Name: 교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 생체 발광 영상을 이용한 GL261 교모세포종 모델에서 종양 성장 모니터링 방법을. 이 기술은 면역 적격 마우스에서 비침습적 종양 관찰과 면역치료 반응 연구에 활용됩니다.

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기술 지원을 해주신 Rajwant Kaur님께 감사드립니다. 렌티바이러스 준비에 도움을 주신 Maxwell Tom에게 감사드립니다. 이 연구는 UCSF의 Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery와 Northwestern University의 Michael J. Marchese 교수 겸 의장의 지원을 받았습니다.

아래에 설명 된 모든 절차를 검토하고 노스 웨스턴 대학 기관 동물 사용 및 관리위원회의 승인을 멸균 조건 하에서 수행되고있다. 반딧불 루시 페라 제 표현 기자와 GL261 세포의 1. 변경 주 : HIV-1 계 렌티 바이러스 벡터는 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터의 제어 하에서 반딧불 루시페라아제 (Fluc)을 표현한다. 광학 리포터 유전자는 벡터 플라스미드 pHRSIN-CSGW - dlNotI에 복제 된. <ol><li> 95을 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 GL261 세포가 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 293-T 세포를 유지 % 공기와 5 %의 이산화탄소 (CO 2). </li><li> 293-T 세포 배양은 T-75 플라스크에서 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, pH가 번 세포를 씻어osphate 완충 식염수의 Ca2 +와는 Mg2 +가없는 (PBS)는, 주 형틀이 약간 기울어 진 채 5 ㎖ 피펫으로 5 분, 씹다 37 ℃에서, 트립신 (0.05 %) 3 mL를 가진 세포를 배양하고있는 모든 세포를 수집 플라스크의 바닥에서. 15ml의 원뿔형 튜브에 트립신 세포 현탁액의 3 ㎖를 전송하고, 육체 RPMI 배지 (세포 현탁액 10 ㎖의 전체) (7)를 가하여. </li><li> 5 ml의 피펫으로 웰 세포 현탁액을 혼합한다. 관으로부터 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 혈구를 이용한 세포의 수를 계산. 이렇게하려면 트리 판 블루 용액 300 μL와 세포 현탁액 100 μl를 혼합하고 혈구로 혼합물의 2 μL를 삽입합니다. 현미경 네 개의 개별 뷰에서 블루 염색하지 않고 세포의 수를 계산. 이 수가 104 세포 / ㎖를 나타내는 바와 같이, 각각의 뷰에서 세포 수의 평균. </li><li> 한편, 30의 세포 현탁액을 포함하는 튜브를 원심7 분 0 XG. 미디어 대기음 1.0 × 106 / ㎖의 밀도로 GL261 세포 현탁액을 만들기 위해 신선한 RPMI 배지로 세포 펠렛을 재현 탁. 27.5 ml의 DMEM (1 일)와 T-175 플라스크에 넣고 RPMI 미디어 2.5 mL를 종자 2.5 × 10 6 GL261 세포. </li><li> 24 시간 후, 20 ㎖ 신선한 DMEM (2 일)와 매체를 교체합니다. </li><li> 상기 렌티 바이러스 벡터를 생산하고 5 분 동안 2 ml의 무 혈청 DMEM으로 54 μL 형질 감염 시약을 혼합한다. 형질 전환 시약 DMEM에 Fluc (pSIN-Fluc)의 3 개그-POL의 μg의, 수 포성 구내염 바이러스 G 봉투 (VSV-G)의 3 μg의, 4.5 μg의를 추가하고 실온에서 20 분 동안 품어. T-293 플라스크 (T-175)로 전체 DNA 혼합물을 삭제하고 48 시간 (2 일), 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 배양한다. </li><li> (3 일) (약 30 ml를해야 293-T 세포 배양 배지의 총 부피) 형질 전환 후 24 시간 신선한 DMEM 10 ML을 추가합니다. </li><li> 로 GL261 세포를 분할하려면24 웰 플레이트, 약간 기울어 진 술병을 들고하여 5 mL를 피펫으로 5 분, 씹다 37 ℃에서 트립신 (0.05 %) 5 ㎖와 세포를 품어의 Ca2 +와는 Mg2 +없는 PBS로 한 번 세포를 씻어 플라스크의 바닥으로부터 모든 세포를 수집하고, 단계 1.2에서와 혈구 세포를 통해 카운트. 한편, 7 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리. 미디어 대기음 2.5 × 104 / ㎖의 밀도로 GL261 세포 현탁액을 만들기 위해 신선한 RPMI 배지로 세포 펠렛을 재현 탁. 시드 24 웰 플레이트에 RPMI 매체의 1 ㎖ (3 일) 2.5 × 10 4 GL261 세포. </li><li> 48 시간 다음과 같은 형질의 293-T 플라스크 (T-175) 10 mL를 피펫으로 렌티 바이러스 상층 액 30ml를 수집하고 50 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다. 