Name: Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 학습하세요 수정된 광혈전 기술을 이용하여 캡슐 경색 모델을 만드는 방법을. 이 기법은 지속적인 운동 장애를 유발하는 정확한 내부 캡슐 표적화를 가능하게 하며, 쥐를 사용하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 의료 시스템 공학 연구소 (iMSE) GIST에서 GIST-Caltech의 공동 기금 (K04592)에서 부여에 의해 과학, ICT와 미래 기획의 교육부에 의해 투자 한국의 NRF을 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 (NRF-2013R1A2A2A01067890).

모든 절차는 과학 기술 (GIST) 광주 연구소의 제도적 지침에 따라 수행되었다, 모든 절차는 GIST에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 사전의 lesioning 단계 <ol><li> 내부 캡슐의 앞다리 지역의 식별 AAV-GFP를 사용하여 <ol><li> 기관 및 국가 가이드 라인을 준수 - (13주 ~ 400g, 11) 하우스 스프 라그 돌리 쥐를 처리합니다. </li><li> 적절한 살균 (스팀 또는 플라즈마 살균기)를 사용하여 모든 수술 도구와 전극을 소독. 살균 30 분, 건조 30 분 설정으로 121 ° C에서 증기 멸균기를 사용합니다. </li><li> 근육 주사로 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 발 끼에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 가열 패드 아래로 37.5 ± 0.5 ° C의 체온 유지동물의 몸. </li><li> 귀 바, 입 홀더를 사용하여 정위 프레임에 동물을 배치합니다. </li><li> 면도하고 70 % 알코올, 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독. 수술 중 통증을 감소시키기 위해 의도 된 두개골 절개 영역 두피 하에서 2 %의 리도카인 염산염을 침투. </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 적용합니다. 수술 사이트 동물을 통해 멸균 드레이프를 놓습니다. 무균 조건에서 모든 절차를 유지한다. </li><li> 메스를 사용하여 2cm의 정중선 두개골 절개를 수행하고 와이어 견인기와 양자 피부를 철회. 면봉 30 % 과산화수소와 두개골을 건조. </li><li> 운동 피질의 앞다리 영역을 통해 핸드 피스 드릴 사용하여 구멍 확인하고 바이러스 주입을위한 마이크로 currette와 기관을 취소 (AP를 : +2.5을 브레 그마에서, ML을 중간 선에서 2.5 ±). </li><li> 얼음의 부하 1 μL의 AAV-GFP (2 × 12 바이러스 분자 / ㎖)을 해동10 μL 주사기에 바이러스. 정위 프레임에 주사기를 놓습니다. </li><li> 미리 만들어진 구멍에 바늘을 이동하고 경질에 깊은 바늘 1mm를 내립니다. </li><li> 바이러스 서서히 (0.1 μL / 분) 고정밀 마이크로 펌프를 사용하여 주입하고 바이러스 밖으로 확산 될 수 있도록 추가로 10 분 동안 위치에 바늘을 떠난다. </li><li> 식염수 관개와 수술 부위를 청소 한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처를 보호; 정위 프레임으로부터 래트를 분리 및 회수 챔버로 옮긴다. 수술 후 통증 조절을위한 근육 주사를 통해 케토 프로 펜 (2 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 가열 패드와 신체 온도 (37 ° C)를 유지하고 필요에 피하 주사를 통해 근육 주사하고 2 % 리도카인 염산염을 통해 (0.1 %, 1 ㎖) 두 번째 세대 cephems 수준의 항생제를 관리 할 수​​ 있습니다. 그것을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오흉골 드러 누움. 