기 위해 완벽한 DMEM 배지 [DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) + 펜 / 연쇄상] 재배 사용 amphotropic 피닉스 세포. 이러한 개그-POL 및 봉투와 같은 단백질을 인코딩 바이러스 성 포장 유전자가 안정적으로 레트로 바이러스 벡터로 형질 전환 된 경우 바이러스 생산을 허용 피닉스 세포 게놈에 통합되어 있습니다. 피닉스 세포 고효율 높은 역가의 바이러스 생산을위한 형질 허용 될 수있다. 이 포장 라인에서 생산 된 바이러스는 인간을 포함한 포유 동물 세포의 큰 다양성을 감염시킬 수 있습니다. <ol><li> 1 일 : 형질 전날, 완전한 DMEM 매체 잘 당 800,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 피닉스 세포. </li><li> 주 2 : 형질의 날, 3 레트로 바이러스 벡터의 μg의 당을 잘 사용합니다. 1.5 ML 튜브에 레트로 바이러스 벡터의 나누어지는 3 μg의. 100 μ의 혼합을 사​​용하여; L의 DMEM 플러스 벡터의 모든 3 μg의에 대한 형질 전환 시약의 6 μL. 1.5 ML 튜브에 100 μL의 DMEM으로 형질 전환 시약의 6 μl를 섞는다. (사용되는 레트로 바이러스 벡터는 장비 / 재료 표에 나와 있습니다). <ol><li> 5 분 동안 인큐베이션 및 레트로 바이러스 벡터를 함유하는 3 μg의 사전 분취 튜브에 106 ㎕의 혼합물을 추가한다. 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 피닉스 세포의 각 웰이 전체 혼합물의 적가를 추가합니다. </li></ol></li><li> 주 3 : 형질 전환 후 날, 피닉스 세포에서 미디어를 제거하고 신선한 완전한 DMEM 배지 2 ㎖를 추가합니다. 같은 날에, 웰 당 75,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 차 인간 각화 세포를 시드. 항생제와 각질 세포의 무 혈청 배지 (KCSFM) (펜 / 연쇄상 구균)에있는 각질을 유지한다. 참고 : 1 차 인간의 각질 세포가 구입 하였다. 세포 (소재 / 장비의 표에 나와있는) 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 주 4 : 하르지금은 바이러스 입자를 포함하는 형질 전환 피닉스 세포에서 용지를 가득. 주사기를 사용하여 0.45 μm의 필터를 통해 미디어를 전달 (모든 오염 피닉스 세포를 제거하기 위해) 및 각질 형성 세포에 2 ml의 배치 (전날 / 잘 75,000 세포에서 도금 : 단계 2.3 참조). 감염 과정을 중재하기 위해 언론에 hexadimethrine 브로마이드 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 바이러스 역가는 ~ 1 × 10 7 TU / ㎖이다. <ol><li> RT에서 1 시간 동안 200 XG에서 원심 분리기에서 6 웰 플레이트 스핀. 스핀 후, 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하고 KCSFM를 추가하기 전에 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 제 5 일 : 단계를 다시 2.4로 각질 세포의 동일한 배치를 감염. 참고 : 레트로 바이러스 벡터의 선택 마커가있는 경우 약물을 사용하여 각질을 선택하고 다운 스트림 분석 또는의 Organotypic 문화 등의 용도로 확장합니다. </li></ol> 3. 피부의 Organotypic 문화를 설정 <ol><li> 구축일반 실험실에있는 자료 또는 카세트에서의 Organotypic 카세트 사용자 정의 금속 제조 가게를 통해 할 수있다 (그림 2A - F). 