대기음 30 ml의 렌티 바이러스 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 50 ML의 주사기를 통해 상층 액, 1 mL를 분취 (4 일)에 바이러스 뜨는 나누어지는. </li><li> (R)의 1 mL로 교체렌티 바이러스 상층 액 1 ㎖과 함께 GL261 세포 판 (24도)에서 PMI 매체는 가습 실 (4 일)에 37 ° C에서 품어. </li><li> 렌티 바이러스 감염의 48 시간 후, 신선한 RPMI 1 ㎖ (6 일)와 매체를 교체합니다. </li><li> 24 시간 후, GL261 세포 (7 일)의 렌티 바이러스 감염을 반복한다. </li><li> 렌티 바이러스 감염의 2 차 48 시간 후, 신선한 RPMI 1 ㎖ (9 일)와 매체를 교체합니다. </li><li> (GL261.luc 셀로 언급되는) 변형 된 루시퍼 GL261 세포 성장 및 T-75 플라스크에 세포 배양을 확장하는 것을 계속한다. </li><li> GL261.luc 세포 배양은 T-75 플라스크에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 트립신 처리에 의해 세포를 수확하고, 단계 120에서와 같이 계산에 의해 혈구. 졸업 밀도에서 24- 웰 플레이트 GL261.luc 셀 플레이트 (1.0 × 106 5.0 × 105, 2.5 × 105, 1.0 × 105, 5.0 × 104, 2.5 × 104 세포 / 웰) 및 humidi에서 37 ° C에서 부화3 시간 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 챔버 얘기들이었다. </li><li> 셀룰러 루시퍼 라제 활성에 대하여 측정 값을 생물 발광 영상 (도 1)를 이용하여 U-87 MG (U87.luc) 세포 변성 루시페라아제한다. <ol><li> 이미지 소프트웨어를 시작합니다 (바탕 화면에 아이콘을 클릭) 이미징 시스템을 초기화 (버튼을 클릭 &quot;초기화&quot;). 초기화가 자동으로 시작되고 시스템 검진 및 -90 ℃로 냉각 할 수있는 카메라를 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. </li><li> 각 웰에 루시페린의 25 μL (D-루시페린 칼륨 염, 150 ㎎ / ㎏)를 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 판을 실온에서 1 분 동안 루시페린과 이미지로 세포를 품어. 이미징 시스템을 설정하려면, &quot;발광&quot;, &quot;10 초&quot;노출 시간, &quot;중간&quot;비닝 (binning)을 선택합니다. 영상 스테이션의 24 웰 플레이트를 놓고 이미지를 시작합니다 &quot;취득&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 이미지를 성공적으로 인수 한 후에는 이미지 창 및 도구 PA가 표시됩니다화면에 lette. &quot;ROI (관심 지역) 도구&quot;를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 6 × 4를 선택합니다. 24 웰 플레이트의 이미지 신호의 영역을 커버하고 측정 탭 (연필 아이콘)을 클릭하는 6 × 4 슬릿을 만듭니다. 평방 센티미터 (광자 / 초 / / SR cm 2) 당 스테 라디안 당 초당 광자 단위로 투자 수익 (ROI) 측정의 테이블 창을 준수하십시오. </li><li> 사용 U87.luc 셀들은, 이전에 GL261.luc 형질 세포에서 루시퍼 라제 활성을 평가하기위한 대조군으로서, GL261 개질 11 여기 사용 된 것과 같은 렌티 변성. </li></ol></li></ol> 체외 증식 분석 2. <ol><li> GL261과 GL261.luc 세포 배양은 T-75 플라스크에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 트립신 처리하여 세포주 모두를 수확하고, 단계 120에서와 같이 계산하고, 1,500 세포의 밀도로 96- 웰 플레이트에 플레이트 세포 또한 시간과 피펫 오차를 최소화하도록 멀티 채널 피펫을 사용하여 당 RPMI 배지 80 μL. 괜찮다ED (20) 우물의 총에 각 셀 라인. 세포에 의해 채워 우물의 증발을 제한하기 위해, 신선한 RPMI 배지 100 ㎕ 빈 우물을 입력합니다. </li><li> 비색 세포 증식 분석법을 이용하여 세포 증식을 평가. 여기에서 우리는 MTS 세포 증식 분석을 사용합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 세포를 포함하는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 MTS 시약 20 μL를 추가한다. </li><li> 3 시간 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 이것은 도금 후, 7 일 1, 2, 4에서 반복되고. 흡광도 값을 정규화하기 위해, 매일의 값은 1 일 (도 2)에서 얻어진 대응하는 수치로 나누어진다. </li></ol> 3. 종양 세포 주입 참고 : 모든 장비를 압력솥. 살균제 (2 % 클로르헥시딘 액)을 분무하여 수술 영역을 준비하고 absorben 커버T 커튼. 멸균 상태를 유지 수술시 무균 수술 장갑을 착용하고, 색 테이프로 두 영역으로 수술 영역을 나누기 위해. 지역 1 &quot;클린&quot;이라는 살균 공급을 포함합니다; 지역 2 &quot;더러운&quot;로 표시하고, 재료를 사용 포함되어 있습니다. <ol><li> 동물 수술에 앞서, 두개 내 주입을위한 세포 현탁액을 준비합니다. 70 %의 합류 T-75 플라스크 트립신에 의해 단계 1.2에서와 같이 혈구를 통해 세포를 계산하고, 2 + 칼슘없이 행크스 &#39;균형 소금 용액에 1.0 × 10 5 세포 / μL의 농도에서 세포 현탁액을 만들어에서 수확 세포 마그네슘 2+ (HBSS). </li><li> 0.9 %의 식염수에 자일 라진의 케타민 100 ㎎ / ㎏과 10 ㎎ / ㎏을 포함하는 200 μL 혼합물의 복강 내 주사로 쥐를 마취. 적절한 마취를 확인하려면, 마우스의 발가락을 꼬집어. 