Name: 이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 내피 세포를 평면 항원 제시 세포 모델로 활용하여 면역 시냅스 역학과 T 세포 활성화 메커니즘을 고해상도 이미징으로 연구하는 방법을. 이 기법은 적응 면역의 핵심 신호 과정을 탐색하는 데 활용됩니다.

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대표 이미지 중 일부를 생성하는 데 도움을 주신 Peter T. Sage 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 C.V.C.(HL104006)에 대한 NIH R01 보조금의 지원을 받았습니다.

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전반적으로,이 프로토콜은 I) 파악 하였다 생리적 장갑차로 내피 세포를 조사하기위한 방법을 설명하고, II) &#39;평면 세포 APC 모델&#39;의 새로운 유형으로. 전자와 관련하여, 이는 점차 적응 면역 반응을 형성하는데 16-18 (조혈 장갑차에 비해, IE)를 둘레 비 조혈 (또는 &#39;기질&#39;) 장갑차 중요한, 비 중복 역할을하는 것으로 인식되고있다. 이러한 &#39;세미 프로&#39;장갑차, 혈관과 (크게 전문 장갑차를 능가) 림프 내피 세포 중 최고의 16-18 평가 중입니다. 그러나, 신호 이벤트의 세부 사항과 결합 면역 시냅스는 주로 uninvestigated 남아있다. 여기에 설명 된 방법은이 새로운 영역에 대한 이해를 증진하기위한 기초를 제공한다. 예를 들어, 별개의 adaptiv을 나타내는 것으로 공지되어 다른 조직으로부터 내피 형성 ISS의 연구에 이러한 방법을 적용전자 면역 기능 (예를 들어, 간, 림...