3.5 cm 조직 문화 판에서 이러한 카세트를하려면, 3.5 cm 접시 (그림 2A-B)의 뚜껑의 중심에서 1.0 cm X 1.0 cm 사각형을 제거하는 소작을 사용합니다. 무균 상태에서이 작업을 수행합니다. <ol><li> 명확한 매니큐어 (그림 2C)를 사용하여 카세트 (3.5 cm 접시의 뚜껑)의 바닥에 사각형 못을 연결합니다. 매니큐어 5 분 건조하고 광장 못 (그림 2D)에 쉬고되도록 카세트를 뒤집어하도록 허용합니다. 6cm 접시에 카세트를 놓습니다. 참고 : 광장 예술과 공예 상점의 다양한에서 구입하실 수 있습니다 쐐기. </li></ol></li><li> 각질 세포 성장 배지 DMEM 66 %, 22 %, 햄 F12, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % FBS, 2.67 μg의 / ㎖ 아데닌 100 μg의 40 N로 구성된 (KGM)를 준비g / ㎖ 하이드로 코르티손, 10 NG / ㎖ 콜레라 독소, 4.94 / ㎖ μg의 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 1.36 NG / ㎖ Triiodo-L-로닌, 10 NG / ㎖ EGF 및 10 μg의 / ㎖ 시프로플록사신 염산염. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 미디어를 필터링합니다. </li><li> 배 펜 / 연쇄상 구균 + PBS 용액에서 진피를 타고 KGM에서 2 회 반복 한 후 사용하기 전에 이틀 동안 37 ° C에서 KGM에 품어. </li><li> 1.5 cm X 1.5 cm 크기의 조각으로 메스를 사용하여 진피를 잘라 다음의 Organotypic 카세트에 배치합니다. 이 위를 향하게하여 진피의 상부와 진피를 놓습니다. 진피의 정상은 각질 세포 (그림 1B)와 접촉하는면 될 것입니다. </li><li> (그림 3A)를 직면하고있는 진피의 상부면의 Organotypic 카세트의 사각형 구멍에 사전 컷 진피를 놓습니다. </li><li> 집게를 사용하여 위에 진피를 함유하는 전체의 Organotypic 카세트 (도 3b 플립). 얼음 외 기질 용액을 해동. 카세트 당 세포 외 기질 용액 100 μL를 그려 바늘과 주사기를 사용합니다. 진피 (광택면)의 바닥에 5 방울을 추가하고 진피 (그림 3B)에 걸쳐 고른 분포를 확인하기 위해 약간 흔들. </li><li> 상업 세포 외 매트릭스 솔루션을위한 5 분은 완전히 (그림 3C)를 공고히 할 수 있습니다. 응고 후, 다시 위에 카세트를 플립 집게를 사용합니다. 6cm 접시에 KGM의 4 ML을 추가합니다. </li><li> 진피 (그림 3D)를 포함하는의 Organotypic 카세트에 0.5-1000000 유 전적으로 변형 된 각질 세포를 놓습니다. <ol><li> 5 분 동안 10cm 플레이트에 0.05 % 트립신 4㎖를 배치하고 완전 DMEM 배지 4 ㎖로 급냉하여 각화 세포를 Trypsinize. </li><li> 혈구를 사용하여 각질 세포를 계산 한 다음 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 재현 탁 0.5-1000000 세포는 90 μ로 (사용 가능한 셀의 수)에 따라그리고 KGM의 L은 진피에있는 모든 세포를 놓습니다. 주 : 재생 된 표피의 두께에 차이가 보이는 세포 수를 시작하는 차이에 의해되지 않도록 동일한 실험 진피 내에서 동일한 수의 셀을 배치하는 것이 중요하다. 진피에 미만 50 만 셀을 배치하면 가난한 계층화와 차별화 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 매일의 Organotypic 문화에 KGM 미디어를 변경합니다. 수확 조직 진피에 각질 세포의 배치 후 1-14일. 표피의 전체 계층화 및 분화는 일반적으로 5 일 후에 발생합니다. </li></ol>

