이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

이 기술의 전반적인 목표는 내피 세포를 새로운 유형의 평면 항원 제시 세포 모델로 활용하여 기본적인 항원 신호 전달 과정을 조사하는 것입니다. 이 방법은 면역학적 시냅스 내에서 세포 내 및 분자 리모델링 역학이 공간적, 시간적으로 어떻게 조정되는지와 같은 적응 면역 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 내피가 사실상 평면 형태의 PC 표면을 형성한다는 것입니다.

이를 통해 생리학적으로 복잡하고 성형 가능한 세포 표면의 맥락에서 최적의 시공간 해상도로 이미징할 수 있습니다. 이 방법은 CD 4 양성 TH 1 효과기 기억 세포 활성화에 중점을 두지만 다양한 T 세포 유형, 항원 및 신호 전달 과정에 대한 연구에도 적용될 수 있습니다. 오늘 Chris와 저는 NU 핵 애정을 통해 1차 인간 폐 또는 피부 미세혈관 내피 세포를 막 YFP와 용해성 DS red로 코드 transection하고 형질 주입된 세포를 살아있는 세포 이미징 배양 플레이트에 플레이트화하여 두 번째 Begin을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다.

다음날 세포 배양 배지를 인터페론 감마가 보충된 새로운 배지로 교체하여 내피 세포에서 M MHC 2 발현을 유도한 후, 3일 30-60분 후에 24시간 후에 밀리리터당 20나노그램의 TNF 알파로 세포를 자극합니다. 실험을 시작하기 전에 섭씨 37도에서 박테리아 초항원인 포도상구균 장독소 B와 독성 쇼크 증후군 독소 1을 각각 밀리리터당 1마이크로그램으로 내피를 배양합니다. 배양하는 동안 관심 림프구 배양액에서 생존 가능한 세포의 수를 세고 세포의 10을 두 배에서 6배로 15ml 원추형 튜브로 이동합니다.

다음으로, 세포를 스핀다운하고 세포 클러스터가 남지 않도록 새로 준비된 완충액 A 2ml에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 T 세포 샘플에 2개의 마이크로몰 RA 2를 추가하고 튜브를 덮고 즉시 균일하게 반전시킵니다. 세포 현탁액 전체에 염료를 분배합니다.

섭씨 37도에서 30분 배양 후 표지된 림프구를 스핀다운하고 20-40마이크로리터의 신선한 완충액 A에 세포를 부드럽지만 철저하게 재현탁시켜 실시간 이미지로 전환한 후 세포는 현미경 시스템을 켜고 적절한 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다. 자동화된 다중 채널 타임 랩스 이미징에 적합한 매개변수와 10-30초의 획득 간격과 약 20-60분의 총 지속 시간을 설정합니다. 다음으로 대물렌즈에 새 기름을 추가합니다.

0.5밀리리터의 버퍼 A가 들어 있는 현미경 접시를 가열에 장착합니다.tage 어댑터, 이전에 섭씨 37도로 설정된 어댑터를 즉시 켭니다. 2-3분 동안 평형을 이룬 후 20마이크로리터 피펫을 사용하여 장착된 두 개의 림프구를 장착된 현미경 접시 챔버에 넣고 명시야 이미징을 켭니다. 접안렌즈로 가는 광 경로를 선택하고 코스 초점 노브를 사용하여 대물렌즈를 현미경 접시 바닥과 접촉시킵니다.

그런 다음 접안렌즈와 미세 초점 손잡이를 사용하여 접시 바닥에 있는 T 세포를 찾고 XY를 사용합니다.tage 적절한 세포가 발견되었을 때 최소 10개의 세포가 포함된 필드를 선택하는 컨트롤을 제어합니다. 명시야에서 형광등으로, IP 이미징에서 CCD 카메라로 전환합니다. 획득 파라미터를 최적화한 다음 휴지 Fira 2, 3, 40 및 FIRA 2, 3, 80 이미지를 획득합니다.