싱글 하우스 전체 복구 될 때까지 동물. </li><li> 2 다음 - 삼주 복구, 깊이 후드에 근육 주사를 통해 케타민 하이드로 클로라이드 (300 ㎎ / ㎏)의 과다 복용과 함께 쥐를 마취. 발가락 곤란 응답, 맥박, 호흡의 부족으로 동물의 죽음을 확인합니다. 후드의 쥐 부정사를 놓습니다. </li><li> 흉강을 엽니 다 &#39;&#39;추정치 모양의 절개를 통해 복강을 엽니 다. 단단히 지혈과 하행 대동맥 클램프 및 혈액 배수의 쥐 심장의 우심방 파열. 30 분 (10 ml / 분)에 대한 4 % 파라 포름 알데히드 다음 5 분 (10 ml / 분)에 대한 차가운 1 % 파라 포름 알데히드와 심장의 좌심실로 관류를 시작합니다. </li><li> 가위를 사용하여 시체에서 쥐 머리를 제거합니다. 코에 목에서 중간 선 절개를하고 두개골이 노출되도록 가위 또는 rongeur를 사용하여 목 근육을 제거합니다. 조심스럽게 뇌에서 두개골 뼈와 DURAS을 해부하다. </li><li>뇌를 추출하고 밤새 4 % 파라 포름 알데히드로 가득 찬 50ml의 원뿔 관에서 쥐의 뇌를 놓습니다. 다음 날, 1X PBS 3 회 뇌를 씻고 30 % 자당 용액에 넣습니다. </li><li> 뇌 완전히 30 % 자당 용액의 바닥에 가라 후 cryotome에서 -20 ° C에서의 OCT 화합물과 cryomold 뇌를 배치했다. 40 ㎛ 두께 200 μm의 간격으로 관상면에서 뇌 조각입니다. </li><li> 슬라이드 방식 (14)를 사용하여 GFP의 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 차 항체 적용 (1 : 안티 - 녹색 형광 단백질, 토끼 IgG의 분율 200) 뇌 조각에 밤새 4 ° C에서. 2 번째 날에, 트윈 20 (PBST) 용액으로 1 % 인산염 완충 식염수로 3 회 세척 및 이차 항체 (1 : 염소 항 - 토끼 IgG를 500 (H + 1))를 적용, 1 시간 동안. 1 % PBST 3 회와 슬라이드를 씻어. 뇌 조각의 커버 유리를 놓습니다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 (여기 파장470 nm의 발광 파장 525 nm의, 배율 5 배), 캡슐 내부에있는 AAV-GFP 형질 축삭을 관찰. 형질 도입 축삭의 정위 좌표를 확인하기 위해 쥐 뇌 아틀라스 (15)와 형질 축색 돌기의 위치를 비교 </li></ol></li><li> 캡슐 경색 모델링에 적합 빛 강도의 조정 사전의 lesioning <ol><li> 광학 신경 인터페이스의 건설 <ol><li> 절단 드릴을 사용하여 내부 탐침으로 27 게이지 척추 바늘의 적절한 길이 (4cm)을 잘라. 참고 : 절단 압축 및 척추 바늘 끝을 분쇄 할 수있다; 탐침을 분리하고 척추 바늘의 파쇄 부를 분리하고 척추 바늘의 내부 직경을 유지하기 위해 척추 바늘 끝을 연마. </li><li> 일 측면 패치 코드의 (a 62.5 μm의 코어 125 μm의) 광섬유의 재킷의 적당한 길이 (10cm)를 벗긴다. </li><li> unjacked 광 파이를 삽입BER 금속 튜브 (외부 직경 17mm : 3.8 mm, 내경 : 3.3 mm 길이)로 한 후, 섬유 주위에 클램프된다. 금속관은 광섬유 척추 바늘 허브 사이의 공간을 채우기 위해 유용하다. 회 누름으로 금속관의 1/2 하부 클램프. </li><li> 광파이버에 열경화성 에폭시를 적용하고 척추 바늘에 광섬유를 삽입한다. 허브의 빈 공간에 추가 에폭시를 적용합니다. 안정적인 고정 100 ℃에서 20 분 동안 에폭시 경화. </li><li> 척추 바늘로부터 돌출 된 광섬유를 절단 및 다이아몬드 래핑 (연마) 시트를 사용하여 척추 바늘 끝에 광섬유 연마. </li><li> 그린 레이저 시스템의 커플러 패치 코드의 FC / PC 커넥터 부분을 연결하고 디지털 광 전력 및 에너지 측정기를 이용하여 광파이버의 선단에서의 광 강도를 측정한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Photothrom내부 캡슐에 botic 경색의 lesioning <ol><li> 적절한 살균 (스팀 또는 플라즈마 살균기)를 사용하여 모든 수술 도구와 전극을 소독. 