자기장 (GMF)과 식물 진화 : GMF 반전의 효과에 대한 조사

이 실험 과정의 전반적인 목적은 전원 공급 장치로 제어되는 헬름홀츠 코일을 사용하여 지구 자기장(GMF)의 역전을 구현하는 것입니다. 최종적으로, GMF 역전이 식물의 형태와 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 지구 자기장의 역전이 식물의 진화와 적응에 역할을 했을 가능성과 같이 식물 진화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 정밀하게 제어된 조건 하에 많은 반복 실험군을 배양할 수 있는 단순한 모델 생물체에서 약한 자기장의 잠재적인 생물학적 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 지도 학생인 Alberto Bocco와 제 연구실의 박사 과정 학생인 Kiara aa, 그리고 저희 그룹의 부교수인 CIA Bertea가 진행하겠습니다.

우선 3쌍의 헬름홀츠 코일(Helmholtz Coil)에 연결된 3개의 DC 전원 공급 장치를 켜고, 3축 코일 내부에 프로브가 삽입된 3축 자력계를 켭니다. 컴퓨터를 켜고 3축 자력계로부터 데이터를 수집할 수 있는 자력계 소프트웨어를 실행합니다. 전원 공급 장치들은 제어를 위해 A-G-P-I-B 연결을 통해 컴퓨터에 연결되어 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 역자기장 벡터를 가진 원하는 자기장을 생성하도록 전원 공급 장치의 전압을 설정합니다. 25~28 °C에서 지속적으로 흔들어주며 차아염소산칼슘 용액으로 10~12분 동안 처리하여 멸균한 Arabidopsis Aliana ecotype Columbia, zero 씨앗을 1.5 mL 튜브 표면에 넣습니다. 그런 다음 씨앗을 80% ethanol로 두 번 헹구고, 이어서 100% ethanol로 세척합니다.

마지막으로, 멸균 증류수로 헹굽니다. 고형화하기 전, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 Murrah Shiga 및 SCOG 변형 배지 1리터를 준비합니다. 각 사각 페트리 접시에 배지 80밀리리터를 붓고, 접시당 30개의 멸균 종자를 배치합니다.

그 다음 왁스 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 발아를 촉진하고 동기화하기 위해 플레이트를 4 °C의 암조건에서 수평으로 2일 동안 춘화 처리합니다. 춘화 처리 후, 나트륨 증기 램프의 적색 성분을 줄이기 위해 스포트라이트를 청색 젤라틴 필름으로 덮어 준비합니다.

페트리 접시를 일반 또는 역전된 GMF에 노출시킬 준비를 합니다. 22 °C의 온도 조절 환경에서 씨앗을 수직 상태로 노출시킵니다. 삼축 코일 외부와 내부 모두에서 병행 실험을 수행합니다.

8시간의 암기 및 16시간의 명기로 구성된 광주기 일정 하에 둡니다. 노출 후, 페트리 접시의 사진을 촬영하여 뿌리 길이와 잎 면적을 계산합니다. 먼저, 페트리 접시의 한 변의 길이를 측정합니다.

그 다음 Image J 소프트웨어에서 페트리 접시 이미지를 열고, 직선(straight line) 옵션을 사용하여 접시 측면을 정확하게 가로지르는 선을 긋습니다. Analyze 메뉴에서 Set Scale을 선택하고, Known Distance 상자에 실제 거리를 입력합니다. 그런 다음 길이 단위를 입력합니다.

마지막으로 글로벌 옵션을 클릭하여 설정 내용을 모든 뿌리 길이 측정에 적용합니다. 프리핸드 도구를 사용하여 뿌리의 형태를 주의 깊게 따라갑니다. 분석 메뉴의 측정 옵션을 사용하여 길이를 측정합니다.

사진 속의 모든 뿌리 측정을 계속 진행하고, 추후 통계 분석을 위해 파일을 저장하십시오. 이미지 메뉴에서 잎 면적을 측정하려면, adjust 옵션을 사용한 후 color threshold를 선택하여 개별 잎을 지정하고, analyze 메뉴에서 analyze particles를 선택하여 개별 측정값을 통계 분석용으로 저장하십시오. 슈트(shoot) 30개와 뿌리 30개를 각각 수집하여 즉시 액체 질소에 급속 냉동하십시오.

그런 다음 막자와 막자사발을 사용하여 액체 질소에서 갈아준 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 총 RNA를 분리합니다. 모든 실험은 내부 로딩 표준 물질로 ROX가 포함된 Cyber Green One을 사용하여 실시간 시스템에서 수행하며, 반응은 25 µL 혼합물로 진행합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 프라이머를 사용하고, 게놈 DNA 오염을 모니터링하기 위한 역전사 미포함 대조군과 템플릿 미포함 대조군을 포함시킵니다. 각 어닐링 및 신장 단계 후에 형광을 측정합니다.