T 림프구는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)에 효율적으로 결합 된 펩티드 항원은 (Ag)을 인식하는 능력을 특징으로 적응 면역계의 분기 아르는 T 세포 수용체 (TCR도 1)를 통해 분자. 나이브 림프구 구조적 마이그레이션 &#39;전문의 Ag 제시 세포&#39;(장갑차; 예 : 수지상 세포)을 주사 메모리 / 효과기 T 세포가 효과적으로 말초 조직 내의 장갑차 및 잠재 표적 세포의 매우 넓은 범위를 조사 할 필요가 있지만, 림프절 내. APC에 동족의 Ag의 최초 인식 다음 분에서 자신의 마이그레이션을 체포하고 전문 친밀한 세포 - 세포 인터페이스라고 &#39;면역 시냅스&#39;를 형성하기 시작 림프구 (IS). 지속 (즉, 30 ~ 60 분) 접점이 증폭 2-7 신호를 유지해야한다. 새로운 연구는 IS 내에, 그것이 연속 형성하고 신속한 R이라고 파악강도와 면역 반응 2-7 결과의 품질을 결정 (즉, MHC / AG-TCR, F - 굴지, 접착 및 신호 분자를 포함) 이산 서브 셀룰러 신호 마이크로 클러스터의 emodeling. 그러나, 이러한 방법의 세부 사항 및 동적 규제기구는 불완전 8,9 이해된다. 이것은 근본적으로 필요한 시공간 촬상 제한 APC 표면의 불규칙한 토폴로지 및 세포 - 세포 상호 작용의 저조한 제어 평면 배향, 이슈와 관련된 기술적 인 과제는 크게 기인하는 80-10 (Figure1A)에 접근한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> 이미징 면역 시냅스 역학 그림 1. 생리적 평면 셀 APC 모델은. 회로도는 T 세포와 professio 사이의 면역 학적 시냅스의 전통적인 이미지를 보여<html> NAL APC (A)와 T 세포와이 신규 한 내피 평면 APC 모델 (C)에 비해 전통적인 평면 지질 이중층 APC 모델 (B). ,, 극적으로 즉, 공간 (Z 영상 플레인의 해상도 ~ 1 ㎛) 및 시간을 (타협, 전문 장갑차는 생리적 면역 시냅스를 제공하지만 (해상도 ~ 0.2 μm의 최적의 XY 영상 평면에 대한 즉,) 제대로 지향 세포 - 세포 인터페이스를 제공 필요에 의한 반복적으로 영상의 해상도) 모든 Z 영상면을 스캔합니다. 이중층 모델 시공간 최적 이미징 해상도를 제공 평면 위상을 가질뿐만 아니라, 고도의 비 - 생리 학적 및 강성 간략화된다. 이것은 내피 세포 모델 생리적 환경에서 최적의 공간 및 시간 해상도 이미징을 제공하는 APC의 고전 생리적 기판과 지질 이중층의 평면 위상을 결합한다.M / 파일 / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이전의 연구는 부분적으로 최적의 XY 촬상에 평행 한 평면으로 T 세포의 활성화 표면 고정을 통해, 즉, 최적의 시공간 해상도 (제공 현상 평면 기판 모델 (즉, 지질 이중층과 항체 - 코팅 된면)에 의해 이러한 장애물을 회피했다 평면) 11 ~ 15 (그림 1B). 이러한 모델은 동적 액틴 / TCR 신호 마이크로 클러스터 7,11-14의 발견을 포함하여 T 세포에 항원 신호를 제어하는 분자 / 세포 내 역학에 중요한 통찰력을 촉진하고있다. 그러나, 이러한 모델은 본질적으로 과도하게 단순화되고,뿐만 아니라 강성 (도 1b) (3 차원 기하학적 특징의 개발 / 연구를 배제). 따라서, PHY에 그러한 결과를 연관시키는 방법 불확실siologic 세포 - 세포 면역 감시. 여전히 파악 하였다 있지만, 혈관과 림프 내피 세포가 큰로서 등장하고있다 (즉, ~ 1,000 배의 모든 전문 장갑차보다 숫자에 큰) &#39;세미 프로&#39;장갑차 16-18의 주변 함. (예를 들어, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1,하지만 CD80 및 CD86)이 세포는 MHC-I-, MHC-II-공동 자극 분자의 군중을 표현하고 전략적입니다 그들은 전문적인 감시 기능 16-18를 제공 혈액 조직 인터페이스에 위치. 이전의 연구에서는 내피 세포가 효율적으로 효과기 / 메모리 있지만 나이브 아니라 T 세포 19-25 다시 자극 할 수 있음을 입증 하였다. 따라서, 내피 세포는 T 세포 활성화, 분화, 메모리 및 공차 16,17,26 로컬 영향력 말초 조직 내의 적응성 면역 반응의 이펙터 단계에 고유 APC의 역할을하는 것으로 보인다. 크리시험 관내에서 배양 학적 때, 내피 세포는 사실상 평면 세포 표면을 형성하고 (형광 단백질 기자 예) 형질 용이하다. 이러한 기능은 세포 - 세포 상호 작용 19,27 동안 위상 역학의 높은 시공간 해상도 이미징에 이상적입니다. 따라서 내피 세포는 응답 (그림 1C) (19, 20)를 항원 인식을 운전하고 조절하는 분자 / 세포 내 리모델링 메커니즘 연구를위한 뚜렷하게 적합 생리적 &#39;평면 세포 APC&#39;모델이 될 수 있습니다. 이전 접착 및 transendothelial 마이그레이션 27시 백혈구 - 내피 상호 작용의 세부 사항을 공부 (세포막과 세포질의 형광 단백질 업체들과 내피 세포의 형질 전환 포함) 보완 이미징 기술을 설립, 백혈구가 적극적으로 동적으로 내피 세포의 표면을 검사 것으로 나타났다 삽입서브 마이크론 규모의 D 후퇴는 굴지 풍부한 원통형 돌기 (~ 직경과 깊이 200 ~ 나노 미터)는 invadosome 형 돌기 (즉, &#39;ILPs&#39;) 27, 28라고합니다. 이 촬상 방법은 상기보고 (19, 20)와 같은 T 세포 - 내피 면역 시냅스 높은 시공간 해상도의 영상화를위한 첫번째 방법을 개발하기 위해 내피 APC 기능을 활용 여기서는 더 설명하는 프로토콜들의 생성에 따라 확대되었다. 이 신규 한 평면 셀룰러 APC 모델로부터 유도 중앙 결과는 T 세포의 Ag ILPs 초기 탐지를 촉진 및 후속 시그널링을 모두 유지하는 기능을한다는 것이다. 실제로, (안정화 및 칼슘 플럭스 초기에 대응하여 발생한되었다), TCR 및 활성 신호 등 PKC-Q, ZAP-70, 포스 및 HS1의 암시 분자 쇼 농축 여러 ILPs의 배열. 따라서 ILPs는 TCR 시그널링에 마이크로 입체 생리적 등가를 나타내는 것평면 이중층 모델에서 본 클러스터. 이 방법은, 따라서 민감하게 밝혀 / 보고서 분자 및 건축 (및 생체 역학 묵시적) 역학 그렇지 않으면 감지되지. 