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의 Organotypic 문화가 많은 장점을 제공하는 사람의 피부에서 유전자 조작은 일반적으로 2D를 배양 된 세포뿐만 아니라 마우스 모델을 공부합니다. 2D 배양 본래 조직 및 기관에서 발견 삼차원 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하다. 최근의 연구는 16 차 종양이 사람의 피부에 많은 유전자 발현 유사성을 보여주는 3 차원 배양 된 세포와 함께 배양 된 2D 및 3D 피부암 세포 사이의 상당한 차이를 발견 하였다. 인간의 Organotypic 피부의 문화는 마우스 모델에 비해 여러 가지 장점이있다. 마우스 모델은 시간 소모적이고, 인간 및 마우스의 피부 사이에 주목할만한 차이를 생성 할뿐만 아니라, 고가이다. 이들은 다른 조직의 이직률뿐만 아니라 쥐와 인간의 표피 (8) 사이의 표피의 두께를 포함한다. 이러한 CRISPR-CAS으로 부상하고 새로운 기술은 특정 유전자가 변형 될 수와 /의 Organotypic 스킨이 배양을 이용하여 인간의 피부 질환을 모델로...

인간 표피뿐만 아니라이 아니라를 보호하는 제 1의 방어선 수분의 손실을 방지하는 불 투과성 장벽 역할 기저막 zone.The 표피로 알려진 세포 외 기질을 통해 하부 진피에 연결 성층 상피이고 외국과 독성 물질 1 몸. 표피의 가장 깊은 층 인 기저층은, 표피 (2)의 나머지를 형성하는 분화 된 자손을 야기 표피 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 상피 전구 세포는 분화 된 바와 같이 그들은 가시 층 (3)으로 알려진 분화 된 세포의 제 1 층을 형성하기 위해 위쪽으로 이동한다. 가시 층에서, 세포는 표피의 분화 층 물리적 응력을 견딜 수 있도록 강도를 제공 케라틴 1 내지 10의 발현에 차례. 가시 층 세포는 상기 차별화 된 바와 같이, 그들에 대한 표피의 위쪽으로 이동세포막 아래 조립 keratohyalin와 라멜라 과립의 형성뿐만 아니라, 구조 단백질을 특징으로 과립 층 미터. 세포 분화 과정에서 진행하는 라멜라 과립이 풍부한 층은 각질층 4라는 지질을 형성하는 셀로부터 압출되는 동안, 세포막 밑 단백질은 서로 결합 가교이다. 상피 세포 성장과 분화에 미치는 영향 ~ 인구 5의 20 %의 변화를 포함하는 질병. 따라서,이 과정의 기전을 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 질병의 많은 표현이 세포 - 세포 또는 세포 - 매트릭스 접촉에 달려 있기 때문에, 인간의 표피가 3D 환경에서 재구성의 Organotypic 문화 6-10 만들어졌습니다. 이들 방법은 일반적으로 약화 된 인간과 같은 세포 외 기질에 파종 차 또는 변환 된 각화 세포의 사용을 포함진피, 마트 리겔, 또는 콜라겐. 표피 성장과 분화에 중요한 유전자 조절 기전을 이해하기 위하여 케 라티노 유전자 차원 배양 유전자 녹다운 또는 과발현하는 레트로 바이러스 벡터를 통해 조작 된 후 3D로 재구성 될 수있다. 이러한 방법은 종양 11-21 표피 줄기 및 전구 세포자가 재생과 분화뿐만 아니라 진행에 관여하는 유전자를 특성화하는 데 광범위하게 사용되어왔다. 여기서, 레트로 바이러스를 사용하여 배양 물에서, 표피의 Organotypic 유전자 발현을 변경하는 방법에 대한 심도있는 프로토콜이 제공된다.

<table><tbody><tr><td>인간 피부</td><td>뉴욕 소방관 스킨 뱅크</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>양쪽 친화성 피닉스 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 형질 주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>각질 세포 매체 (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>아데닌</td><td>시그마</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>시그마</td><td>&nbsp; C-8052</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>인비트로젠</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린&nbsp;</td><td>시그마</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td><td>혈청 제약</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>소작기</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 항체</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>사각 못</td><td>예술 공예품 상점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 신생아 각질 세포</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>인간 신생아 각질 세포</td><td>응용</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV 레트로바이러스 벡터</td><td>클론텍</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS 레트로바이러스 벡터</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro 레트로바이러스 벡터</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>헥사디메트린 브로마이드&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 organotypic 피부 문화의 생성