두 개의 돋보기 아이콘은 무릎 및 해리 곡선을 포함하여 수집된 데이터를 나타냅니다. 분석 및 설정 화면으로 이동하여 실험의 해리 구간 동안 수집된 데이터 세트가 선택되었는지 확인하십시오. 모든 런(run)의 분석을 위해, 열 프로파일에 해리 구간을 포함시켜 55에서 95 °C까지의 용융 곡선 분석을 수행하십시오.

결과 탭을 통해 접속 가능한 해리 곡선 화면을 사용하여 해리 프로파일을 확인하십시오. 실시간 PCR 기기 소프트웨어로 모든 증폭 플롯을 분석하십시오.

CT 값을 얻으려면, 가장 적합한 하우스키핑 유전자의 수준을 이용하여 상대적 RNA 수준을 보정하고 표준화하십시오. 결과 탭을 통해 증폭 플롯 화면에 접속하십시오. 분석, 선택 및 설정 화면을 사용하여 데이터를 분석할 램프(ramp) 또는 플래토(plateau) 영역을 선택하십시오.

그런 다음 명령 패널의 형광 메뉴에서 기선 보정된 정규화 형광(baseline corrected normalized fluorescence)을 선택하십시오. 결과 탭을 통해 플레이트 샘플 값 화면에 접속하여, 샘플링된 웰의 CT 값을 표시하십시오.

실시간 PCR 결과를 정규화하기 위해 네 가지의 서로 다른 참조 유전자를 사용하십시오. 분석 소프트웨어를 사용하여 가장 순위가 높은 유전자를 선택하고, 가장 안정적인 유전자를 정규화에 사용하십시오. 첫 번째 열에는 유전자 이름을, 첫 번째 행에는 샘플 이름을 입력하여 엑셀 시트에 입력 데이터를 간략하게 정리하십시오.

그런 다음 메뉴 바에서 분석 소프트웨어를 선택하십시오. 대화 상자를 사용하여 입력 데이터를 선택합니다. 다음으로 시료 이름, 유전자 이름 및 단순 출력 전용 필드를 확인하십시오.

분석을 수행하려면 go 버튼을 클릭하십시오. 가장 안정적으로 발현되는 후보 유전자로 최상위 순위의 유전자를 선택하십시오. 10일간의 노출 후, 대조군 식물은 역전된 GMF 조건에 10일간 노출된 식물에 비해 뿌리 길이가 유의하게 더 길고 소엽이 더 확장된 모습을 보입니다. GMF 역전의 효과는 crucifer in three copper transport protein one 및 redox responsive transcription factor one을 포함하여 테스트한 모든 유전자의 유전자 발현에서 급격한 변화로 나타났습니다. 막대는 표준 오차를 나타내며, 별표는 역전된 GMF 조건과 정상 GMF 조건에 노출된 식물 간의 유의미한 차이를 나타냅니다.

GMF 역전의 효과는 지상부 유전자 발현에 유의미한 변화를 유도하지 않았습니다. 그러나 성장한 식물의 뿌리 유전자 발현에서는 급격한 하향 조절이 관찰되었습니다. 역전된 GMF 조건에서 이러한 유전자에는 thal, aate peroxidase, aate peroxidase, 철 슈퍼옥사이드 디스무타제 1종, N-A-D-P-H 1종, 호흡성 버스트 산화효소 단백질 및 catalyst three가 포함됩니다.

이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행한다는 전제하에 필요한 실험에 따라 수 분에서 수 일까지 소요될 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 지자기장을 반전시키거나 변경하는 방법과 노출된 식물에 대해 형태학적 및 유전적 연구를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 헬멧 코일로 둘러싸인 영역에서 모든 자기장 발생원을 제거하는 것이 중요합니다.

헬멧 코일과 제너레이터에서 열이나 진동이 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 연구자는 최종 데이터가 기록될 때까지 자기장 노출 조건에 대해 블라인드 처리되어야 합니다. 이 기술을 통해 자기 수용 연구자들은 자기장이 식물의 진화, 동물의 행동 및 항법, 그리고 인간 세포주에 미치는 영향을 탐구할 수 있었습니다.

향후 연구에서는 우주 환경에서 자기장의 변화가 식물 성장에 어떠한 영향을 미치는지 평가하기 위해 미세중력 상태에서 유사한 연구를 수행하고자 합니다. 약한 자기장을 생성하는 시스템을 사용하는 것은 위험하지 않은 것으로 생각됩니다. 하지만 일반적인 주의 사항을 준수해야 하며, 헬름홀츠 코일 쌍용 전원 공급 장치와 같은 장비를 사용하기 전에는 전문 전기 기술자의 조언을 구해야 합니다.