Name: 높은 처리량 다니오 레 리오 (rerio) 에너지 지출 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 학습하세요 높은 처리량 resazurin 기반 형광 분석법을 사용하여 Danio rerio 유충의 NADH2 생산 및 대사율을 측정하는 방법을. 이 기법은 비만 연구와 약물 유전자 상호작용 스크리닝에 활용됩니다.

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저자는 이전에 발표된 이 분석법의 적용을 검증하는 데 기여한 Roger Cone 박사와 Chao Zhang 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 NIH 1F32DK082167-01(BJR)의 지원을 받았습니다.

참고 :이 프로토콜은 연구의 책임있는 행동에 대한 애리조나 오피스 대학의 지침을 다음과 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 1. Zebrafish의 사육 및 배아 유지 보수 <ol><li> E3 배아 매체 (8)를 준비합니다. 60 배 원액을 확인하기 위해, 1.95 L ddiH 2 O에서 34.8 g의 염화나트륨, 1.6 G의 KCl, 5.8의 염화칼슘 2 ● 2H 2 O, 및 9.78 g의 MgCl 2 ● 6H 2 O를 용해 ddiH 2 O를 사용하여 2 L에 볼륨을 조정 수산화 나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.2로 조정 </li><li> 1 L ddiH20 16.5 ml의 60 배 주식을 희석 1X E3 배아 매체를 준비합니다. 100 μL 1 % 메틸렌 블루를 추가합니다. </li><li> 번식 <ol><li> 하우스 남성과 여성의 무리 스톡 (7 - 만 18 개월) 별도로 생산력을 극대화한다. </li><li> 계란이 요구하기 전에 날에 전에 2 시간 - 1 떨어져 불을 켭니다. C에서 - 설정 짝짓기 (2 여성 1 남성과 1)rossing 케이지는 이전에 9를 설명했다. 그들이 어른 물고기가 개최되는 탱크 삽입의 천공 기본을 통과 계란 포식을 탈출하는 교차 케이지 할 수 있습니다. </li><li> 옵션 :. 시간 제한 번식을 위해, (모르 폴리 노 주입과 관련된 연구에 필요한 것 등), 투명한 플라스틱 디바이더로 남성과 여성의 물고기를 분리, 계란과 수정의 시간 제한 누워 결과 아침에이를 제거합니다. 연구를 들어 모르 폴리 노, 처리 당 요구 어류 배아의 수를 평가하기 위해 전력 계산을 수행한다. 효과 나 변화의 크기를 추정하지 않고, 예비 시험은 n = 8로 실행할 수있다. </li></ol></li><li> (- 150 배아 / 10cm 페트리 접시 100) 페트리 접시에 교차 케이지에서 계란을 붓고. 계란 요리의 바닥에 정착 물을 부어하도록 허용합니다. 좋은 팁 일회용 전송 피펫을 사용하여 남아있는 물을 제거합니다. 단계 1.1에서 만든 E3 배아 매체를 다시 추가합니다. </li><li> AF 확인미래 계란과 생선 전송을위한 절름발이 광택 일회용 피펫. 가위를 사용하여 0.25 ㎖의 졸업식에서 졸업 일회용 전송 피펫을 잘라. 거친 가장자리, 불꽃 폴란드어 분젠 버너를 통해 절단 팁을 제거하십시오. </li><li> 제브라 피쉬 E3 배아 매체에서 배양 접시 28.5 ○ ℃에서 후 수정 10cm에서 (DPF) 사일에 배아 물고기를 유지 두 번 매일, 불꽃이 어떤 미 수정 계란 또는 죽은 배아 (불투명 한 흰색 외관)을 제거하기 위해 일회용 전송 피펫을 졸업 닦는 사용합니다. 각각 하루에 한 번, E3 배아 매체를 교체합니다. 좋은 팁 일회용 전송 피펫을 사용하여 남아있는 액체를 제거, E3 배아 매체를 붓고, 사전 예열 (28.5 ○ C) E3 배아 매체를 다시 추가합니다. </li></ol> 2. 분석 솔루션을 준비합니다 <ol><li> 0.22 μM 필터를 이용하여 표 1. 멸균 필터 분석 용액에 의한 분석 용액을 제조 하였다. 28.5 ○ C에서 멸균 분석 솔루션을 개시 분석 따뜻한 이전물 목욕. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 전체의 % </td><td> 볼륨 (μL / 10 mL) 중 </td></tr><tr><td> 60 배 E3 배아 중간 </td><td> 1.667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> 두 번 탈 (DDI) H 2 0 </td><td> 96.233 </td><td> 9623.3 </td></tr><tr><td> 하는, Alamar 블루 </td><td> 1 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 400 밀리미터의 NaOH </td><td> 1 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> (10) </td></tr></tbody></table> 표 1. 