마우스가 완전 마취 경우, 마우스는 자극에 반응해서는 안된다. </li><li> 0.1 미터를 관리피하 주사를 통해 G / kg의 부 프레 노르 핀은 수술 후 통증을 완화합니다. </li><li> 2 % 클로르헥시딘 용액에 침지면 팁 어플리케이터 및 가위를 사용하여 깨끗한 동물의 머리의 상단 면도. 수술 중 적절한 윤활을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여 두정 - 후두 뼈를 통해 약 1cm 길이 시상 절개를합니다. 브레 그마 시각화, 3 % 과산화수소 용액에 적신 솜 팁 어플리케이터 두개골의 표면을 닦아. </li><li> 브레 그마의 오른쪽 바로 뒤에 관상 봉합 3mm 작은 구멍을 만들기 위해 무균 25-G 바늘 두개골을 뚫는다. </li><li> 두개 내 주사 부위는 두개골 3 mm의 깊이에 있는지 확인하기 위해 가위를 사용하여 20 μL 피펫 팁의 끝이 뾰족 오프 3mm을 절감하고 피펫 팁에 주사기를 삽입합니다. </li><li> 이전에 만든 구멍에 수직으로 주사기를 삽입하고 천천히 종양 세포 SUS를 주입1 분 동안 3 μL HBSS에 3.0 × 105 세포를 함유 연금. 다른 분 동안 자리에 바늘을 그대로두고 천천히 바늘을 빼냅니다. </li><li> 3 % 과산화수소에 침지면 팁 어플리케이터 및 2 % 클로르헥시딘 용액 두개골을 면봉. 면 팁 어플리케이터 두개골의 표면을 건조시킵니다. 크기가 3 약 3mm 멸균 뼈 왁스를 잘라면 팁 어플리케이터의 측에 뼈 왁스를 연결합니다. 면 팁 어플리케이터 구멍을 충당하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다. </li><li> 집게를 사용하여 두개골을 통해 함께 두피의 각면을 그리고 주식은 상처를 닫습니다. 2 % 클로르헥시딘 용액에 담근면 팁과 상처를 청소합니다. </li><li> 그들은 보행이 될 때까지 수술 후 모든 쥐를 모니터링하고 정상적인 활동을 유지합니다. 일반적으로, 회복 시간은 약 30 분이다. 그들이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 마우스를 반환하지 않습니다. </li></ol><ol><li> 깨끗한 종이 타월에 살균제의 충분한 양 (0.05 % 디메틸 암모늄 클로라이드 용액)을 스프레이. 철저하게 동물 장치와 접촉 할 것 이미징 챔버 내부의 검은 색 시트, 코 콘 및 디바이더를 닦아 살균제에 젖은 종이 타월을 사용합니다. 철저하게 깨끗하고 마른 종이 타월로 모든 표면을 닦으십시오. 이 한 번 더 반복하고 5 분을 기다립니다. </li><li> 단계 1.14.1과 촬상 국 초기화. </li><li> 복강 주사에 의해 케타민 / 자일 라진 및 200 μL의 100 μL 루시페린 (D-루시페린 칼륨 염 150 ㎎ / ㎏)을 함유 300 μL 혼합물로 마우스를 마취. </li><li> 주사 후 10 분을 기다린 후 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 이미징 시스템을 설정하려면, &quot;발광&quot;, &quot;자동&quot;노출 시간, &quot;중간&quot;비닝 (binning)을 선택합니다. 영상 stati에 마우스를 놓고과에하면 이미지를 시작합니다 &quot;취득&quot;버튼을 클릭합니다. 주사 후 시간이 각 이미지 세션과 일관성이 있음을 확인합니다. </li><li> 이미지가 성공적으로 획득되면, 화상 창 및 도구 팔레트 나타나야. &quot;투자 수익 (ROI) 도구&quot;를 클릭하고 원 아이콘에서 &quot;자동&quot;을 선택합니다. ROI를 정의하기 위해, 이미지 신호의 영역을 둘러싸하고 SR 광자 / 초 / / ㎠의 단위로 ROI의 측정을 수행. </li><li> 영상 실에서 쥐를 가지고 그들이 보행이 될 때까지 마우스를 모니터링하고 정상적인 활동을 유지합니다. 일반적으로 복구 시간은 약 15 분이다. 그들이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 마우스를 반환하지 않습니다. </li><li> 동물은 다음과 같은 현상이 제시 될 때까지 일주일에 두 번 생물 발광 이미징에 의해 종양 성장을 모니터 : 체중 감소 (주입 전의 중량에 20 % 이상의 상대적인 손실) inappetance (24 시간 동안 완전한 거식증), 및 지속적인 purposefu ​​부족그들이 안락사해야하는 시간에 부드러운 자극 (최대 얻을 수있는 약한 시도)에 L 응답. 경추 탈구이어서 CO 2 챔버를 사용하여 이러한 증상이있는 동물을 안락사. <ol><li> 장소 안락사 챔버에 마우스 (과밀하지 챔버을) 유입은 5-6 분 동안 이산화탄소를 압축. 모든 동물은 무의식과 후 약 5 분 호흡을하지 않는 것을 관찰한다. </li><li> 챔버에서 마우스를 가져 가라. 심장이 엄지와 집게 손가락 사이의 가슴을 느낌으로 치고 있지 않은지 확인하고, 깜빡임이 없음을 확인합니다. </li><li> 평평한 표면에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 억제하고 엄지와 다른 손의 첫 번째 손가락으로 꼬리의 한 손으로 두개골의 기지에서 목 뒤쪽과 기지를 파악. </li><li> 머리를 제지하고 신속하게 뒤로 꼬리를 잡아 당깁니다. 그 두개골은 엄지와 첫 번째 손가락을 사용하여 첫 번째 경추에서 분리되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 표준단계 2.3 (그림 3A)과 생물 발광 영상의 첫 번째 날에 얻은 대응하는 측정 값에 대한 매일 ALIZE 발광 값. </li><li> 통계적인 분석을 위해, 카플란 - 마이어 추정 (12)을 이용하여 생존 곡선을 생성하고, 로그 - 랭크 테스트 (13)을 이용하여 생존 곡선 사이의 차이를 비교한다. </li></ol>