본원에 기재된 방법은 적응성 면역 반응의 기본 메커니즘을 심문하는 능력을 향상시키기 위해 전문 APC 인공 APC 기판 모델 사이의 갭을 ​​가교에 유용 할 것이다. 여기서 포커스는 CD4 +받은 Th1 형 이펙터 / 메모리 셀의 활성화에 있지만 후술하는 바와 같이,이 기본 방법은 용이하게, T 세포 유형 및 Ag로 광범위한 연구를 수정할 수있다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer 스트레치 라텍스 무료 지혈</td>대 <td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD 알코올 면봉</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 푸시 버튼 혈액 채취 세트</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>사용 전 RT로 가져 오기</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토 마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>포도상 구균 장독소 B</td><td>독소 기술</td><td>BT202RED</td><td>PBS</td></tr><tr><td>독성 쇼크 증후군 독소</td> 1 독소 원료 용액 1mg/ml 독소 <td>기술</td><td>TT606RED</td> PBS 인간 IL-15 R&<td>의 원료 용액 1mg/ml</td></tr><tr><td></td><td>; D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>PBS의 스톡 솔루션 50ug/ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td> H20 HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo <td></td></tr><tr><td></td><td>Cells Lonza</td><td>CC-2543</td>의 스톡 솔루션 1mg/ml <td>다른 인간 미세혈관 EC를 사용할 수 있습니다(예: HLMVEC</td></tr><tr><td>EGM-2 MV 총알 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>원액 10x, PBS에 희석</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>4단계에 필요한 키트</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>원액 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>원액 1mg/ml H20</td></tr><tr><td>페놀 무함유 HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1016-100G</td><td>H20</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>208337</td><td>H20 원료 용액 1M</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>이머졸 518 F 형광 무료 침지 오일</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td> DMSO pEYFP-Mem (Mem-YFP)의 <td>재고 용액 1mM</td></tr> <tr><td></td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>독성, 흄후드</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr> 사용<tr><td>&nbsp; Falcon 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 조직 배양 처리 플라스크 T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 팔콘 조직 배양 처리 플라스크 T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 코닝 세포 배양 처리 T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>직경 12mm</td></tr><tr><td>&nbsp; Falcon 조직 배양 플레이트 24-웰</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T 플레이트</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton 일회용 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICAM1 마우스 anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 마우스 anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Class II 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC theta 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>포스포티로신 (4G10 플래티넘)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>4단계 용 전기포레이터</td></tr><tr><td>필요 Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Series 60) 생물학적 안전 캐비닛</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Forma STRCYCLE 37 &deg; C, 5% CO2 세포 배양 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Bright-Line 혈구계</td></tr><tr><td>Isotemp 수조 모델 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