분석 중간 3. 분석을 수행 <ol><li> 제브라 피쉬 배아를 멸균 여과 E3 배아 매체로 3 회 씻어. 비커에 클러치에서 모든 가능한 제브라 피쉬 배아를 결합합니다. 멸균 필터 75 ml의 E3 배아 매체. , 좋은 팁 일회용 전송 피펫을 다시 사용가능한 한 제브라 피쉬 배아에서 E3 배아 매체의 많은 이동합니다. 20 ㎖를 멸균 여과 E3 배아 매체를 다시 추가합니다. 제거하고 E3 배아 매체 3 회를 교체합니다. </li><li> 96 웰 블랙 93 우물의 각으로 플레이트 (1) 물고기는 분명 바닥 판을 양면. 불꽃이 플라스틱 일회용 전송 피펫을 졸업 닦는 내에서 개별적으로 (1.5 단계) 배아를 캡처하고 부드럽게 우물에 배출하여 판에 배아 물고기를 전송합니다. 3 빈 우물에 씻어서 물고기가 들어있는 비커에서 가져온 E3 배아 매체를 전송합니다. 이 빈 우물이 물고기가 들어있는 우물로 동일한 물에 노출되어 있는지 확인합니다. 물고기와 빈 우물을 포함 모두 우물이 단계의 결론에 (200 μL) 적어도 ½ 가득합니다. </li><li> 빈 우물을 포함하여 모든 96 우물에서 분석 솔루션 E3 배아 매체를 교체합니다. 이 단계는 96 웰 플레이트에서 12 열마다 한 번에 한 열을 수행한다. 좋은 팁을 사용하여 일회용 트랜스FER 피펫은, 플레이트 (8 우물)의 하나의 컬럼에있는 모든 우물에서 E3 배아 매체를 제거합니다. 제브라 피쉬 배아를 터치하지 않도록주의하십시오. 물이 제거 잘되는 각 분석 솔루션의 300 μl를 추가합니다. 판의 모든 12 열에 대한 분석 솔루션 E3 배아 매체 및 교체의 제거를 반복합니다. </li><li> 옵션 : 화합물에 대한 응답으로 신진 대사 속도의 변화를 테스트하려면, 100 배 (100 배) 원하는 치료 농도 인 솔루션을합니다. 참고로, 100 × 용액을 0.1 % 이하로 더욱 최종 DMSO 농도를 제한하기 위해 10 %의 DMSO를 초과하지 않는 것을 보장한다. 처리 웰 각각 100X 용액 3 μL를 추가한다. 주 : 치료 우물의 수를 평가하기 위해 전력 계산을 수행합니다. 그러나, 응답 또는 변화의 크기를 추정하지 않고, 예비 시험은 치료 8 화합물 및 물고기를 포함 8 차량 처리 제어 우물에서 실행할 수 있습니다. <ol><li> (제어 할 DRU를 차량 제어의 3 μl를 추가하지G 처리) 물고기를 포함 우물. 화합물에 형광 응답이 물고기 내 행동의 결과인지 확인하기 위해, 96 웰 플레이트에 3 빈 우물에 약물 및 차량 치료를 적용 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 590 nm에서 530 nm의 여기 파장과 방출 파장 형광 플레이트 리더에 물고기 충전 판을 읽어보십시오. </li><li> 가습 인큐베이터에 배치 할 판은 28.5 ○ C (분석 솔루션의 광표백을 방지하기 위해 분석을 통해 어둠 속에서 판을 유지)으로 설정. 분석은 1 시간에서 24 시간까지 다양 시간의 기간에 대해 실행할 수 있습니다. 시험 기간은 연구의 목적에 따라 달라진다. 짧은 기간이 가장 적합 할 수있는 속효성 비 안정적인 화합물에 대한 응답을 테스트하기 위해. 그러나, 안정한 화합물 시험 또는 유전 효과 시험을위한 시험 시간을 최대화 누적 신호와 관련된 장점을 활용하는 것이 바람직하다. </li><li> 미리 정해진 시점에서 (타이밍을 결정하는 데 도움이 3.6 단계 참조)단계 3.5과 동일한 설정으로 다시 물고기 가득한 판의 형광을 읽어 보시기 바랍니다. </li></ol> 4. 치료와 형광 연합의 상대적인 변화를 평가 <ol><li> 잘 연구의 결론에 형광에서 시간 0 형광을 빼서 각각의 형광의 변화를 계산합니다. 물고기 (공백)없이 웰스는 물고기를 포함 우물에서 멀리 값 이하로, 0 근처의 값을 가져야한다. 결론에 형광 = 형광의 변화 - 형광을 시간 0 </li><li> 대조군 웰은 다음 대조군 웰의 형광의 평균 변화에 의해 각 웰의 형광 변화를 나눔 형광의 상대적인 변화를 확인하기 위하여, 형광의 평균 변화를 계산한다. 참고로, 컨트롤은 차량 컨트롤이나 유전자 제어 될 수있다. <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