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<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
</ol>

공개할 이해 상충이 없습니다.

동계 면역 C57BL / 6 마​​우스에 두개골 내에 이식 할 때 GL261 쥐의 신경 교종 세포는 인간의 신경 교종 이종 이식 동물 모델에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 이종 이식 종양의 대부분은 정확하게 침략 인간의 질병을 요점을 되풀이하지 않는 캡슐화 된 병변으로 성장. 반면, GL261 종양뿐만 아니라 인접한 뇌에 침략을 보여줍니다뿐만 아니라, 혈관 신생, 유사 분열, 그리고 깊은 괴사 7. 가장 중요한 것은 종양 면역학 또는 면역 전략 15, 16, C57BL / 6 마우스가 그대로 면역 시스템 (8)을 유지 공부를 할 때. 이전의 연구는 면역 사이토 카인 TGF-β의 강력한 표현을 보여 주었다 및 두개 내 종양은 인간 아교 모세포종 (9), (10)과 유사한 면역 억제 T-조절 세포가 포함되어 있습니다. 여기에 설명 된 간단한 기술은 GL261 세포에 의해 루시 페라 제의 안정적 발현 할 수 있습니다. 우리는 최근 미 신고되었습니다시험 관내 및 GL261 세포에 비해 GL261.luc 세포의 생체 내 성장 LAR은 유사한 종양 조직 학적 특성 및 면역 세포에 더하여 17 침투. GL261.luc 세포 안정적 따라서 광자 검출 광 화학적 에너지 변환 루시페린 기질의 산화를 촉매하는 루시퍼 라제를 발현. 루시페린 안전하게 동물에게 복강 내 투여 또는 정맥 내 주사 후 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수있다. 이러한 생쥐 작은 동물 연구에서, 생물 발광을 비 침습적 방식으로 (11)에 외부 적으로 검출 될 수있다. 따라서, 종양의 성장은 직렬 동물의 희생 또는 비용 MRI 또는​​ CT 촬영에 대한 필요없이 평가 될 수있다. 프로토콜의 중요한 단계는 생체 내 실험을 시작하기 전에 시험 관내에서 렌티 바이러스 형질 도입, 또한 루시퍼 라제를 안정적으로 발현 대조까지도 포함한다. 전달의 손실 requi 수 있습니다반복 렌티 바이러스 감염 재. 발현 벡터에 항생제 내성 유전자의 도입은 또한 루시퍼 라제 발현을 선택하는 데 사용될 수있다. 세심한 기술 재현성 다른 처리 군의 비교를 허용하도록 정확한 해부학 적 위치에있는 세포의 수를 일치 배치 두개 내 주입을 위해 요구된다. 현재 연구 및 루시퍼 라제 발현 GL261 셀의 이전 연구 간의 주요한 차이점은 정위 프레임 (18)의 사용에 비해 세포를 주입하는 프리 핸드 기술의 사용이다. 우리는 이전에 한 손 기술 (19)과 일치 주입 결과를 보여 주었다. 자유로운 손 기술의 장점은 다른 치료제의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 능력이다. 우리의 손에, 우리는 1 시간에 약 60 동물을 이식 할 수 있습니다. 기술을 습득 한 후, 미래 기술의 응용은 무한하다. GL261의 demonstr로축열 상승 유사 분열 및 인간 아교 모세포종 유사한 빠른 종양 성장은, 항 - 증식 치료제가 평가 될 수있다. GL261 종양이 침습성 및 혈관 신생이다 마찬가지로, 항 침습 및 항 - 혈관 신생 요법이 사용될 수있다. 인간 표적 겨냥 화학 치료제의 효과를 평가하는 경우에는주의가 사용되어야한다. 루시퍼 라제를 발현하는 20 인간 아교 모세포종 이종 이식편을 이용한 이전 연구에 비하여, 이것은 우리의 모델의 제한으로 간주 될 것이다. 또한, 종양 성장의 면역 요법 전략의 효과 GL261 이종 이식 모델에서 연구 될 수있다.