살균 30 분, 건조 30 분 설정으로 121 ° C에서 증기 멸균기를 사용합니다. </li><li> 동물을 마취 (~ 400g, 11-13주)를 근육 내 주사를 통해 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7 ㎎ / ㎏)의 혼합물. 발 끼에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 동물의 신체 하에서 가열 패드를 통해 37.5 ± 0.5 ° C의 체온을 유지한다. </li><li> 귀 바, 입 홀더를 사용하여 정위 프레임에 동물을 배치합니다. </li><li> 면도하고 70 % 알코올, 포비돈 요오드 용액으로 수술 부위를 소독. 수술 중 통증을 감소시키기 위해 의도 된 두개골 절개 영역 두피 하에서 2 %의 리도카인 염산염을 침투. 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 은 An 통해 멸균 드레이프를 적용imal 및 수술 부위를 노출합니다. 무균 조건에서 모든 절차를 유지한다. </li><li> 2cm의 정중선 두개골 절개를 수행하고 와이어 견인기와 양자 피부를 철회. 면화 스왑 및 과산화수소와 두개골을 건조. </li><li> 브레 그마 및 람다는 동일한 수준으로 정렬 될 때까지 코 클램프의 높이를 조정한다. CRITICAL STEP이 올바르게 정렬 같은 메인 실험 내부 캡슐 경색 병변을 수행 같이 깊은 구조에 접근하는 것이 중요하다. </li><li> 구멍 만들기 (직경 : 2mm, AP : 브레 그마에서 -2.04; ML을 : 중간 선에서 3.0 ±) photothrombosis을 유도하기 위해 드릴을 사용. </li><li> 폴란드와 광학 인터페이스의 광섬유 팁 청소. 굽​​힘없이 정위 프레임에 ONI을 수정합니다. ONI의 끝을 확인하기 전에 광학 인터페이스의 삽입 후 명확하게 그것을 닦아냅니다. </li><li> 하기 Optica의 삽입 전에 광파이버의 선단으로부터 레이저의 세기를 측정래트 뇌의 표적 부위 L 인터페이스. 광섬유의 선단에, 수술 전 단계에서 확인한 결과, 3.5 mW의 레이저로 농도를 조정. </li><li> 내부 캡슐의 대상 영역에 드릴 구멍을 통해 (전 수술 단계에서 확인 -7.8 mm을)를 ONI를 삽입합니다. </li><li> photothrombosis 동안 37.5 ± 0.5 ° C의 체온을 유지한다. 낮은 체온은 경색의 예상 범위를 생산하지 않을 수 있습니다. 꼬리 정맥을 통해 장미 벵골 (2 ㎖ / kg)을 주입한다. </li><li> 로즈 벵갈 주입 후 90 초 1 분 동안 532 nm의 녹색 레이저를 켭니다. 조사 후, 부드럽게 뇌에서 ONI를 제거합니다. 수술 부위를 청소 한 후, 상처는 3-0 나일론 봉합사로 상처를 고정 확보; 정위 프레임으로부터 래트를 분리 및 회수 챔버로 옮긴다. </li><li> 가짜 운영 그룹 (SOG)의 경우, 대신 로즈 벵갈 식염수의 주입 (0.2 ㎖ / 100g)을 제외하고, 동일한 병변 결정 절차를 수행합니다. </li><li>수술 후 가열 패드, 체온 (37 ℃)을 유지하고, 근육 내 주사를 통해 항생제 (2 세대 세 팔로 스포린, 0.1 %, 1 ml)에 투여. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물에 의해 점유 된 케이지에 수술 후 동물을 반환하지 않습니다. 주 : 예비 실험이 5 mW의 1 mW의 최적의 광 강도를 찾기 위해 동일한 과정을 수행하고, 절차는 다른 상태 병변의 양호 정도를 얻기 위해 요구 될 수있다. </li></ol> 캡슐 경색의 lesioning 3. 평가 <ol><li> 행동 테스트 및 동물 그룹화 <ol><li> Whishaw 등의 알에 의해 설명 된대로 작업에 도달 한 펠릿을 수행합니다. 14 스트로크 모델링 후 1 주간 매일 앞다리의 모터 적자를 평가하기 위해. 하나의 펠렛에 도달 작업을 수행1 폭 cm 슬릿 전벽의 중앙의 정면에있어서의 식품 진열 맑은 플렉시 글라스 (30 X 15 X 35cm 높이)를 이용하여 음식 제한 동물 (SPRT) (대조군 체중의 90 %). </li><li> 바람직한 앞다리에 비스듬히 반대편 음식 선반에 펠렛을 놓습니다. 