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</ol>

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세균이나 곰팡이에 오염은 크게이 분석의 응용 프로그램을 제한합니다. E3 배아 매체 메틸렌 블루는 진균의 오염의 가능성을 제한한다. 배아 동안은 치료를 두 번 매일 죽은 태아를 제거하기 위해 수행하는 것이 중요 양육. 또한, 철저히 분석 개시 당일 멸균 E3 배아 매체 배아 린스하는 것이 필수적이다. 이러한 2 단계의 배아 박테리아 오염에 대한 잠재 성을 제한한다. 단계 3.2에서 설명한 빈 우물의 포함은 세균 오염의 검출을 할 수 있습니다. 측정 신호를 얻을 세균 오염은 드물다. 빈 우물 강력한 신호를 표시 할 경우, 분석은 배아의 청결을 유지하는 데 걸리는주의 반복해야합니다. 사용자가 오염 배아 수집하기 전에 발생하는 것을 기대하는 경우 이전 (P. 22) 10 설명 된 바와 같이, 배아는 표백 할 수있다. 또는, 실험자는 의심한다면오염은 사용자가 4 DPF (p. 23) (10)에 후방으로 페니실린과 스트렙토 마이신 배아 E2를 사용할 수 수집 이후에 발생된다. <p clas...

마우스는 현재 비만 연구를위한 지배적 인 모델이다. 짧은 세대 간격과 마우스에서 사용할 수있는 유전 적 도구는 현재까지 타의 추종을 불허하고있다. 그러나, 제브라 피쉬는 짧은 세대 간격이 (3-4개월를) 및 유전자 조작 1, 2의 용이성에서도 마우스를 능가한다. 먼 유전자 의약품 스크린 (3)에 사용하고 잠재적 자손의 수에 마우스를 초과하면서 지브라 피쉬는 포유 동물 유전자의 약 90 %를 유지한다. 비만 연구를위한 모델 지브라 피쉬의 전위 수돗물, 분석은 에너지 소비를 포함하여 체중 조절을, 영향 요인을 조사하기 위해 개발되어야한다. 대사 물질이 β 산화 및 트리 카르 복실 산 사이클의 산소를 통해 처리 될 때 소모되므로 NADH 2가 생성된다. 따라서, NADH 2는 대사 경로 (대사 산화)를 통해 대사 플럭스의 직접적인 지표이다. poikil에서homeotherms 4에 비해 5 배 낮은 - otherms, H는 +, ATP 합성에서 NADH 2 산화를 분리됩니다 4 미토콘드리아 내막을 통해 누출. 따라서, 제브라 피쉬 NADH 2는 매우 밀접하게 산화 적 인산화를 통해 ATP 생산에 연결되어 있습니다. 여기서, 우리는 에너지 소비 5 프록시로 애벌레 제브라 피쉬에서 NADH 2 생산을 측정하는 분석에 대해 설명합니다. 산소 소비는 에너지 소비를 측정하기위한 금 표준이다. 그러나, 가장 제브라 피쉬의 높은 처리량 잠재력을 활용하기 위해, 에너지 소비의 분석은 높은 처리량 의무가 있어야합니다. 순환 시스템 밀폐 챔버에 의존 산소 소비 시스템은 6 가능한 챔버들의 수로 처리량 제한된다. 야외 O (2) 소비는 / CO 2 생산 분석은 제브라 피쉬 5,7에 적용되었습니다. 이러한 야외 96 웰 플레이트베이스D 시스템은 높은 처리량 의무가 있습니다. 불행하게도, 환경과 가스 교환이 분석의 감도를 제한한다. 최근 우리는 레 독스 표시기 5 알라 마르 블루를 사용한 NADH 2를 모니터링 분석의 어플리케이션을 출판. 이 분석은 처리량 및 지브라 피쉬의 산소 소비량의 분석에 공통 감도 한계를 극복한다. 제브라 피쉬는 몸 전체의 에너지 항상성의 연구에 점점 더 중요한 모델이되고있다. 부분적으로, 제브라 피쉬 때문에 앞으로 유전 화면과 약물 화면에서 사용하는 의무가 있습니다. 또한, 최저 및 녹아웃에 신속하게 적용 할 수 있습니다 포함하여, 유전자 조작을 대상으로. 우리는 이전에이 분석은 화합물의 대사 속도를 변경할 5 유전자를 동정하기 위해 약물 목욕 애플리케이션 유전자 녹다운 또는 녹아웃과 조합 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 또한,이 분석은 제브라 피쉬에 내재 된 높은 처리량의 이점을 활용할 수 있도록 설계되었습니다. </P&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>제조 Fine Tip DisposableTransfer</td><td>Pipette Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Thermo Scientific</td></tr> 제조 <tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Thermo Scientific 제조</td></tr><tr><td>검은색 양면 투명 바닥 96-웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>E&에서 제조; K 사이언티픽 프로덕츠</td></tr></tbody></table>

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

제브라 피쉬는 에너지 항상성 및 비만의 연구에 널리 적용 모델 만들 수있는 잠재력을 가지고 고유 이점 중요한 모델 생물이다. 배아에 대한 분석은 96 또는 384 웰 플레이트 형식으로 실시하는 제브라 피쉬의 작은 크기가 있습니다, 모르 폴리 노 및 CRISPR 기반 기술이 목욕 응용 프로그램에 의해 유전자 조작의 용이성 및 약물 치료를 촉진이 가능한 것입니다. 또한, 제브라 피쉬는 새로운 유전자 발견을 가능하게 앞으로 유전 화면에 이상적입니다. 비만 모델 지브라 피쉬의 상대적인 신규성을 고려할 때 이러한 장점을 충분히 활용 도구 개발하는 것이 필요하다. 여기서, 우리는 동시에 배아 지브라 피쉬 수천에서 에너지 소비를 측정하는 방법을 설명한다. 우리는 개별 물고기를 분리 96- 웰 플레이트를 사용하는 전체 동물 마이크로 플랫폼을 개발하고 우리는 시판되는 세포 배양 생존력 재를 사용하여 누적 NADH 2 생산을 평가에이전트 알라 마르 블루. poikilotherms 2에서 NADH의 생산 및 에너지 소비 간의 관계 단단히 연결되어있다. 이 에너지 소모 분석 급속 직접 에너지 소비를 변경 또는 응용 약물 (예, 인슐린 감작 제)에 대한 응답을 변경 또는 약리 유전 조작 화면까지의 전위를 생성한다.

