2016년 6월 2일
이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑 후 빛의 낮은 강도와 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다.
이 기술의 전반적인 목표는 광혈전성 기술을 사용하여 지속적인 운동 장애가 있는 외접 캡슐 경색 모델을 만드는 것입니다. 수정체 경색(capsular infarct)을 만들기 전에, GFP를 발현하는 아데노 관련 바이러스를 운동 피질의 앞다리 부위에 도입하여 내부 캡슐의 앞다리 부위를 확인해야 합니다. 마취된 쥐를 입위 안경테에 넣는 것으로 시작합니다.
그런 다음 쥐의 머리를 면도하고 70% 알코올과 포비돈 및 요오드 용액을 사용하여 두피를 살균합니다. 수술 중 통증을 줄이기 위해 의도한 두피 절개 부위의 두피 아래에 2%의 리도카인 하이드로 클로라이드를 주사합니다. 안구 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
그리고 동물 위에 멸균 커튼을 씌웁니다. 두피에서 2cm의 정중선을 절개한 후 입위 좌표에 따라 운동 피질의 앞다리 영역을 식별하기 위해 입위 팔을 배치합니다. 이 위치에 입구 구멍을 뚫습니다.
바늘을 뚫린 구멍으로 옮기고 바늘을 경막을 통해 운동 피질로 1mm 내립니다. 고정밀 마이크로 펌프를 사용하여 1마이크로 리터의 바이러스를 천천히 주입합니다. 바늘을 10분 더 제자리에 두어 바늘관으로 역류하는 것을 방지합니다.
10분이 지나면 천천히 바늘을 빼냅니다. 식염수 세척으로 수술 부위를 청소한 후 3-0 나일론 봉합사로 상처를 고정합니다. 그런 다음 입체성 프레임에서 쥐를 풀어주고 모니터링을 위해 회수실로 옮깁니다.
수술 후 통증 조절을 위해 진통제를 투여합니다. 2-3주 후, 승인된 방법에 따라 쥐를 희생시키고 냉동 보호된 뇌를 절편화합니다. GFP를 염색한 후 형광 현미경으로 내부 캡슐에서 AAV-GFP 형질 주입 축삭을 관찰합니다.
형광 이미지에서 볼 수 있는 형질도입된 축삭돌기의 위치를 쥐 뇌 지도(rat brain atlas)와 비교하여 형질도입된 축삭돌기의 입체성 좌표를 정확하게 결정합니다. 광학 신경 인터페이스를 준비하려면 먼저 절단 드릴을 사용하여 내부에 탐침이 있는 27게이지 척추 바늘 중 약 4cm를 절단합니다. 그런 다음 광섬유 재킷을 10cm 벗겨냅니다.
광섬유의 재킷이 없는 부분을 금속 튜브에 삽입합니다. 그리고 섬유 주위에 튜브를 고정합니다. 그런 다음 노루를 사용하여 clamp 금속 튜브의 아래쪽 1/2을 두 번 누릅니다.
금속 튜브는 광섬유와 척추 바늘의 허브 사이의 공간을 채웁니다. 광섬유에 열경화 에폭시를 도포합니다. 허브의 빈 공간에 에폭시를 추가로 바르십시오.
그리고 광섬유를 척추 바늘에 삽입합니다. 안정적인 고정을 위해 섭씨 100도에서 20분 동안 에폭시를 경화시킵니다. 경화되면 척추 바늘에서 튀어나온 광섬유를 절단한 다음 다이아몬드 래핑 시트를 사용하여 척추 바늘 끝의 광섬유를 연마합니다.
마지막으로 패치 코드의 FCPC 커넥터 부분을 녹색 레이저 시스템의 커플러에 연결합니다. 그런 다음 디지털 광 전력 및 에너지 미터를 사용하여 광섬유 끝에서 광도를 측정하여 정확한 광 방출을 보장합니다. 동물의 몸 아래에 열 패드를 놓아 체온을 섭씨 37.5도로 유지한다고 수술은 생각했습니다.
이전과 같이 쥐를 마취하고 수술을 준비하는 것으로 시작하십시오. 2cm의 정중선 절개 후 Bregma와 Lambda가 같은 높이로 정렬될 때까지 코 클램프의 높이를 조정합니다. 내부 캡슐을 올바르게 타겟팅하려면 올바른 정렬이 중요합니다.
광혈전증이 있는 부위를 찾기 위해 입체성 암을 배치합니다. 그런 다음 이 시점에서 2mm 구멍을 뚫습니다. 다음으로, ONI의 광섬유 팁을 연마하고 청소한 다음 구부리지 않고 입체 프레임에 고정합니다.
ONI의 끝이 깨끗하고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 쥐 뇌의 목표 부위까지 광학 인터페이스를 삽입하기 전에 광섬유 끝에서 레이저 강도를 측정합니다. 광섬유 끝에서 레이저 강도를 3.5밀리와트로 조정합니다.
이제, 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 결정된 배복부 좌표를 사용하여 ONI를 내부 캡슐의 목표 영역으로 내립니다. 그런 다음 꼬리 정맥을 통해 킬로그램당 2mg의 로즈 벵골을 주입한 다음 1분으로 설정된 카운트다운 타이머를 시작합니다. 분이 지나면 532나노미터의 녹색 레이저를 90초 동안 켜서 경색을 만듭니다.
방사선 촬영 후 뇌에서 ONI를 부드럽게 제거합니다. 수술 부위를 청소한 후 3-0 나일론 봉합사로 상처를 고정합니다. 그런 다음 입체 액자에서 쥐를 제거하고 회수 챔버로 옮깁니다.
이 이미지는 광혈전성 병변 발생 2주 후 2밀리와트에서 5밀리와트까지 다양한 강도의 레이저 광에 걸친 경색 병변의 정도를 보여줍니다. 화살표는 경색 병변을 나타냅니다. 광학 광도는 이 실험 환경에서 3밀리와트에서 4밀리와트 사이로 간주됩니다.
다음 두 이미지는 광혈전증 후 3주 후의 구형경색의 현미경 모습을 보여줍니다. 쥐 뇌의 이 관상 절편에서 화살촉은 시상에 있는 광섬유를 포함하는 바늘의 관과 내부 캡슐까지의 위치를 나타냅니다. 이 연속적으로 자리 잡은 염색 된 부분은 내부 캡슐의 경색 병변 정도를 보여줍니다.
화살표는 경색 병변을 나타냅니다.
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이 원고는 변형된 광혈전술을 사용한 캡슐 경색의 모델링 기술을 설명합니다. 이 접근법은 지속적인 운동 장애를 초래하는 한정된 캡슐 경색 모델의 생성을 가능하게 합니다.
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.