성공적인 결과를 얻기 위한 핵심 단계 중 하나는 형광 획득 매개변수를 신중하게 최적화하여 충분한 신호가 수집되고 피라 2의 경우 기준선 3 43 80 비율이 1에 가까운지 확인하는 것입니다. FIRA 2회 노출 시간이 설정되면 일회용 전달 피펫을 사용하여 T 세포 접시를 내피 세포의 현미경 접시로 교체하고 배지를 빠르게 제거하고 1ml의 예열 완충액 A로 세포를 한 번 헹군 다음 세척을 0.5ml의 새 완충액 A로 교체합니다. 그런 다음 fira two에 대해 설명한 것처럼 멤브레인 YFP 및 DS RED에 대한 획득 매개변수를 조정합니다.

각 채널의 평균 형광 신호 강도가 검출기 동적 범위의 25%에서 75% 사이로 떨어지도록 주의하십시오. 라이브 셀 이미징 실험을 수행하기 전에 내피 세포의 이미지만 여러 간격으로 캡처하여 자동화된 소프트웨어로 기준선을 설정합니다. 그런 다음 작은 볼륨의 끝을 대물렌즈 중앙에 가까운 미디어에 삽입합니다.

5마이크로리터의 농축된 피라(fira)와 2개의 장전된 림프구를 현미경 접시 이미징 필드의 중앙으로 천천히 분배합니다. 림프구가 안정되면 T세포 내피 세포 계면이 초점면에서 유지되도록 초점을 미세하게 조정합니다. 40 및 63 x 대물렌즈의 경우 필드당 10-20개의 셀이 최적입니다.

원하는 관찰 간격이 지나면 이미징을 계속하고 즉시 CIN을 현미경 접시에 직접 피펫팅하여 최종 농도 2마이크로몰까지 하여 최대 칼슘 플럭스 스페라를 유도합니다. 두 개의 신호. 세포에 치료제를 적용할 때 면역 시냅스 리모델링의 최적 해상도를 보장하기 위해 내피의 정점 막 YFP 표지 표면에 날카로운 초점을 유지하도록 주의하십시오.

내피 초항원 특이적 CD에 초항원이 없는 경우, 4개의 양성 TH 1 림프구가 빠르게 퍼져나가고, 편광되고, 내피 세포를 통해 측면으로 이동합니다. 이 과정에서 림프구는 수명이 짧은 돌출부 또는 ILP를 내피 표면으로 확장하며, 이는 초항원이 있는 경우 발자국과 유사한 막 YFP 형광 고리로 분명하며, ILP에 의해 구동되는 세포와 세포의 밀접한 접촉은 칼슘 플럭스의 시작과 관련이 있어 면역학적 시냅스 내에 안정화된 ILP가 축적됩니다. 이러한 ILP 어레이는 지속적인 칼슘 신호전달과 결합됩니다.

T세포 내피 세포 상호작용 중에 형성되는 막 형광 고리는 내피 세포에서 별개의 침습 지점을 구동하는 T 세포 돌출부와 일치하며, 이러한 고리가 치환 및 배제된 세포질 영역과 공간적, 운동학적으로 상관관계가 있다는 입증에 의해 확인되었습니다. 초항원 부착 및 항원 신호와 관련된 신호 분자가 존재하는 상태에서 내피 세포와 T 세포의 공동 배양 후 몇 분 이내에 면역 시냅스의 포타 지문 및 ILP 내에서 농축됩니다. 실제로, T-세포 내피 면역학적 시냅스는 항원 인식 분자 메커니즘이 풍부한 항원 제시 세포 표면으로 확장되는 T-세포 ILP에 의해 강조되는 신중한 3차원 구조를 보여줍니다.

이 접근 방식을 사용하면 기존 PC 모델 내의 주요 장애물을 극복할 수 있으며, 다른 방법으로는 감지할 수 없는 3D 세포 하위 구조를 관찰하고 생리학적 T 세포 인터페이스를 빠르게 리모델링할 수 있습니다. 이는 항원 신호 전달 과정에 대한 새로운 차원의 이해를 위한 잠재력을 제공합니다.