악성 신경교종은 가장 흔하고 가장 치명적인 인간 뇌종양입니다. 최대 외과적 절제술, 방사선 요법 및 화학요법으로 치료하더라도 주요 뇌종양 의뢰 센터1, 2, 3에서 평균 생존율은 15-20개월로 유지된다. 악성 신경교종의 가장 공격적인 형태인 교모세포종은 유사분열, 신생혈관화, 인접 뇌로의 침입, 가성팔리사딩 괴사를 특징으로 합니다. 인간 뇌종양 세포를 사용하는 정형소 뇌종양 이종이식편은 신경 종양학 연구에서 필수적인 기능을 수행해 왔으며 인간 임상 시험에 들어가기 전에 새로운 제제 테스트를 위한 전임상 번역을 용이하게 했습니다. 대부분의 인간 이종이식 모델은 인간 질병의 많은 특징을 요약하지만, 모든 인간 기반 이종이식 모델 시스템의 근본적인 한계는 면역 결핍 동물을 사용한다는 것입니다4. 
온전한 숙주 반응이 없다는 것은 종양 형태와 생착의 효율성 측면에서 종양 성장을 분명히 수정한다는 것입니다. 이종이식 모델의 결과를 해석할 때 특정 가정이 허용되지만, 치료 평가 영역에서 관련 결론을 달성하는 것은 어려운 일입니다. 특정 근본적인 생물학적 특징은 면역 결핍 동물과 면역 능력이 있는 동물에서 유사할 가능성이 높지만, 종양 관련 염증, 조직 침습, 부상에 대한 반응과 같은 다른 특징은 아마도 매우 다를 수 있습니다. 이와는 대조적으로, GL261은 화학적으로 유도된 쥐 신경교종 세포주로, 면역능력이 있는 합성유전자 C57BL/6 마우스의 뇌에 이식되었을 때 신경교종을 정확하게 재현합니다5. 인간의 질병과 유사하게, 두개내 종양은 빠르고 재현 가능하게 성장하여 신경학적 증상과 동물의 폐사를 유발합니다6-10. 
피하 종양 성장을 직접 측정할 수 있습니다. 두개내 종양 성장은 동물 희생 또는 비용이 많이 드는 영상 검사를 통해서만 측정할 수 있습니다. 효소 루시퍼라아제(Luciferase)의 안정적인 발현은 비침습적이고 비용 효율적인 두개내 생물발광 이미징을 가능하게 합니다11. 루시페라제 형질주입된 GL261 세포의 생물 발광은 두개내 종양 성장과 밀접한 관련이 있습니다. 최근 GL261과 루시페라제 변형 GL261 세포를 직접 비교한 결과, 체외 성장 및 침입, 면역학적 사이토카인 프로파일, C57BL/6 마우스가 함유된 두개내 종양의 생체 내 생존 또는 면역 세포 침투에 차이가 없음을 입증했습니다. 이 기술은 종양 성장의 비침습적 모니터링을 포함하는 교모세포종 전임상 연구에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Gold Biotechonology</td><td>LUCK-100</td><td>빛에서 멀리 보관</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>견적</td><td>문의 없음</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>견적</td><td>문의 없음</td></tr><tr><td>24-well; 표준 조직 배양; 플랫 바텀</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 A일회용 단일 용액 세포 증식 분석&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>없음</td></tr><tr><td>Synergy 2 다중 모드 리더</td><td>BioTek</td><td>연락처 견적</td><td>없음</td></tr><tr><td>없음 96 웰 분석 플레이트, 블랙 플레이트, 뚜껑이 있는 투명 바닥, 조직 배양 Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>없음</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>제어 물질</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>없음</td></tr><tr><td>28G 바늘 (주사기 포함)&nbsp;</td><td>어부&nbsp; &nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>일명 인슐린 주사기</td></tr><tr><td>2% 클로르헥시딘</td><td>피셔</td><td>NC9756995</td><td>일명 " 놀바산"</td></tr><tr><td>3% 과산화수소</td><td>피셔</td><td>H312P-4</td><td>빛에서 멀리 보관</td></tr> 안<tr><td>과 연고</td><td>추기경 건강</td><td>1272830</td><td>일명 " Akwa 눈물"</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 바늘</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>없음</td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>깃털</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>거즈</td><td>피셔</td><td>22028563</td><td>오토 클레이브 사용 전</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>없음</td></tr><tr><td>스킨 스테이플러, 스테이플, 리무버</td><td>스톨 팅</td><td>59020</td><td>없음</td></tr><tr><td>PDI 알콜 준비 패드</td><td>피셔</td><td>23-501-711</td><td>없음</td></tr><tr><td>Reflex 7mm 상처 클립 100 팩</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>Reflex 7mm 상처 클립 Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>Reflex 7mm 상처 클립 제거제</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>없음</td></tr><tr><td>나무 손잡이가 있는 단일 종단 라운드 팁 면봉</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td> 사용 <td>전 Autoclave</td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS)가 없는 Hanks의 균형 잡힌 염 용액</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>없음</td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>없음</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>없음</td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>599864</td><td>없음</td></tr></tbody></table>