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

의 Organotypic 문화 기능과 생체 조직의 대응의 생리를 모방 세포 - 세포 연락처 및 세포 - 기질 상호 작용에 중요한 3D 환경의 재구성 할 수 있습니다. 이 충실히 표피 분화와 계층화 프로그램을 되풀이되었습니다의 Organotypic 피부 배양을들 수있다. 기본 인간의 표피 각질 세포는 유전자가 쉽게 과발현 또는 무너 뜨렸다 수 있습니다 레트로 바이러스를 통해 유전자 조작 될 수 있습니다. 이러한 유 전적으로 변형 된 각질 세포는 유전자 전달 경로에 충격을 표피 성장, 분화, 및 질병 진행을 연구하는 모델을 제공하는 강력한의 Organotypic 피부 배양 인간 표피를 재생성하기 위해 사용될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 약화 된 인간의 진피를 준비뿐만 아니라 유 전적으로 피부의 Organotypic 문화를 생성하기 위해 기본 인간의 각질 세포를 조작하는 방법을 설명합니다. 인간의 피부는 재생 downstr 사용될 수있다이러한 유전자 발현 프로파일, 면역 및 높은 처리량 시퀀싱 하였다 염색질 면역 침전 등 EAM 애플리케이션. 따라서, 이러한 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성은 피부의 항상성 유지에 중요한 유전자의 결정을하실 수 있습니다.

인간 피부의 Organotypic를 생성하는 첫 번째 단계는 표피 진피를 제거하는 것이다. 37 ° C에서 4X 펜 / 연쇄상 / PBS에서 피부의 2 주 인큐베이션 표피 (도 1a)에서 진피의 분리를 허용한다. 표피와 진피를 분리하는 것이 어려운 경우 다른 주 동안 4 배 펜 / 연쇄상 구균에 37 ° C / PBS에서 조직을 배치하고 다시 벗겨 집게를 사용해보십시오. 약화 된 진피에 인간의 표피를 재생의 열쇠 중 하나는 각질 세포가 진피의 올바른 측면에 배치되어 있는지 확인하는 것입니다. 진피는 상단과 하단이 있습니다. 진피의 정상은 생체 내에서 각질 세포와 접촉뿐만 아니라의 Organotypic 문화에서 제공되는 측면이다. 진피의 상부 인해 저면 (도 1b)의 광택도에 진피의 바닥으로부터 구별 될 수있다. 각질 세포가 바닥에 직접 배치하는 경우진피의 (광택) 측, 표피는 차별화 또는 제대로 계층...

이 논문의 목표는 표피 각질세포와 활력을 잃은 인간 진피로부터 유전적으로 변형된 인간 유기형 피부를 생성하는 방법에 대한 포괄적이고 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

