교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

이 프로토콜의 전반적인 목표는 GL261 쥐 종양 세포의 루시페라제 변형의 유용성을 검증하기 위해 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 종양 세포 및 두개내 종양 성장을 모니터링하는 적절한 기술을 입증하는 것입니다. 이 방법은 종양 면역학 및 면역 치료 접근법 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 응력 조절이 GL261 세포 증식에 영향을 미치고 생체 내에서 성장하는지 여부.

GL261 종양 세포의 루시페라제 변형이 종양 세포의 성장 및 현장 치료에 대한 반응에 대한 비침습적 모니터링을 용이하게 한다는 이 기술의 주요 장점은 다음과 같습니다. GL261 루시페라아제 세포 배양이 T75 플라스크에서 70% 포화도에 도달하면 트립신화를 통해 세포를 수확합니다. 세포를 세고 점진적인 밀도로 24웰 플레이트로 옮깁니다.

세포 배양 인큐베이터에서 3시간 후 생물 발광 이미징 소프트웨어를 열고 이미징 시스템을 초기화합니다. 카메라가 섭씨 영하 90도로 냉각되면 이미징 소프트웨어를 10초 노출 시간과 중간 비닝을 사용하여 발광으로 설정합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 웰당 25마이크로리터의 루시페린에 세포를 배양하고 플레이트를 이미징 스테이션에 놓습니다.

획득을 선택하여 이미징을 시작합니다. 이미지를 성공적으로 획득하면 이미지 창과 도구 팔레트가 나타납니다. 관심 영역 도구를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 6 x 4를 선택합니다.

신호 영역을 6 x 4 슬릿으로 덮고 측정 탭에서 연필 아이콘을 선택합니다. 관심 영역 측정 테이블이 제곱센티미터당 스테라디안당 초당 광자 단위로 표시되는 창이 나타납니다. 체외 증식 분석을 수행하려면 세포 배양액이 70% 포화도에 도달했을 때 입증된 대로 세포 배양물을 수확합니다.

그리고 다중 채널 피펫을 사용하여 종양 세포를 20웰에 각각 96웰 플레이트에 1.5배, 10배, 웰당 RPMI 배지 80마이크로리터당 3번째 세포에 배치합니다. 세포 배양의 증발을 제한하려면 주변의 빈 웰을 100마이크로리터의 새로운 RPMI 배지로 채웁니다. 그런 다음 세포 증식을 평가하기 위해 세포의 각 웰에 20마이크로리터의 MTS 시약을 추가합니다.

그리고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 플레이트를 배양합니다. 3시간 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 흡광도 값을 정규화하려면 각 날짜의 값을 첫째 날에 얻은 해당 판독값으로 나눕니다.

이식 당일, 70% confluent 종양 세포 배양에서 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS에서 마이크로리터당 5번째 세포를 10배로 현탁합니다. 다음으로, 발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인한 후 각 실험 동물의 머리 꼭대기를 면도합니다. 화장솜 팁을 사용하여 2%의 클로르헥시딘으로 각 두개골을 청소합니다.

그런 다음 각 마우스의 눈에 윤활제를 바르십시오. 이제 멸균 메스를 사용하여 첫 번째 동물의 두정골 후두골 위에 약 1cm 길이의 시상 절개를 만듭니다. 그리고 두개골 표면을 3% 과산화수소로 다시 청소하여 명백한 브레그마를 확인합니다.

그런 다음 멸균 25게이지 바늘을 사용하여 브레그마 오른쪽과 관상 봉합사 바로 뒤에 있는 두개골에 3mm 구멍을 뚫습니다. 적절한 주입 깊이를 확보하려면 가위를 사용하여 20마이크로리터 피펫 팁의 뾰족한 끝에서 3mm를 자르고 바늘 끝에서 바늘이 3mm 튀어나올 때까지 26게이지 Hamilton 주사기를 팁에 밀어 넣습니다. 두개골의 구멍에 바늘을 삽입하고 종양 세포의 3 곱하기 10에서 5 분까지 3 마이크로 리터를 1 분 동안 천천히 주입합니다.

바늘을 1분 더 제자리에 두었다가 천천히 빼냅니다. 노출된 뼈를 3%의 과산화수소와 2%의 클로르헥시딘 용액으로 바꿉니다. 그런 다음 새 면 팁 어플리케이터로 두개골을 건조시킨 후 3제곱밀리미터 길이의 멸균 뼈 왁스 조각을 잘라내고 왁스를 면 팁 어플리케이터의 맨 끝에 부착합니다.

주사 부위를 뼈 왁스로 덮습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 두피의 양쪽을 왁스 위로 그립니다. 상처를 봉합하고 적절한 수술 후 진통제를 투여한 후 각 실험 동물에 대해 절차를 반복합니다.

두개내 종양의 성장을 이미지화하려면 먼저 방금 설명한 대로 이미징 스테이션을 초기화합니다. 다음으로, 꼬리 꼬집기로 적절한 수준의 진정 효과를 확인한 후, 방금 시연한 대로 이미징 시스템 매개변수를 설정합니다. 노출 시간에 대해 자동을 선택하는 것을 제외하고.

이미징 시스템이 준비되면 마우스를 이미징 스테이션에 놓고 Acquire를 선택하여 루시퍼라제 발현의 이미지를 획득합니다. 이미지가 성공적으로 획득되면 도구 팔레트에서 관심 영역 도구를 선택하고 원 아이콘에서 자동을 선택합니다. 신호 영역을 둘러싸서 관심 영역을 정의한 다음 영역의 측정값을 제곱센티미터당 스테라디안당 초당 광자 단위로 얻습니다.

마지막으로, 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 종양이 있는 동물이 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 루시페라아제 함유 렌티바이러스에 감염된 GL261 세포의 체외 생물발광 이미징은 양성 대조군 U87MG 루시페라제 발현 인간 교모세포종 세포주에 의해 발현되는 루시페라제 수준과 유사한 강력한 루시페라제 발현을 나타냅니다. 예상대로 감염되지 않은 GL261 세포는 백그라운드 루시퍼라제 발현을 나타내지 않습니다.

두개내 이식 전에는 GL261 루시퍼라아제와 GL261 세포주의 체외 성장률에 차이가 관찰되지 않았습니다. 두개내 종양 주입 동물의 연속 생물 발광 이미징에서 알 수 있듯이, GL261 루시페라제 발현 종양 세포는 관찰된 실험적 종양 보유 그룹 간의 생존율에 큰 차이 없이 생체 내에서 빠르고 일관된 성장 속도를 보입니다. 일단 마스터하면 이 기술을 사용하여 적절하게 수행되면 시간당 최대 25마리의 마우스를 이미지화할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 생체 발광 이미징의 능력을 향상시켜 생체 내에서 GL261 종양 성장을 모니터링하는 데 유용하게 작용하여 면역 능력이 있는 마우스 모델에서 면역 치료 반응에 대한 연구를 더욱 발전시킵니다.