삼주에 대한 세션 당 20 알약을 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : SPRTs의 성공 수는 동물이 음식 펠렛을 파악하고 그것을 포기하지 않고 입으로 그것을두고있는 범위로 정의된다. </li><li> 다음의 식에 의해 정의된다 성공에 도달의 비율로 점수를 계산한다 : <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" /> 참고 : 우리는 3 그룹으로 동물을 분할 : 가짜 운영 그룹 (SOG), 중간 복구 그룹 (MRG), 가난한 복구 그룹 (PRG). 만약 뇌졸중 후 SPRT 점수&gt; 50 %, 우리는 상당한 병변의 존재를 나타내는 MRG 같은 쥐를 분류하지만, 타 아닌 완전한 파괴rget. 포스트 행정 SPRT 점수가 사전 행정 SPRT 점수에 비해 50 % &lt;있다면, 우리는 대상에서 전체의 lesioning을 나타냅니다 PRG으로 그룹을 분류합니다. </li></ol></li><li> 경색의 lesioning의 Neurohistological 확인 <ol><li> 전술 한 바와 같이 4 % 파라 포름 알데히드와 심장 관류를 수행합니다. 뇌 완전히 30 % 자당 용액 싱크 후, 10 ㎛의 두께 및 마이크로톰 cryotome 또는 4를 사용하여 200 ㎛의 간격으로 관상 절편을 수행한다. </li><li> H &amp; E, Nissl, 룩솔 빠른 블루 PAS, 신경 미세 섬유 단백질-L 또는 폐해 섬유 성 산 단백질 염색 및 조직 학적 소견을 관찰와 얼룩은 염색을 관찰 할 수있는 대상 영역의 내부 캡슐의 전체 폭을 커버 할 수있는 최적의 빛의 강도를 결정하는 4,17. </li><li> ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 뇌 슬라이드 내부 캡슐 photothrombotic 경색 부분의 체적을 측정한다.<ol><li> 경색 부분의 부피를 측정하기 위해, &#39;ImageJ에의 소프트웨어를 실행. 파일을 열려면 선택 &#39;스택에 이미지&#39;( &#39;이미지&#39;→ &#39;스택&#39;→ &#39;스택에 이미지&#39;)를 적층한다. 편집 파일 이름을 선택합니다 규모를 편집 (→ &#39;축척을 설정합니다&#39; &#39;분석&#39;) &#39;축척을 설정합니다&#39;. </li><li> &#39;플러그인&#39;에서 [이미지의 볼륨 또는 면적을 계산하는 &#39;스택을 측정합니다&#39;. &#39;슬라이스 간격&#39;에이 이미지의 거리 간격을 삽입합니다. 모든 이미지의 ROI의 도면 (가볼만한 지역)을 확인하고 &#39;측정&#39;을 클릭합니다. 참고 : 소프트웨어 &#39;ImageJ에&#39;자동 지역과 각 이미지의 볼륨과 그 총량을 계산합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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여기에 제시된 캡슐 경색 모델은 앞다리의 기능에 현저한 및 영구 모터의 손상과 목표 병변을 보여줍니다. 피질 캡슐 스트로크의 이전 모델은 모터의 손상 및 빠른 복구 프로세스 6,8,9의 부족 정도를 증명하고있다. 이런 의미에서,이 모델은 장기 작용 성 손상을 나타내는 임상 캡슐 경색 케이스를 닮았다. 외접 캡슐 경색 모델의 개발에 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 올바르게 내부 캡슐 내에서 기능을 비활성화하기위한 신체 부분의 somatotopic 표현을 식별; 2) 회백질 구조 이웃 최소 침해와 내부 캡슐의 전체 폭을 파괴 할 수있는 그린 레이저의 최적의 강도를 식별하는 단계; 3) 정확히 표적 구조의 광섬유를 배치한다. 제시된 기술은 외접을 유도 할 수 있지만높은 복제 속도 (&gt; 70 %)와 디 캡슐 경색 모델 내부 캡슐의 전체 폭을 덮는 파괴의 완결성의 타겟팅 및 정도의 작은 차이는 상이한 모터 적자 차지하고있다. <p class="...

