Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

본 기술의 전반적인 목표는 광혈전술(photothrombotic technique)을 이용하여 지속적인 운동 장애를 동반한 국소적 내포 infarct 모델을 구축하는 것입니다. 내포 infarct를 유도하기 전, 운동 피질의 전지(forelimb) 영역에 GFP를 발현하는 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus)를 주입하여 내포 내의 전지 영역을 식별해야 합니다. 먼저 마취된 쥐를 정위 고정대(stereotaxic frame)에 배치하는 것으로 시작하십시오.

그런 다음 쥐의 머리를 삭모하고 70% alcohol과 포비돈 및 요오드 용액을 사용하여 두피를 소독합니다. 수술 중 통증을 줄이기 위해 예정된 두피 절개 부위의 두피 아래에 2% lidocaine hydro chloride를 주입합니다. 안구 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다.

그런 다음 동물 위에 멸균 드레이프를 덮습니다. 두피에 2cm 길이의 정중선 절개를 한 후, 뇌정위 좌표에 따라 운동 피질의 전지 영역을 확인하도록 뇌정위 고정 장치의 암을 배치합니다. 이 위치에 진입 구멍을 드릴로 뚫습니다.

바늘을 드릴로 뚫은 구멍으로 이동시킨 후, 경질막을 지나 운동 피질까지 1 mm 깊이로 내립니다. 고정밀 마이크로 펌프를 사용하여 바이러스 1 µL를 천천히 주입합니다. 바늘 경로를 통한 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 그대로 둡니다.

10분이 경과하면 바늘을 천천히 뽑아냅니다. 식염수 세척으로 수술 부위를 깨끗이 한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처 부위를 봉합합니다. 그런 다음 쥐를 뇌정위 고정틀에서 분리하여 모니터링을 위해 회복실로 옮깁니다.

수술 후 통증 조절을 위해 진통제를 투여합니다. 2~3주 후, 승인된 방법에 따라 쥐를 희생시키고 동결 보호 처리된 뇌 조직을 절편화합니다. GFP 염색 후, 형광 현미경을 사용하여 내포(internal capsule) 내의 AAV-GFP 형질전환 축삭을 관찰합니다.

형광 이미지에서 관찰되는 형질전환된 축삭의 위치를 쥐 뇌 지도(rat brain atlas)와 비교하여, 형질전환된 축삭의 정위 좌표를 정확하게 결정합니다. 광학 신경 인터페이스를 준비하려면, 먼저 커팅 드릴을 사용하여 스타일렛이 삽입된 27 gauge 척수 바늘을 약 4cm 길이로 자릅니다. 그런 다음 광섬유의 재킷을 10cm 길이로 벗겨냅니다.

피복이 없는 광섬유 조각을 금속 튜브에 삽입하십시오. 그리고 튜브를 광섬유 주위에 고정하십시오. 그 다음 프레스를 사용하여 금속 튜브의 하단 1/2 부분을 두 번 압착하십시오.

금속 튜브가 광섬유와 척수 바늘 허브 사이의 공간을 채웁니다. 광섬유에 열경화성 에폭시를 도포합니다. 허브의 빈 공간에 에폭시를 추가로 도포합니다.

그리고 척수 바늘 안에 광섬유를 삽입합니다. 안정적인 고정을 위해 100 °C에서 20분 동안 에폭시를 경화시킵니다. 경화가 완료되면 척수 바늘 밖으로 돌출된 광섬유를 절단한 후, 다이아몬드 래핑 시트를 사용하여 척수 바늘 끝단의 광섬유를 연마합니다.

마지막으로, 패치 코드의 FCPC 커넥터 부분을 그린 레이저 시스템의 커플러에 연결합니다. 그런 다음 디지털 광 파워 및 에너지 미터를 사용하여 광섬유 끝단에서의 빛 강도를 측정함으로써 빛이 정확하게 방출되는지 확인합니다. 수술 전 과정 동안 체온을 37.5 °C로 유지하기 위해 동물의 몸 아래에 히트 패드를 배치합니다.

이전과 동일하게 쥐를 마취하고 수술 준비를 시작합니다. 2cm 길이의 정중선 절개를 한 후, Bregma와 Lambda가 동일한 높이에 올 때까지 코 클램프의 높이를 조정합니다. 정확한 정렬은 내포(internal capsule)를 정확하게 타겟팅하는 데 매우 중요합니다.

광혈전증 유도 부위를 정하기 위해 정위 고정 장치의 암(arm)을 배치합니다. 그 다음, 해당 지점에 2mm 구멍을 뚫습니다. 이어서 ONI의 광섬유 팁을 연마하고 세척한 후, 굴곡이 생기지 않도록 정위 고정 프레임에 고정합니다.

ONI 팁이 깨끗하고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 광 인터페이스를 쥐 뇌의 표적 부위에 삽입하기 전, 광섬유 팁에서의 레이저 강도를 측정하십시오. 광섬유 팁에서의 레이저 강도를 3.5 milliwatts로 조정하십시오.

이제 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 결정한 등쪽-배쪽(dorsoventral) 좌표를 사용하여 ONI를 내포(internal capsule)의 표적 영역으로 내립니다. 그런 다음, 꼬리 정맥을 통해 kg당 2 mg의 Rose Bengal을 주입하고 1분으로 설정된 카운트다운 타이머를 시작합니다. 1분이 경과하면, 532 nm 녹색 레이저를 90초 동안 조사하여 경색을 유도합니다.

방사선 조사가 끝나면 뇌에서 ONI를 조심스럽게 제거합니다. 수술 부위를 세척한 후, 3-0 나일론 봉합사로 상처 부위를 고정합니다. 그런 다음 쥐를 정위 고정 장치에서 분리하여 회복실로 옮깁니다.

이 이미지는 광혈전성 병변 유도 2주 후, 2mW에서 5mW까지 다양한 강도의 레이저 광에 따른 경색 병변의 범위를 보여줍니다. 화살표는 경색 병변을 나타냅니다. 본 실험 설정에서 광학 강도는 3mW에서 4mW 사이인 것으로 간주됩니다.

다음 두 이미지는 광혈전증 유도 3주 후 캡슐 경색의 현미경적 모습을 보여줍니다. 쥐 뇌의 이 관상면 절단면에서 화살표 머리는 시상에서 내포까지 이어지는 광섬유 삽입 바늘의 경로를 나타냅니다. 이 연속적으로 염색된 절단면들은 내포 내 경색 병변의 범위를 보여줍니다.

화살표는 경색 병변을 나타냅니다.