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

일반적으로 보고되는 인간 신경교종 이종이식 동물 모델과는 대조적으로, GL261 쥐 신경교종 이종이식은 인간 질병의 거의 모든 관련 임상 및 조직학적 특징을 요약합니다. GL261 세포를 syngeneic C57BL/6 마우스에 두개내로 이식하면 이 모델은 온전한 면역 미세환경을 유지하는 추가적인 이점이 있습니다. GL261 세포에서 루시퍼라아제의 안정적인 발현은 두개내 종양 성장에 대한 비침습적이고 비용 효율적인 생물 발광 모니터링을 가능하게 합니다. GL261 세포에서 루시페라아제 발현이 종양 성장 특성, 종양 세포 면역조절 사이토카인 발현, 면역 세포의 종양 내 침투 또는 두개내 종양을 보유한 동물의 전체 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 최근에 입증했습니다. 따라서 GL261 루시페라제 신경교종 모델은 새로운 화학요법 및 면역요법 양식 연구에 유용할 수 있는 것으로 보입니다. 여기에서는 GL261 세포에서 안정적인 루시페라제 발현을 생성하는 기술과 생물 발광 이미징을 통해 종양 세포의 체외 및 생체 내 성장을 연구하는 방법을 보고합니다.

GL261 세포는 시험관 내 생물 발광 1. 촬상 인간 아교 모세포종 세포주 U87.luc 양성 대조군의 수준과 유사한 강력한 루시페라아제 발현 (도 1)를 보여주는 단계에서 상술 한 바와 같이 루시페라아제는 렌티 바이러스를 포함하여 감염시켰다. 예상대로, 감염되지 않은 GL261 세포는 어떤 배경 루시 페라 제 표현을 보여 없습니다. 이 단계에서는 아직 종래 안정 루시퍼 라제 발현을 확인 감염된 세포주를 사용하여 추가 연구를 수행하는 것이 중요 간단하다. 두개 내 주입 후 루시 페라 제 표현. 두개 내 주입하기 전에, 우리는 GL261 세포 (그림 2)에 비해 GL261.luc의 체외 성장 속도의 차이를 입증하지 않습니다. 두개 내 성장 및 생존 분석을 위해, 세포에 주입 하였다 BRGL261.luc 종양을 갖는 마우스에서 3 단계 종양 성장 프로토콜에 따라, C57BL / 6 마우스의 AINS 직렬 프로토콜을 사용하여 단계 4 생물 발광 영상을 분석 및 검출 종양 성장 (도 3a)을 입증 하였다. 신속하고 일관 GL261.luc 종양을 갖는 마우스는 죽어가는되었고 안락사시켰다. 중요한 GL261.luc 동물 베어링 GL261 종양 (도 3b) 사이의 전체 생존율에는 차이가 없다. 생체 내 생물 발광 촬상 따라서 실험 아교 모세포종 치료에 반응을 모니터링하는 데 사용될 수있다. 신속한 신뢰성 종양 성장 및 생존율은 짧은 상대적으로 짧은 시간에 많은 양의 데이터를 얻을 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> GL261.luc 세포도 1 루시페라아제 활성. U87.luc는 GL261.luc 및 GL261 (대조군) 세포의 밀도로 플레이 팅 하였다1.0 × 106, 5.0 × 105, 2.5 × 105, 1.0 × 105, 5.0 × 104, 2.5 × 104 세포 / 웰에서 좌우. 발광 (광자 / 초 / / SR CM 2) 루미나 이미징 역으로 측정 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> 도 2 루시 페라 제 발현은 GL261 세포 증식에 영향을주지 않는다. GL261.luc 세포는 발생하지 않는다 증식의 차이는 MTS 세포 증식 분석에 의해 입증 된 바와 같이. 평균 흡광도 값을 비교함으로써 결정되는 그래프는 일 (1)에 대하여 배 증가를 나타낸다 (제 1 일 평균값 thespecified 시점에서 비교를위한 부대 t의 -test 값 (± SEM을 의미)각 셀 라인 사이 : P = 0.7796) (14). 오차 막대는 평균 값이 하루에 사통 샘플에서 (± SEM을 의미)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> 그림 3. 루시 페라 제 발현은 생체 내 종양 성장과 동물의 생존에 영향을 미치는 것이 아닙니다. (A) 생물 발광 모니터링 C57BL / 6 마우스에서 두개 내 GL261.luc 종양의 진보적 인 성장을 보여줍니다. (B) Kaplan-Meier 생존 분석은 하나 GL261 (실선) 또는 GL261.luc 세포의 두개골 이식 마우스에 대한 전체 생존율의 차이를 보여줍니다 없습니다 (점선).이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

GL261 신경교종 세포는 교모세포종의 유용한 면역 역량 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜의 목표는 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 두개내 종양 성장을 모니터링하기 위한 적절한 기술을 시연하고, 종양 면역학 연구를 위한 루시페라제 변형 GL261 세포의 유용성 및 교모세포종 치료를 위한 면역 요법 접근법을 검증하는 것입니다.