최근까지 &quot;회백질 스트로크 (GMS) 모델은&quot;배타적 스트로크 기전을 이해하고, 새로운 치료법의 개발을 유도하기 위해 사용되어왔다. 모든 스트로크 1, 2의 25 % - 그러나, (15)를 구성하는 노인 개인에 피질 하 백질에 영향을 미치는 뇌졸중의 증가 보급되고있다. 많은 연구는 백질 스트로크 (WMS) 모델을 사용하고 몇 가지 연구가있는 반면, GMS 모델을 사용에 관한 스트로크를 실시하고있다. 설치류에 흰색 물질은 사람이나 영장류에 흰색 물질보다 훨씬 작다. 따라서, 선택적 백질 3 목표 영역을 액세스하고 파괴하는 것이 더 어렵다. 게다가, 더 효율적인 툴을 선택적으로 타겟팅 백질의 계획된 범위를 파괴하는 최신 개발되지 않았다. 따라서, 백질 스트로크의 연구에 적합한 모델의 부족이 있었다. 동물 일roke 모델은 종종 새로운 재활 및 치료 방법의 개발을위한 모터 회복의 진행을 모니터하기 위해 사용된다. 인간의 행정 4,5에서 보여준 해부학 적 변화와 조화 된 장기적인 신경 학적 결손을 나타내는 동물 모델을 활용하는 것이 이상적이다. 이와 관련하여, 모터 적자 및 뇌 다음 경색의 lesioning의 폭 넓은 참여의 신속한 복구 뇌졸중 연구의 추구 현실적인하지 않을 수 있습니다. 이전 캡슐 경색 모델 내부 캡슐 6-9으로 엔도 텔린 -1 (ET-1)의 내부 경동맥 또는 전방 맥락막 혈관 및 확산에 의해 폐색되었다. 그럼에도 불구하고, 동맥 폐쇄 동맥 절개주의를 필요로하지만, 영구 행동 결손없이 내부 캡슐 포함 경색 병변의 넓은 영역을 생성한다. 또한 ET-1을 완전히 캡슐 내부의 후방 다리를 파괴 확산하고, 따라서 적은 표시되거나 BEH을 지속하지 않았다avioral 적자. photothrombotic 경색 모델 널리 피질 경색 병변 및 피질 하 구조 (10)의 다양한 형태를 생성하는 데 사용되어왔다. 이 기술은 경색 병변 (10)의 혈소판 작은 혈관에서 응집 및 생성에 이르게 초점 조명, 다음 정맥 내 투여를 포함한다. 거의 WMS 병변 5,11 생성에 사용되지 않은 반면 Photothrombotic 기술은 광범위 GMS 병변을 만드는 데 사용되고있다. 이 기술의 경우, 로즈 벵갈 염료 및 광 조사의 조합 기능 결핍을 유발 해당 대상 구조의 파괴에 유용한 것으로 입증되었다. 이 경색 병변의 크기를 결정하므로 photothrombotic 기술의 핵심 요소는 광 조사한다. 회색질과 백색질의 다른 효과에 광 조사 결과, 빛의 산란이 흰색 mA 이상 4 배 높기 때문에회색 물질 (12)와 비교 라 자세 히; 빛의 세기가 충분히 낮은 조도 (&lt;1140 mW의 / mm 2)이있는 경우 따라서, 하나는 photothrombotic 병변이 백질에 어느 정도 영향을 미칠하는 확장을 제한 할 수 있습니다 (예. 내부 캡슐). 예를 들어, 높은 에너지의 빛이 모두 회색과 흰색 문제에 경색을 유도 할 수있다, 그러나 낮은 에너지의 빛은 흰색 만에 photothrombosis을 유도 할 수있다. 또한, 광 에너지의 침투가 매우 제한적이었다. 빛 에너지의 약 99 %는 빛 (13)의 소스에서 1mm 이상 끊어졌습니다. 따라서, 정확하게 대상 것으로 예상된다, 낮은 에너지의 빛은 이웃 회색 물질의 최소 침해와 흰색 문제에 photothrombosis을 유도한다. 여기서는 설치류 내부 캡슐의 앞다리 영역 경색 병변을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 우리는 내부 CA의 앞다리 영역의 동정 방법을 서술psule, 조정 및 빛의 전달 및 경색 병변의 발생을 포함하여 광 조사의 기술. 또한 캡슐 모델링의 완전성을 평가하는 행동 시험을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>DC 온도 컨트롤러</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td></td><td></td>ATC1000</tr><tr><td>디지털 입체 계측기</td><td>STOELTING CO.</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>전기 자극기</td><td>CyberMedic Corp.</td><td>EMGFES 2000</td><td></td></tr><tr><td>에폭시&nbsp;</td><td>정밀 섬유 제품, INC.</td><td>PFP-353ND1</td><td>혼합 비율: 10(A):1(B-경화제) 중량별&nbsp; 경화 일정 : 1 분 @ 150 &deg; C 2 ~ 5 분 @120 &deg; C 5 ~ 10 분 @100 &deg; C 15 ~ 30 분 @80 &deg; C</td></tr><tr><td>광섬유 스크라이브&nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 패치 케이블</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>외경: 3 mm &Oslash; 200 &마이크로; m 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1m</td></tr><tr><td>레이저 전원 공급 장치</td><td>CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>크림프 링&nbsp;</td><td>(주)다우텍</td><td></td><td>길이 : 19 mm 내경 : 3 mm 외경 : 3.8 mm 재질 : SUS</td></tr><tr><td>Micro4-micro 주사기 펌프 컨트롤러</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>광 파워 미터</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 래핑 (연마) 시트</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D</td><td>그릿 : 3 &micro; m</td></tr><tr><td>다이아몬드 래핑(연마) 시트</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>그릿 : 6 &마이크로; m</td></tr><tr><td>로즈 벵골</td><td>SIGMA-ALDRICH CO., LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>연필 끝이 있는 척추 마취용 바늘(척추 바늘)&nbsp;</td><td>B.브라운 멜숭겐 AG&nbsp;</td><td>4502027</td><td>크기: 27 G 길이: 88 mm 바늘: 0.40 mm</td></tr><tr><td>방수 사포&nbsp;</td><td>DEERFOS CO., LTD</td><td>CC261</td><td>그릿 : 1,000 & 마이크로; m</td></tr><tr><td>나노필 10&nbsp; &마이크로; l 주사기</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td> 나노필 <td></td></tr><tr><td>33&nbsp; G BVLD 바늘</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV-GFP 바이러스</td><td>UNC 벡터 코어</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 1012 바이러스 분자/ml</td></tr><tr><td>안티 그린 형광 단백질, 토끼 IgG 분획</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11122</td><td>1차 항체 (1:200)</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>2차 항체 항체 (1:500)</td></tr><tr><td>Ceftezole</td><td>GUJU Pharma CO.,LTD.</td><td>A27802741</td><td>0.1%, 1ml</td></tr><tr><td>리도카인 염산염 주사</td><td>제일제약</td><td>A04900271</td><td>2%, 1ml</td></tr><tr><td>핸드 피스 드릴</td><td>Seshin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털 광학 전력 및 에너지 미터</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>케토프로펜</td><td>UNIBIOTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