분석 액 어류 배아 (도 1)의 부재 하에서 형광을 증가시키지 않는다. 그러나, 분석은 잘 내 신진 대사 속도의 작은 변화에 매우 민감하다. 잘 내에서 하나의 물고기는 1 시간 (P &lt;0.0001) 내 빈 우물에서 유의 한 차이 신호를 생성한다. (2) 배양 24 시간 후 배아 물고기에 의해 생성 된 신호의 시각적 표현을 제공한다 그림. 이 사진의 목적을 위해 투명한 양면 웰을 사용 하였다. 그러나, 블랙 양면 웰 인근 웰에서 형광 신호의 침출을 방지하기 위해 분석 성능에 바람직하다. 알라 마르 블루 NADH 2 유도 환원 비 가역적이기 때문에, 신호는 시간에 따라 축적한다. 작은 변화가 증폭되게한다. 차이가 누적되므로 시간이 증가 할 것을 보여주기 위해, 우리는 상대적으로, 1에서 5 물고기 1 (2)를 유도 형광의 변화, 그리고 4 시간을 (모니터링그림 3)...

제브라피쉬는 에너지 항상성 연구를 위한 중요한 모델 유기체입니다. NADH2 민감성 산화 환원 지표인 alamar Blue를 활용하여 제브라피시 유충의 대사 속도를 96웰 플레이트 형식으로 측정하고 약물 또는 유전자 발견에 적용할 수 있는 분석을 개발했습니다.