적응성 면역 T 세포와 항원 제시 세포 ( &#39;장갑차&#39;) 사이의 동적 인 상호 작용에 의해 조절 &#39;면역 시냅스&#39;라 칭한다. 이러한 친밀한 세포 - 세포 인터페이스 내에서 MHC / AG-TCR, F - 굴지, 접착의 개별 하위 세포 클러스터 및 신호 분자가 형성 빠르게 개조. 이러한 역학은 중요한 효율성과 개발 면역 반응의 품질 모두의 결정 때문에 병리학 적 면역 대 보호의 것으로 생각된다. 생리적 장갑차와 면역 시냅스의 현재 이해는 얻을 수있는 영상 해상도의 무능력에 의해 제한된다. 인공 기판 모델 (예를 들면, 평면 지질 이중층)이 우수한 해상도를 제공하며 매우 유용한 도구되었을지라도, 이들은 본래 비 생리적 및 과도하게 단순화된다. 혈관과 림프 내피 세포는 &#39;반 직업의 중요한 말초 조직 (또는 기질) 구획으로 등장알 장갑차 &#39;. (전문 장갑차의 분자 기계의 대부분을 표현할)이 거의 평탄한 장갑차 세포 표면을 형성하는 독특한 특징을 갖고 (형광성 단백질 리포터로, 예) 형질 용이하다. 여기서 기본 접근법을 설명한다 신규하고 개선 된 이미징 및 항원 기본적인 시그널링 프로세스 심문 생리적 &#39;평면 셀룰러 APC 모델&#39;내피 세포 등을 구현한다.