최근 백질 뇌졸중 유병률이 증가함에 따라 해당 분야의 구체적인 연구가 필요합니다. 그러나 백질 뇌졸중에 대한 적절한 동물 모델이 부족하여 연구 조사가 방해를 받았습니다. 여기에서는 인접한 회백질 구조에 대한 손상을 최소화하는 외접 캡슐 경색을 만드는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 아데노 관련 바이러스-녹색 형광 단백질(AAV-GFP)을 사용한 수술 전 신경 추적을 사용하여 내부 캡슐 내 앞다리 영역의 체성 조직을 확인했습니다. 회백질과 백질의 서로 다른 광학적 특성에 따른 광도의 조정은 회백질의 상대적 보존과 함께 백질의 선택적 파괴에 기여합니다. 광학 신경 인터페이스의 정확한 배치는 내부 캡슐의 전체 앞다리 영역을 파괴할 수 있으며, 이는 현저하고 지속적인 운동 결핍으로 이어집니다. 따라서 이 기술은 지속적인 운동 결핍을 동반한 매우 복제 가능한 구형경색 병변을 생성합니다. 이 모델은 행동, 회로 및 세포 수준에서 백질 뇌졸중(WMS)을 연구하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 새로운 치료 및 재활 중재 개발에 대한 유용성을 평가하는 데에도 도움이 될 것입니다.