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

이 고처리량 레사주린(resazurin) 기반 형광 분석법의 전반적인 목표는 대사율의 척도인 NADH2 생성에 미치는 유전적 또는 약리학적 조작의 영향을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 특정 약물이나 유전자가 대사율에 미치는 영향과 같이 비만 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 분석법은 전신 동물 시스템에서 잠재적인 약물-약물 또는 약물-유전자 상호작용을 스크리닝하는 데 적용될 수 있습니다.산소 소비 분석법과 비교했을 때 이 분석법의 주요 장점은 높은 처리량과 시간에 따른 신호의 누적이며, 이를 통해 사용자는 대사율의 미세한 차이를 검출할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Caroline Foy가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 E3 배지의 60X 스톡 용액을 준비한 후, 스톡 용액 16.5 milliliters와 이중 증류수 1 liter를 희석하여 1X E3 배지를 준비하십시오.그런 다음 1% methylene blue 100 µL를 첨가합니다. 알과 물고기 이동을 위한 화염 연마 처리된 일회용 피펫을 만들려면, 가위로 눈금 일회용 전이 피펫의 0.25 mL 눈금 지점을 자릅니다. 그런 다음 거친 단면을 제거하기 위해 분젠 버너를 사용하여 자른 팁 끝부분을 화염 연마합니다.제브라피쉬 교배를 설정하고 알을 수집한 후, 알이 접시 바닥에 가라앉을 때까지 기다렸다가 물을 따라냅니다. 미세 팁 일회용 전이 피펫을 사용하여 남아 있는 물을 모두 제거합니다. 그런 다음 E3 배지를 다시 넣습니다.수정 후 4일(DPF)까지 배아 물고기를 28.5 °C에서 배양하십시오. 하루에 두 번, 화염 연마된 눈금 표시 일회용 전이 피펫을 사용하여 수정되지 않은 알이나 죽은 배아를 제거하십시오. 그 후 하루에 한 번 E3 배지를 따라내어 교체하십시오.끝이 가는 트랜스퍼 피펫을 사용하여 남은 배지를 모두 제거하고, 28.5 °C로 예열된 신선한 E3 배지로 교체합니다. 에너지 소비 분석을 수행하려면 다음 표에 따라 분석 용액을 준비하십시오. 0.22 µm 필터를 사용하여 용액을 여과 멸균하고, 분석을 위해 항온수조에서 28.5 °C로 가온합니다.페트리 접시에 한 클러치에서 얻은 생존 가능한 모든 제브라피시 배아를 모읍니다. 75 milliliters의 E3 배지를 여과 멸균한 후, 미세 팁 일회용 전이 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 E3 배지를 가능한 한 많이 제거합니다. 멸균된 E3 20 milliliters를 다시 추가합니다. 그 다음, 멸균된 E3를 두 번 더 제거하고 교체합니다.다음으로, 화염 연마된 눈금付き 플라스틱 일회용 전이 피펫을 사용하여 개별 배아 물고기를 96-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트의 한 열씩 작업하며, 전이 피펫이 배아에 닿지 않도록 주의하면서 첫 번째 열의 8개 웰에서 E3 배지를 제거합니다. 그 후 각 웰에 300 µL의 분석 용액을 첨가합니다.플레이트의 12개 컬럼 모두에 대해 위 과정을 반복합니다. 약물 처리를 포함하려면, 원하는 화합물의 100X 용액을 준비한 후 각 처리 웰에 3 µL씩 첨가합니다. 그 다음, 대조군 물고기가 있는 대조 웰에는 용매 대조군(vehicle control) 3 µL를 첨가합니다.화합물에 대한 형광 반응이 물고기 내의 활성 결과임을 확인하기 위해, 96-웰 플레이트의 공백 웰 3개씩에 약물 처리군과 용매 처리군을 설정합니다. 