본 절차의 전체적인 목표는 재생된 인간 진피를 사용하여 유전자 변형된 장기 모사 피부 배양물을 생성함으로써, 변화된 유전자 발현이 표피의 성장 및 분화에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 방법은 어떤 유전자가 표피 성장, 분화 및 질병으로의 진행에 관여하는지를 결정하는 것과 같이 피부과 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 변형된 인간 피부가 며칠 내에 생성된다는 점이며, 이를 통해 임상적으로 관련성이 잠재적인 인간 샘플을 연구할 수 있습니다.본 절차는 저의 실험실에서 시연될 예정입니다. 냉동된 인간 피부를 수령한 경우, 조직을 조직 배양 후드에 3~5분 동안 두어 해동하십시오. 해동이 완료되면 조직의 크기에 따라 멸균된 50 mL 원추형 튜브 또는 125 mL 병으로 옮기십시오.다음으로, 용기의 75%가 찰 때까지 1x PBS에 4x penicillin 및 streptomycin을 추가합니다. 용기의 뚜껑을 닫고 5분 동안 세게 흔듭니다. 항생제 용액을 제거하고 이 과정을 반복합니다.마지막 세척 후 세 번 더 단계적으로 처리한 다음, 조직을 새 용기로 옮기고 신선한 항생제 용액을 추가합니다. 진피와 표피가 분리될 수 있도록 이 혼합물을 37°C의 조직 배양 배양기에서 2주 동안 배양합니다. 2주가 지나면 핀셋을 사용하여 진피에서 표피를 벗겨냅니다.인체 조직 처리 관련 기관 프로토콜에 따라 표피를 폐기하십시오. 진피를 항생제 용액이 담긴 용기에 넣고 이전과 같이 강하게 흔들어 세척하십시오. 마지막 세척 후, 진피를 새로운 항생제 용액 용기로 옮겨 4°C에서 보관하며 사용 시까지 유지하십시오. transfection 전날, phoenix 세포를 완전 배지로 6-well 플레이트에 well당 800,000 cells의 밀도로 분주하십시오.형질전환 당일에 형질전환 시약 6 µL를 dmm 100 µL와 혼합합니다. 형질전환할 각 웰에 맞게 분량을 조절하여 상온에서 5분 동안 배양합니다. 이 혼합물을 형질전환할 각 웰당 3 µg의 레트로바이러스 벡터가 들어있는 튜브에 넣고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 이 전체 혼합물을 phoenix 세포가 들어있는 각 웰에 한 방울씩 천천히 첨가하고 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 다음 날, phoenix 세포에서 배지를 제거하고 같은 날 신선한 완전 배지 2 mL를 첨가합니다.항생제가 포함된 각질세포 무혈청 배지(keratinocyte serum free medium)에서 일차 인간 각질세포를 재현탁하고, 웰당 75,000 cells의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주합니다. 다음 날, 형질전환된 Phoenix 세포로부터 바이러스 입자가 포함된 배지를 수확합니다. 주사기를 사용하여 배지를 0.45 micron 필터로 여과하여 오염된 세포를 제거합니다.감염 과정을 돕기 위해 여과된 바이러스 함유 배지에 5 µg/mL의 hexa dimethyl bromide를 첨가합니다. 그다음, 전날 플레이팅한 각질 형성 세포에 바이러스 2 mL를 피펫으로 분주합니다. 이어서 6-웰 플레이트를 원심분리기에서 상온으로 200 Gs로 1시간 동안 원심분리합니다.원심분리가 끝나면 바이러스가 포함된 배지를 제거하여 버립니다. 세포를 1x PBS로 한 번 세척한 후, 다음 날 새로운 K-C-S-F-M을 첨가합니다. 앞서 보여드린 절차를 사용하여 동일한 배치의 각질형성세포에 바이러스를 감염시킵니다.장기 배양용 카세트를 제작합니다. 소작기를 사용하여 3.5 cm 조직 배양 접시 뚜껑의 중앙에서 1 cm x 1 cm 크기의 정사각형 조각을 제거합니다. 투명 매니큐어를 사용하여 카세트 바닥에 사각형 페그를 부착하고, 매니큐어가 마를 때까지 5분 동안 기다립니다.마지막으로, 카세트를 뒤집어 카세트가 핀 위에 놓인 상태로 6 cm 디시에 넣습니다. 4 °C 보관 중인 진피를 꺼내 세척을 위해 각질형성세포 성장 배지가 담긴 용기로 옮깁니다.세척 과정을 반복한 후, 진피를 신선한 KGM에 넣고 37°C에서 2일 동안 배양합니다. 배양 후, 메스를 사용하여 진피를 1.5 cm x 1.5 cm 크기로 절단합니다. 그런 다음 진피의 윗면이 위를 향하도록 하여 장기 모사 배양 장치의 정사각형 구멍 위에 배치합니다.포셉을 사용하여 진피가 포함된 오가노타입 카세트 전체를 뒤집습니다. 신선하게 조제된 extracellular matrix 다섯 방울을 진피 바닥면에 추가하고, 진피 전체에 고르게 분포되도록 살짝 흔들어 줍니다. extracellular matrix가 5분 동안 응고되도록 기다린 후, 포셉을 사용하여 카세트를 다시 뒤집고 6 cm 디쉬에 KGM 4 mL를 추가합니다.다음으로, 유전자 변형된 각질형성세포를 회수하고 세포 수를 센 후, 0.5~1백만 개의 세포를 90 µL의 KGM에 재현탁하여 진피 위에 분주합니다. 공배양 시스템을 37 °C에서 배양합니다. 배양액은 이틀마다 교체합니다.표피의 완전한 층상 구조 형성 및 분화는 보통 5일 이후에 일어납니다. 조직은 플레이팅 후 최대 14일까지 수확할 수 있습니다. 이 이미지는 기관 유사 구조의 헤마토실린 및 에오신 염색 결과를 보여줍니다.재생된 인간 피부인 피부 배양물은 표피와 진피를 모두 포함하고 있습니다. 표피는 미분화된 기저층과 가시층, 과립층, 각질층을 포함하는 세 개의 분화층 등 총 네 개의 뚜렷한 층으로 완전히 층상화 및 분화되어 있습니다. 이 면역형광 이미지는 분화 마커로 염색했을 때, 왼쪽의 대조군 조직과 비교하여 오른쪽의 SNAi2 과발현이 표피 분화를 억제함을 보여줍니다.단백질 keratin one 또는 K one은 녹색으로 표시되었으며, 핵은 청색으로 표시되었습니다. 대조군 LAC Z 및 SNAI two 과발현 조직에서 SNAI two의 mRNA 수준을 측정하기 위한 RTQ PCR R 분석 결과, 대조군 대비 50배 이상의 SNAI two 발현이 확인되었습니다. 마지막으로, 이 RTQ PCR R 분석은 SNAI two의 과발현이 TGM one 및 SPRR one A와 같은 분화 유도 구조 유전자의 발현 손실을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 따릅니다.경막 성장의 기전과 분화를 결정하기 위해 ChIP-seq, 면역형광법, RNA-seq 또는 웨스턴 블로팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 피부과 분야의 연구자들이 유전자 기능의 변화가 피부 항상성에 어떤 영향을 미치는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 각질형성세포와 인간 진피 유래 세포를 사용하여 유전자 변형 유기적 인간 피부 배양물을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 흑색종 진행을 연구하기 위해 체외 3D 유기형 피부 재건을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 피부 모델은 생체 내 장기의 구조와 다세포 복잡성을 모두 모방합니다.