여기에 제시된 방법은 영구 모터 적자와 외접 캡슐 경색을 만들 것입니다. 따라서, 정확하게 예비 수술 단계에서 내부 캡슐 내에 타겟을 결정하는데 중요하다. 내부 캡슐의 피라미드 섬유의 somatotopic 매핑은 현재까지 해결되지 않았습니다. 제대로 내부 캡슐 내에서 대상을 식별하기 위해, 앞다리 영역을 묘사해야합니다. 운동 피질의 앞다리 영역으로 AAV-GFP의 주입 내부 캡슐 (도 1)에 피라미드 형 섬유의 축삭을 추적 할 수있다. 예컨대 비오틴 덱스 아민 (BDA)와 같은 다른 신경 추적자를 동일한 사용될 수있다 목적. 내부 캡슐 내의 타겟의 정위 좌표는 내부 캡슐 운동 피질의 앞다리 영역에서 발생 축삭 돌기를 추적함으로써 설명 될 수있다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 1" ...

이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑​​ 후 빛의 낮은 강도와​​ 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다.

Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

본 기술의 전반적인 목표는 광혈전술(photothrombotic technique)을 이용하여 지속적인 운동 장애를 동반한 국소적 내포 infarct 모델을 구축하는 것입니다. 내포 infarct를 유도하기 전, 운동 피질의 전지(forelimb) 영역에 GFP를 발현하는 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus)를 주입하여 내포 내의 전지 영역을 식별해야 합니다. 먼저 마취된 쥐를 정위 고정대(stereotaxic frame)에 배치하는 것으로 시작하십시오.그런 다음 쥐의 머리를 삭모하고 70% alcohol과 포비돈 및 요오드 용액을 사용하여 두피를 소독합니다. 수술 중 통증을 줄이기 위해 예정된 두피 절개 부위의 두피 아래에 2% lidocaine hydro chloride를 주입합니다. 안구 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다.그런 다음 동물 위에 멸균 드레이프를 덮습니다. 두피에 2cm 길이의 정중선 절개를 한 후, 뇌정위 좌표에 따라 운동 피질의 전지 영역을 확인하도록 뇌정위 고정 장치의 암을 배치합니다. 이 위치에 진입 구멍을 드릴로 뚫습니다.바늘을 드릴로 뚫은 구멍으로 이동시킨 후, 경질막을 지나 운동 피질까지 1 mm 깊이로 내립니다. 고정밀 마이크로 펌프를 사용하여 바이러스 1 µL를 천천히 주입합니다. 바늘 경로를 통한 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 그대로 둡니다.10분이 경과하면 바늘을 천천히 뽑아냅니다. 식염수 세척으로 수술 부위를 깨끗이 한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처 부위를 봉합합니다. 그런 다음 쥐를 뇌정위 고정틀에서 분리하여 모니터링을 위해 회복실로 옮깁니다.수술 후 통증 조절을 위해 진통제를 투여합니다. 2~3주 후, 승인된 방법에 따라 쥐를 희생시키고 동결 보호 처리된 뇌 조직을 절편화합니다. GFP 염색 후, 형광 현미경을 사용하여 내포(internal capsule) 내의 AAV-GFP 형질전환 축삭을 관찰합니다.형광 이미지에서 관찰되는 형질전환된 축삭의 위치를 쥐 뇌 지도(rat brain atlas)와 비교하여, 형질전환된 축삭의 정위 좌표를 정확하게 결정합니다. 광학 신경 인터페이스를 준비하려면, 먼저 커팅 드릴을 사용하여 스타일렛이 삽입된 27 gauge 척수 바늘을 약 4cm 길이로 자릅니다. 그런 다음 광섬유의 재킷을 10cm 길이로 벗겨냅니다.피복이 없는 광섬유 조각을 금속 튜브에 삽입하십시오. 그리고 튜브를 광섬유 주위에 고정하십시오. 그 다음 프레스를 사용하여 금속 튜브의 하단 1/2 부분을 두 번 압착하십시오.금속 튜브가 광섬유와 척수 바늘 허브 사이의 공간을 채웁니다. 광섬유에 열경화성 에폭시를 도포합니다. 허브의 빈 공간에 에폭시를 추가로 도포합니다.그리고 척수 바늘 안에 광섬유를 삽입합니다. 안정적인 고정을 위해 100 °C에서 20분 동안 에폭시를 경화시킵니다. 경화가 완료되면 척수 바늘 밖으로 돌출된 광섬유를 절단한 후, 다이아몬드 래핑 시트를 사용하여 척수 바늘 끝단의 광섬유를 연마합니다.마지막으로, 패치 코드의 FCPC 커넥터 부분을 그린 레이저 시스템의 커플러에 연결합니다. 그런 다음 디지털 광 파워 및 에너지 미터를 사용하여 광섬유 끝단에서의 빛 강도를 측정함으로써 빛이 정확하게 방출되는지 확인합니다. 수술 전 과정 동안 체온을 37.5 °C로 유지하기 위해 동물의 몸 아래에 히트 패드를 배치합니다.이전과 동일하게 쥐를 마취하고 수술 준비를 시작합니다. 2cm 길이의 정중선 절개를 한 후, Bregma와 Lambda가 동일한 높이에 올 때까지 코 클램프의 높이를 조정합니다. 정확한 정렬은 내포(internal capsule)를 정확하게 타겟팅하는 데 매우 중요합니다.광혈전증 유도 부위를 정하기 위해 정위 고정 장치의 암(arm)을 배치합니다. 그 다음, 해당 지점에 2mm 구멍을 뚫습니다. 이어서 ONI의 광섬유 팁을 연마하고 세척한 후, 굴곡이 생기지 않도록 정위 고정 프레임에 고정합니다.ONI 팁이 깨끗하고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 광 인터페이스를 쥐 뇌의 표적 부위에 삽입하기 전, 광섬유 팁에서의 레이저 강도를 측정하십시오. 광섬유 팁에서의 레이저 강도를 3.5 milliwatts로 조정하십시오.이제 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 결정한 등쪽-배쪽(dorsoventral) 좌표를 사용하여 ONI를 내포(internal capsule)의 표적 영역으로 내립니다. 그런 다음, 꼬리 정맥을 통해 kg당 2 mg의 Rose Bengal을 주입하고 1분으로 설정된 카운트다운 타이머를 시작합니다. 1분이 경과하면, 532 nm 녹색 레이저를 90초 동안 조사하여 경색을 유도합니다.방사선 조사가 끝나면 뇌에서 ONI를 조심스럽게 제거합니다. 수술 부위를 세척한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처 부위를 고정합니다. 그런 다음 쥐를 정위 고정 장치에서 분리하여 회복실로 옮깁니다.이 이미지는 광혈전성 병변 유도 2주 후, 2mW에서 5mW까지 다양한 강도의 레이저 광에 따른 경색 병변의 범위를 보여줍니다. 화살표는 경색 병변을 나타냅니다. 본 실험 설정에서 광학 강도는 3mW에서 4mW 사이인 것으로 간주됩니다.다음 두 이미지는 광혈전증 유도 3주 후 캡슐 경색의 현미경적 모습을 보여줍니다. 쥐 뇌의 이 관상면 절단면에서 화살표 머리는 시상에서 내포까지 이어지는 광섬유 삽입 바늘의 경로를 나타냅니다. 이 연속적으로 염색된 절단면들은 내포 내 경색 병변의 범위를 보여줍니다.화살표는 경색 병변을 나타냅니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