내피 세포를 사용하고 생리적 복잡성 및 전문 장갑차의 변형성을 가진 평면 지질 이중층 모델의 해상도의 이점을 조합 한 새로운 촬상 방식은 (도 1)을 개발 하였다. (2)이 관찰] 이주 칼슘 플럭스 및 위상 역학의 예를 제공 도표 접근. 내피에 처짐의 부재 하에서, SAG 특정 CD4 +받은 Th1 림프구 빠르게 편광 확산 칼슘 플럭 싱없이 내피 표면 (도 2a)을 통해 측 방향으로 이동 (미도시). ~ 5 ~ 10 분 이내에 이러한 림프구는 내피를 통해 윤회를 시작합니다. 내피 위에 SAG로드의 존재에서, &#39;기름에 튀긴 된 계란&#39;토폴로지 대칭 확산 림프구 (즉, 30 ~ 60 분) 세포 내 칼슘 플럭스 (그림 2B, 영화 1) 유지를 개시 할들이 전시되는 시간 동안을거...

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

이 기술의 전반적인 목표는 혈관 내피 세포를 새로운 형태의 평면 항원 제시 세포 모델로 활용하여 기본적인 항원 신호 전달 과정을 조사하는 것입니다. 이 방법은 면역 시냅스 내에서 세포 소기관 및 분자 재구성 역학이 공간적, 시간적으로 어떻게 조정되는지와 같은 적응 면역 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 내피 세포가 사실상 평면적인 PC 표면을 형성한다는 점입니다.이를 통해 생리적으로 복잡하고 변형 가능한 세포 표면 환경 내에서 최적의 시공간 분해능으로 이미징이 가능합니다. 본 방법은 CD4 양성 Th1 작동 기억 T 세포의 활성화에 초점을 맞추고 있으나, 다양한 T 세포 유형의 항원 및 신호 전달 과정 연구에도 적용될 수 있습니다. 오늘 저와 Chris는 이 과정을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다. 먼저 핵 전이법(nucleofection)을 통해 일차 인간 폐 또는 피부 미세혈관 내피세포에 막 결합형 YFP와 수용성 DsRed를 공동 형질전환(co-transfect)한 후, 형질전환된 세포를 라이브 셀 이미징 배양 플레이트에 분주하는 것으로 시작하십시오.다음 날, 내피세포에서 MHC II 발현을 유도하기 위해 세포 배양 배지를 인터페론 감마가 첨가된 신선한 배지로 교체하고, 3일째 되는 날 24시간 후에 20 ng/mL의 TNF alpha로 세포를 자극합니다. 실험 시작 전, 내피세포를 세균 슈퍼항원인 포도상구균 엔테로톡신 B(staphylococcal enterotoxin B)와 독성 쇼크 증후군 독소 1(toxic shock syndrome toxin one)을 각각 1 µg/mL 농도로 첨가하여 37 °C에서 배양합니다. 배양하는 동안, 분석 대상 림프구 배양액에서 생존 세포 수를 측정하고, 2 × 10⁶개의 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.다음으로, 세포를 원심 분리하고 펠릿을 갓 준비한 버퍼 A 2 mL에 세포 덩어리가 남지 않도록 재현탁합니다. 그런 다음 T-세포 샘플에 2 µM RA two를 첨가하고 튜브 뚜껑을 닫은 후 즉시 도치 혼합하여 염료가 세포 현탁액 전체에 균일하게 분포되도록 합니다.37°C에서 30분간 배양한 후, 표지된 림프구를 원심 분리하고 20~40 µL의 신선한 버퍼 A로 세포를 부드럽지만 완전히 재현탁합니다. 라이브 이미징을 위해 현미경 시스템의 전원을 켜고 적절한 이미지 캡처 소프트웨어를 실행합니다. 자동 다채널 타임랩스 이미징을 위한 적절한 파라미터를 설정하고, 획득 간격은 10~30초, 총 소요 시간은 약 20~60분으로 설정합니다. 다음으로, 대물렌즈에 신선한 오일을 도포합니다.0.5 mL의 완충액 A가 담긴 현미경 디쉬를 가열 스테이지 어댑터에 장착하고, 미리 37 °C로 설정해 둔 어댑터의 전원을 즉시 켭니다. 2~3분간 평형을 맞춘 후, 20 µL 피펫을 사용하여 휴지기 RA 2 로딩 림프구를 장착된 현미경 디쉬 챔버에 첨가하고 명시야 이미징을 켭니다. 광경로를 접안렌즈로 선택하고 조동나사를 사용하여 대물렌즈가 현미경 디쉬 바닥에 닿게 조절합니다.그 다음 접안렌즈와 미동 나사를 사용하여 디시 바닥에 가라앉은 T 세포를 찾고, 적절한 세포가 확인되면 XY 스테이지 컨트롤을 사용하여 최소 10개의 세포가 포함된 시야를 선택합니다. 명시야에서 형광 광원으로, 그리고 IP 이미징에서 CCD 카메라로 전환합니다. 획득 파라미터를 최적화한 후, 휴지 상태의 Fira 2 3 40 및 FIRA 2 3 80 이미지를 획득합니다.성공적인 결과를 얻기 위한 핵심 단계 중 하나는 형광 획득 파라미터를 세밀하게 최적화하여 충분한 신호를 수집하고, fira two의 경우 기저 3 43 80 비율이 1에 가깝게 유지되도록 하는 것입니다. FIRA two 노출 시간이 설정되면, 일회용 전이 피펫을 사용하여 T 세포가 담긴 디시를 혈관 내피 세포가 담긴 현미경 디시로 교체하십시오. 배지를 빠르게 제거하고 미리 데워둔 buffer A 1 mL로 세포를 한 번 헹군 다음, 세척액을 신선한 buffer A 0.5 mL로 교체하십시오. 