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 GL261 마우스 종양 세포의 루시퍼레이스(luciferase) 변형의 유용성을 검증하기 위해, 생체 내 생물 발광 이미징(in vivo bioluminescence imaging)을 사용하여 종양 세포 및 두개내 종양 성장을 모니터링하는 적절한 기술을 시연하는 것입니다. 이 방법은 종양 면역학 및 면역 치료 접근 방식 연구의 핵심 질문, 예를 들어 스트레스 변형이 GL261 세포의 증식 및 생체 내 성장에 영향을 미치는지 여부에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 GL261 종양 세포의 루시퍼레이즈 변형을 통해, 체내(in situ)에서 세포의 성장과 치료 반응을 비침습적으로 모니터링할 수 있다는 점입니다. T75 플라스크에서 GL261 루시퍼레이즈 세포 배양이 70% 밀도(confluency)에 도달하면, 트립신화를 통해 세포를 수확하십시오. 세포 수를 측정한 후, 이를 24웰 플레이트에 단계별 밀도로 분주하여 옮기십시오.세포 배양 인큐베이터에서 3시간 후, 생물발광 이미징 소프트웨어를 열고 이미징 시스템을 초기화합니다. 카메라가 -90 °C로 냉각되면, 이미징 소프트웨어를 Luminescent 모드로 설정하고 노출 시간은 10초, Binning은 Medium으로 설정합니다. 그런 다음 웰당 25 µL의 luciferin을 넣고 상온에서 1분 동안 세포를 배양한 후, 플레이트를 이미징 스테이션에 놓습니다.이미징을 시작하려면 Acquire를 선택하십시오. 이미지가 성공적으로 획득되면 이미지 창과 도구 팔레트가 나타납니다. Regions of Interest Tools를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 6 by 4를 선택하십시오.신호 영역을 6 by 4 슬릿으로 덮고, Measurements 탭에서 연필 아이콘을 선택하십시오. 초당 steradian당 제곱센티미터당 광자 단위로 된 관심 영역 측정값 표가 포함된 창이 나타납니다. in vitro 증식 분석을 수행하려면, 세포 배양이 70% 합류도(confluency)에 도달했을 때 방금 시연한 방법으로 세포 배양물을 수확하십시오.멀티채널 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트의 20개 웰에 각각 80 µL의 RPMI 배지당 1.5 × 10³개의 종양 세포를 분주합니다. 세포 배양액의 증발을 제한하기 위해 주변의 빈 웰을 100 µL의 신선한 RPMI 배지로 채웁니다. 그런 다음, 세포 증식을 평가하기 위해 세포가 들어 있는 각 웰에 20 µL의 MTS 시약을 첨가합니다.플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 3시간 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정합니다. 흡광도 값을 정규화하기 위해, 각 일차의 측정값을 1일차에 얻은 해당 측정값으로 나눕니다.이식 당일, 70% 밀도로 배양된 종양 세포 배양액으로부터 1 × 10⁵ cells/µL의 세포를 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS에 부유시킵니다. 그다음, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 진정 수준을 확인한 후, 각 실험 동물의 머리 윗부분을 제모합니다. 면봉을 사용하여 각 두개골을 2% chlorhexidine으로 세척합니다.그 다음 각 마우스의 눈에 윤활제를 도포합니다. 이제 멸균 메스를 사용하여 첫 번째 동물의 두정-후두골 위로 약 1cm 길이의 시상 절개를 가합니다. 그리고 브레그마(bregma) 위치를 확인하며 3% 과산화수소로 두개골 표면을 다시 세척합니다.그 다음, 멸균된 25-gauge 바늘을 사용하여 bregma의 오른쪽이자 coronal suture 바로 뒤쪽의 두개골에 3-millimeter 구멍을 뚫습니다. 적절한 주입 깊이를 확보하기 위해, 가위를 사용하여 20-microliter 피펫 팁의 뾰족한 끝부분을 3 millimeters 자르고, 26-guage Hamilton 주사기를 팁 끝으로 바늘이 3 millimeters 돌출될 때까지 팁 내부로 밀어 넣습니다. 바늘을 두개골의 구멍에 삽입하고, 1분 동안 3 times 10 to the 5th의 종양 세포 3 microliters를 천천히 주입합니다.바늘을 1분 동안 더 그대로 둔 다음 천천히 뽑아냅니다. 노출된 뼈를 3% hydrogen peroxide와 2% chlorhexidine 용액으로 세척합니다. 그다지 새 면봉으로 두개골을 건조시킨 후, 3 square millimeter 크기의 멸균 bone wax 조각을 잘라 면봉의 끝부분에 부착합니다.주입 부위를 본왁스로 덮습니다. 그 다음 포셉을 사용하여 두피의 양측을 왁스 위로 끌어당깁니다. 상처를 봉합하고 적절한 수술 후 진통제를 투여한 후, 각 실험 동물에 대해 이 절차를 반복합니다.두개내 종양의 성장을 촬영하려면, 먼저 시연한 대로 이미징 스테이션을 초기화하십시오. 그다음, 꼬리 꼬집기를 통해 적절한 진정 수준을 확인한 후, 시연한 대로 이미징 시스템 파라미터를 설정하십시오. 단, 노출 시간은 Auto로 선택하십시오.영상 시스템 준비가 완료되면 마우스를 영상 촬영 스테이션 위에 올리고 Acquire를 선택하여 루시페레이스 발현 영상을 획득합니다. 영상 획득이 성공적으로 완료되면 도구 팔레트에서 Region of Interest Tool을 선택하고 원형 아이콘에서 Auto를 선택합니다. 신호가 나타나는 영역을 원으로 둘러싸 관심 영역을 정의한 다음, 해당 영역의 측정값을 초당, 스테라디안당, 제곱센티미터당 광자 수 단위로 측정합니다.마지막으로, 마우스를 이미징 챔버에서 꺼내고 종양이 있는 동물이 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 루시퍼레이즈 함유 렌티바이러스에 감염된 GL261 세포의 인 비트로(in vitro) 생체 발광 이미징 결과, 양성 대조군인 U87MG 루시퍼레이즈 발현 인간 교모세포종 세포주에서 발현되는 루시퍼레이즈 수준과 유사한 강력한 루시퍼레이즈 발현이 나타났습니다. 예상대로, 감염되지 않은 GL261 세포에서는 배경 루시퍼레이즈 발현이 나타나지 않았습니다.두개내 이식 전, GL261 luciferase 세포주와 GL261 세포주의 in vitro 성장률에는 차이가 관찰되지 않습니다. 두개내 종양이 주입된 동물의 연속적인 생체 발광 이미징 결과에서 알 수 있듯이, GL261 luciferase 발현 종양 세포 또한 in vivo에서 빠르고 일관된 성장률을 보이며, 실험 대상인 종양 보유 그룹 간의 생존율에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면, 시간당 최대 25마리의 마우스를 이미징할 수 있습니다.이 기술의 개발을 통해 생체 내 GL261 종양 성장을 모니터링하는 생물발광 이미징의 유용성이 향상되었으며, 이는 면역 정상 마우스 모델에서 면역치료 반응에 대한 연구를 더욱 진전시켰습니다.