이 비디오는 감광성 염료 투여 후 손상되지 않은 두개골의 레이저 조명으로 마우스 모델에서 광혈전 스트로크를 생성하는 절차를 보여줍니다.

마우스 모델의 광혈전성 스트로크 모델링: 광혈전증을 유발하기 위해 감광성 염료 투여 후 마우스 두개골을 통한 레이저 조명 기술

Photothrombosis 매우 재현성 방식으로 관심 분야의 작은 잘 구분 경색을 유도하기위한 빠르고, 최소 침습 기술입니다. 그것은 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

여기에서는 생체 내 마우스의 체성 감각 피질에서 Rose Bengal 광혈전 혈전을 유도하기 위한 반침습적 광학 현미경 접근 방식을 설명합니다.  이미징 절차의 기술적 측면은 광혈전 이벤트의 유도에서 적용 및 데이터 수집에 이르기까지 설명됩니다.

공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis<em&gt; 생체</em&gt; : 단일 선박 스트로크의 모델

광혈전증은 척수에 국소 허혈을 유발하는 최소 침습적이고 재현성이 높은 시술이며 생쥐의 척수 손상 모델 역할을 합니다.

쥐의 척수 손상의 모델로 초점 국소 빈혈을 Photothrombosis는 유도

이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.

직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영

뇌졸중은 최소한의 치료 옵션과 잃어버린 뇌 조직을 재생하기위한 현재 임상 치료와 글로벌 문제입니다. 여기에서 우리는 설치류의 모터 피질에 정확한 광혈전 뇌졸중을 만들고 뇌졸중 후 조직 재생에 미치는 영향을 연구하기 위해 하이드로 겔 생체 재료의 후속 주입을 만드는 방법을 설명합니다.

하이드로겔 생체 재료 비계의 주입 뇌졸중 후 뇌에

기존의 광혈전제 뇌졸중(PTS) 모델은 주로 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 용해 치료에 대한 내성이 높은 고밀도 혈소판 응집체를 유도합니다. 여기서 변형된 쥐 PTS 모델은 광활성화를 위해 트롬빈과 감광성 염료를 함께 주입하여 도입됩니다. 트롬빈 강화 PTS 모델은 혼합 혈소판:피브린 응고를 생성하며 tPA 혈전용해에 매우 민감합니다.

피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

여기에 설명된 광혈증 뇌졸중 모델은 감광성 염료투여 후 레이저 조명을 이용하여 영구 미생물 폐색을 유도하여 손상되지 않은 두개골을 통해 뇌졸중이 생성된다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

모든 광학 접근 방식을 사용하여 허혈성 뇌졸중을 유도하는 동시에 깨어 있고 행동하는 마우스의 새로운 뇌졸중 코어에서 형광 바이오센서를 사용하여 신경 Ca2+ 활동을 기록합니다.

행동하는 마우스에서 허혈성 뇌졸중을 유도하고 모니터링하기 위한 동시 광혈전증 및 섬유 측광

이 프로토콜은 바이러스 전달, 광혈전 이식, 광혈전 유도, 성상교세포 및 신경세포 활동의 동시 기록, 성상교세포의 광유전학적 자극을 포함하는 통합 방법을 제공합니다. 이 통합 방법은 허혈성 뇌졸중의 급성기부터 만성기까지의 성상교세포-뉴런 관계를 동시 조사하는 것을 목표로 합니다.

광혈전성 뇌졸중 모델링과 행동하는 쥐의 신경 및 성상세포 활동의 생체 내 옵트로드 기록을 위한 통합 방법

학습하세요 수정된 광혈전 기술을 이용하여 캡슐 경색 모델을 만드는 방법을. 이 기법은 지속적인 운동 장애를 유발하는 정확한 내부 캡슐 표적화를 가능하게 하며, 쥐를 사용하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

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