대물렌즈를 사용하여 밝게 형광을 띠는 혈관 내피 세포가 건강하게 보이는 영역을 확인하십시오. 그 다음, fira two에서 시연한 것과 동일하게 membrane YFP 및 DS RED에 대한 획득 파라미터를 조정하십시오.각 채널의 평균 형광 신호 강도가 검출기 동적 범위의 25%에서 75% 사이에 위치하도록 주의하십시오. 라이브 셀 이미징 실험을 수행하기 전, 자동화 소프트웨어를 사용하여 혈관 내피세포만 촬영한 이미지를 여러 간격으로 캡처하여 기준선을 설정합니다. 그 다음, 소량의 용액을 담은 팁을 대물렌즈 중심에 가까운 배지에 삽입합니다.농축된 fira 5 µL와 부하시킨 림프구 2개를 현미경 디쉬의 이미징 필드 중앙에 천천히 분주합니다. 림프구가 가라앉으면서, T세포와 내피세포의 접합면이 초점 평면에 유지되도록 초점을 미세하게 조정합니다. 40배 및 63배 대물렌즈 사용 시, 필드당 10~20개의 세포가 있는 것이 최적입니다.원하는 관찰 간격이 지난 후, 이미징을 계속하면서 CIN을 현미경 디시에 직접 피펫팅하여 최종 농도가 2 µM이 되도록 하여 최대 칼슘 플럭스 구체(calcium flux sphera)를 유도합니다. 세포에 처리물을 적용할 때, 면역 시냅스 리모델링의 최적 해상도를 확보하기 위해 내피세포의 YFP 표지된 정단막 표면에 정밀한 초점을 유지하도록 주의하십시오.내피세포 상에 슈퍼항원이 없는 경우, 내피 슈퍼항원 특이적 CD4 양성 TH1 림프구는 빠르게 확산하고 편향되며 내피세포 위로 측방 이동합니다. 이 과정에서 림프구는 내피 표면으로 수명이 짧은 돌기 또는 ILP를 뻗으며, 이는 슈퍼항원이 존재할 때의 발자국과 유사하게 막 YFP 형광의 고리 형태로 나타납니다. ILP에 의해 유도된 긴밀한 세포 간 접촉은 칼슘 플럭스의 개시와 연관되며, 이는 면역 시냅스 내에 안정화된 ILP가 축적되는 결과로 이어집니다. 이러한 ILP 배열은 지속적인 칼슘 신호 전달과 결합되어 있습니다.T-세포와 혈관내피세포의 상호작용 동안 형성되는 막 형광 고리는 T-세포 돌출부가 혈관내피세포의 개별적인 함입 지점을 유도하는 것과 일치하며, 이는 이러한 고리가 세포질이 변위 및 배제된 구역과 공간적 및 동역학적으로 상관관계가 있다는 증명을 통해 확인되었습니다. 슈퍼항원 존재 하에 혈관내피세포와 T-세포를 공동 배양한 지 수분 내에, 항원성 신호 전달과 관련된 접착 및 신호 전달 분자들이 면역 시냅스의 포타 프린트(pota prints)와 ILP 내에 공동 농축됩니다. 실제로 T-세포와 혈관내피세포의 면역 시냅스는 항원 인식 분자 기구가 농축되어 있으며, T-세포 ILP가 항원 제시 세포 표면으로 확장되어 점점이 배치된 뚜렷한 3차원 구조를 나타냅니다.이러한 접근 방식을 통해 기존 PC 모델의 주요 장애물을 극복할 수 있으며, 이를 통해 기존에는 감지할 수 없었던 3D 세포 내 구조와 생리적 T-세포 a PC 인터페이스의 빠른 리모델링을 관찰할 수 있습니다. 이는 항원 신호 전달 과정에 대한 새로운 수준의 이해 가능성을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

출처: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. 유전적으로 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노 관련 바이러스 라벨링을 사용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 살아있는 쥐 망막 외식식물에서 수지상 역학을 시각화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 망막을 안정화하고, 별이 터진 무축삭 중간뉴런을 시각화하기 위해 에피형광 이미징을 수행하고, 무축삭 수지상 형태의 변화를 모니터링하기 위해 타임랩스 3D 이미지를 캡처하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 외식에서 뉴런 수지상 역학의 타임랩스 컨포칼 이미징

여기에서 우리는 두 가지 색상 STED의 nanoscopy에 의해 유리에 효과적으로 요약 NK 세포의 세포 독성 면역 시냅스 이미징을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 우리는 시냅스 단백질과 세포 골격의 하위 100 nm의 분해능을 얻을 수 있습니다.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

배우세요 내피 세포를 평면 항원 제시 세포 모델로 활용하여 면역 시냅스 역학과 T 세포 활성화 메커니즘을 고해상도 이미징으로 연구하는 방법을. 이 기법은 적응 면역의 핵심 신호 과정을 탐색하는 데 활용됩니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

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