bioluminescence-imaging-an-immunocompetent-animal-model-for

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

C57BL에 GL261 셀 / 6 마​​우스의 Intracranial 이식은 인간 glioblastoma multiforme의의 특징 중 많은 것들을 요점을 되풀이하다 악성 gliomas을 생산하고 있습니다. 우리는 우리가 사용할 수 있도록 안정 루시페라제 표현 GL261 세포를...

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을...

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

이 비디오에서는 마우스 모델에서 형광 단백질이 태그된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 형광 분자 단층 촬영 또는 FMT에 대해 설명합니다. 이 기술은 분자 수준에서 항종양 치료제의 효과를 밝히는 데 유용합니다.

형광 분자 단층 촬영: 마우스 모델에서 형광 단백질 태그가 지정된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 이미징 기술

출처: Clark, AJ, et al. 교모세포종에 대한 면역적격 동물 모델의 생물발광 영상. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 루시페라아제 발현 종양 세포와 루시페린을 사용하여 종양 성장을 비침습적으로 정량화하는 면역 적격 마우스 모델에서 교모세포종 진행을 추적하기 위한 생물 발광 이미징을 보여줍니다.

교모세포종에 대한 면역적격 마우스 모델의 생물발광 이미징

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

생물 발광 영상은 종양과 전이를 지역화 잘 알려진 도구이지만, 이러한 이미지의 정량화는 종종 복잡한 계산 및 특정 장비를 필요로한다. 우리는 더 계산을 요구하지 않으며, 종양 부담과 치료 반응이 마우스 모델에서 관찰 할 수 있도록 정확한 획득 상태에 기초하여, 사용하기 쉬운 luminoscore 방법을 설명한다.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

교모세포종은 파괴적인 형태의 원발성 뇌암이며, 레이저 간질성 열 요법은 수술이 불가능한 교모세포종에 대한 기존 외과적 절제술의 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 치료 효과 또는 보조 및 조합 치료를 연구하는 데 사용할 수 있는 최적화된 전임상 마우스 모델을 설명합니다.

교모세포종의 레이저 간질성 열처리 치료를 위한 면역 역량 있는 쥐 모델

배우세요 생체 발광 영상을 이용한 GL261 교모세포종 모델에서 종양 성장 모니터링 방법을. 이 기술은 면역 적격 마우스에서 비침습적 종양 관찰과 면역치료 반응 연구에 활용됩니다.

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

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