이제 들뜸 및 방출 파장이 각각 530 nm와 590 nm인 형광 플레이트 리더기를 사용하여 물고기 플레이트의 웰을 측정합니다. 플레이트를 28.5 °C의 가습 인큐베이터에 넣습니다.분석 방법과 테스트 대상 화합물의 안정성에 따라, 미리 정해진 시점에 형광을 다시 측정합니다. 형광의 상대적 변화를 평가하려면, 대조군 웰(well)의 평균 형광 변화량을 계산합니다. 그런 다음 각 웰의 형광 변화량을 대조군 웰의 평균 형광 변화량으로 나눕니다.다음은 96-웰 플레이트의 두 열을 사용하는 예시입니다. A열 웰에는 vehicle 처리된 대조군 제브라피시가 포함되어 있으며, B열 웰에는 인슐린 처리된 제브라피시가 포함되어 있습니다. 표 A에는 0시점에 측정된 형광 값이 나타나 있습니다.표 B에는 24시간 후에 측정된 형광 값이 포함되어 있습니다. 표 C에서는 형광 변화를 평가하기 위해 24시간 시점의 형광 값에서 0시간 시점의 형광 값을 뺐습니다. 다음으로, 대조군 웰의 평균 형광 변화량을 계산하십시오.표 D는 각 개별 웰의 형광 변화량을 대조군 웰의 평균 변화량으로 나눈 값입니다. 여기서 10 µM의 인슐린 처리가 24시간 동안 제브라피시가 생성한 신호를 2.77배 증가시켰으며, P 값은 0.0001 미만임을 확인할 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 배아가 없는 경우에는 분석 용액의 색상이나 절대 형광 수준이 변하지 않습니다.하지만, 이 분석법은 웰 내부의 대사율의 미세한 변화에 매우 민감합니다. 이 그림은 24시간 동안 배양한 틸라피아 배아에서 생성된 신호를 나타냅니다. 분홍색 웰은 대사율이 높은 물고기를 나타냅니다.보라색 웰은 중간 정도의 대사율을 가진 물고기를 포함하며, 파란색 웰은 낮은 대사율을 나타냅니다. 이는 본 분석법의 다재다능함과 다양한 경골어류 종에 대한 적용 가능성을 보여줍니다. NADH2에 의해 유도된 alamar blue의 환원은 비가역적이므로, 신호가 시간이 지남에 따라 축적되어 미세한 변화를 증폭시킬 수 있습니다.여기에 1, 2, 4시간 시점에서 1마리에서 5마리의 물고기에 의해 유도된 형광의 상대적 변화가 제시되어 있습니다. 물고기의 수가 증가할 때마다 형광의 상대적 변화는 시간에 따라 유의미하게 증가하며, 물고기의 수가 많을수록 시간에 따른 형광 변화의 크기도 더 커집니다. 이 기술을 숙달하면 하루에 최대 5,000마리의 배아 물고기를 대상으로 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 배아 물고기가 다치지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 분석을 마친 후, 중성 지질의 Nile red 측정이나 fluorassay로 라벨링된 짚신벌레의 섭취를 통한 포식 충동 측정과 같은 다른 절차를 수행할 수 있습니다. 이를 통해 대사율과 지질 대사의 관계, 또는 대사율과 포식 충동 사이의 관계를 비교할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 에너지 대사 및 대사성 질환 분야의 연구자들은 처리량의 제한 없이 제브라피쉬의 에너지 소비량을 연구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 형광 시약인 resazurin을 사용하여 제브라피쉬의 NADH2 생성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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생물학

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Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

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