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이 비디오는 유전자 변형 1차 인간 각질 세포 재조합 레트로바이러스를 생산하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 각질 세포에서 유전자 발현을 조작하는 데 사용할 수 있습니다.

1차 인간 각질세포의 유전자 변형: 재조합 레트로바이러스를 이용하여 각질세포를 유전적으로 조작하는 방법

이 비디오 프로토콜은 표피 각질세포와 활력을 잃은 인간 진피를 사용하여 인간 유기형 피부를 생성하는 카세트 기반 체외 배양 기술을 설명합니다. 그들은 생체 내 조직 대응물의 기능과 생리학을 모방합니다.

유기형 3D 피부 배양: 무세포 진피에서 인간 표피를 재생하는 카세트 기반 체외 배양 기술

이 프로토콜의 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부를 구축하는 것입니다. 특별히 제작된 자동 상처 제거 장치를 사용하면 무균 상태를 유지하면서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성할 수 있습니다.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한...

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

여기, 우리이 두 아키텍처는 3D organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 프로토콜을 제시 하 고 다세포 복잡 한 기관/종양에 vivo에 의 하지만 같은 시간에 수용 체계적인 실험 내정간섭입니다.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜의 목표는 장기 문화를 위한 접근가능하고 간단한 기술을 사용하여 혈관화된 인간 피부 등가물의 생성 및 체적 분석을 설명하는 것입니다. 가능한 한, 단계에 대한 근거는 연구원이 연구 요구에 따라 사용자 정의 할 수있는 능력을 허용하기 위해 설명된다.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

여기에서는 조직 상호 작용, 4D 이미징 타임랩스 동영상(3D 플러스 타임), 분자 기능의 전역 또는 국소 섭동 및 시스템 생물학 특성화를 검사하는 데 사용할 수 있는 세 가지 유형의 조류 배아 피부 이식 배양에 대한 프로토콜을 설명합니다.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

이 프로토콜은 피부 구조 및 기능을 복제하기 위해 평면, 생리학적으로 관련된 공기-액체 계면 배양 시스템을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 모낭을 포함하는 피부 오가노이드를 생산하는 방법을 간략하게 설명합니다.

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

학습하세요 유전자 변형된 인간 피부 모델을 생성하는 방법을 약화된 진피와 각질형성세포를 사용하여. 이 기술은 피부 성장과 분화에 영향을 미치는 유전자 기능을 연구하고 피부 질환의 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

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